用于增强神经化学检测的金纳米粒子改性碳纤维微电极

摘要

在这项研究中,我们用金纳米粒子修改碳纤维微电极,以提高神经递质检测的灵敏度。

摘要

30多年来,碳纤维微电极(CFMEs)一直是神经递质检测的标准。通常,碳纤维被吸进玻璃毛细血管,拉到细锥体,然后用环氧树脂密封,以创建用于快速扫描循环伏特测量测试的电极材料。不过,使用裸粮和公司有几个限制。首先,碳纤维主要含有基平面碳,其表面积相对较低,灵敏度低于其他纳米材料。此外,石墨碳受其时间分辨率和相对较低的导电性的限制。最后,已知神经化学和大分子在碳电极表面结垢,形成非导电聚合物,阻止进一步的神经递质吸附。在这项研究中,我们用金纳米粒子修改CFME,通过快速扫描循环伏特测量来增强神经化学测试。Au³⁺是从胶体溶液电镀或浸渍到CFM表面的。由于黄金是一种稳定且相对惰性的金属,是神经化学分析测量的理想电极材料。金纳米粒子改性(AuNP-CFMEs)对多巴胺反应的稳定性超过4小时。此外,AuNP-CFME 表现出比未改性 CFM 更高的灵敏度(循环伏象图的峰值氧化电流)和更快的电子转移动力学(较低 +_EP或峰值分离)。AuNP-CFMEs 的发展为在检测的较低限度下检测多巴胺浓度和其他神经化学品的快速变化提供了新型电化学传感器的创建。这项工作在增强神经化学测量方面有着巨大的应用。金纳米粒子改性CFM的产生对于开发新型电极传感器以检测啮齿动物体内的神经递质至关重要,研究药物滥用、抑郁、中风、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺血、缺和其他行为和疾病状态。

引言

碳纤维微电极(CFMEs)1最好用作生物传感器,用于检测几个关键神经递质2的氧化,包括多巴胺3、去甲肾上腺素4、血清素5、腺苷6、组胺7,和其他人8。碳纤维的生物相容性和尺寸使它们最适合植入,因为与较大的标准电极相比,可减轻组织损伤。⁹ CME 已知具有有用的电化学特性,并且能够快速测量时使用快速电化学技术,最常见的快速扫描循环伏特测量 (FSCV)^10,11。FSCV是一种技术,扫描应用电位快速,并提供特定的循环伏象图的特定分析物12,13。快速扫描产生的大充电电流在碳纤维上稳定,可以背景减去以产生特定的环伏图。

由于其最优的电化学和神经生物学的重要性,多巴胺得到了广泛的研究。儿茶酚胺多巴胺是一种重要的化学信使,在神经系统内的运动、记忆、认知和情绪控制中起着关键作用。多巴胺的过剩或缺乏会导致许多神经和心理干扰;其中包括帕金森病、精神分裂症和成瘾行为。今天,帕金森病仍然是一种普遍的疾病,由于参与多巴胺合成的中脑神经元的^退化14。帕金森病的症状包括震颤、运动缓慢、僵硬和保持平衡的问题。另一方面,^可卡因15和安非他明16、17等兴奋剂促进了多巴胺的溢出。药物滥用最终取代多巴胺的常规流动,使大脑需要多巴胺过剩,最终导致成瘾行为。

近年来,在神经递质检测18中,一直强调提高电极功能。提高电极灵敏度的最广泛方法是涂覆纤维表面。令人惊讶的是,对金属纳米粒子电极位置对碳纤维的研究^有限。黄金等金属纳米粒子,可与其他功能材料一起电沉积在纤维^表面20。例如,增加神经递质吸附的电活性表面积。电沉积金属纳米颗粒形成迅速,可纯化,并附着在碳纤维上。电化学对于贵金属纳米粒子的沉积和碳纤维的表面增强仍然具有重要意义,因为它能够控制这些纳米粒子的成核和生长。最后,增加的催化和导电特性,以及改进的大众运输是利用金属纳米粒子进行电分析的其他优势。

美国大学高级实验室序列课程(实验生物化学I和II CHEM 471/671-472/672)是分析、物理和生物化学实验室的组合。第一学期是实验室技术概述。第二学期是一个学生驱动和主导的^{研究项目21。}对于这些项目,学生以前曾研究过生物分子、蛋白质、肽和氨基酸促进合成金纳米粒子22、23的机制。最近的工作侧重于在电极表面上形成金纳米粒子(AuNP)生产,以及评估AuNPs对CFM检测神经递质的能力的影响。在目前的工作中,实验室应用了该技术来证明CFM在检测多巴胺氧化方面的灵敏度是通过AuNP在纤维表面的电镀来增强的。每个裸CFME的特点是在检测多巴胺氧化电流以测量CFME表面多巴胺氧化时,扫描速率、稳定性和多巴胺浓度各不相同。然后,Au³⁺被电化为 Au 0,同时电沉积到光纤表面作为纳米粒子,然后进行一系列表征实验。经过直接比较,发现AuNP-CFM具有较高的多巴胺检测灵敏度。AuNP通过电极定位均匀涂覆到纤维表面,使电活性表面积更高;从而增加多巴胺在改性电极表面的吸附。这导致更高的多巴胺氧化电流。AuNP-CFME多巴胺氧化和还原峰(+E_p)的潜在分离也较小,表明电子转移动力学更快。这项研究的未来工作包括对裸和AuNP-CFME进行体内测试,以检测多巴胺。

研究方案

1. 碳纤维微电极的建造

1. 碳纤维的制备
   1. 要创建碳纤维微电极,首先使用手、手套和铲子逐一分离碳纤维(碳纤维,直径 7 mm)。
   2. 从扭曲的纱线中拉出或拉一根纤维。
   3. 将分离的碳纤维吸入玻璃毛细管(单桶硼硅酸盐毛细管玻璃,无微丝,外径 1.2 mm,内径 0.68 mm)。
   4. 通过切割一块长约 10 厘米 x 25 厘米宽的纸板,为电极创建电极支架。
2. 使用垂直毛细管拉拔器拉动电极。
3. 打开垂直毛细管拉拔器的滑动门。
4. 通过逆时针旋转钻头,并有足够的空间插入玻璃毛细管,松开并拆下金属支架杆。
5. 将玻璃毛细管插入电极支架。手动将玻璃毛细管举到垂直毛细管的顶部。
6. 顺时针用钻头拧紧玻璃毛细管,而不会打碎或打碎玻璃毛细血管。
7. 调整加热器 1、加热器 2 和磁铁设置,以便制造商建议将玻璃毛细管拉到电极材料的精细片中。
8. 按下红色启动按钮加热盘绕线圈,通过压力、重力和加热来拉动电极。
9. 让盘绕线圈从红色热状态冷却。用剪刀将两个拉电极从上到下连接起来,切割碳纤维。使用钻夹方法沿逆时针方向旋转,将玻璃毛细管从垂直毛细管拉拔器上拆下。

2. 碳纤维微电极制备

1. 在立体镜或显微镜下,用手术剪刀或锋利的剃刀刀片将玻璃毛细管表面伸出的碳纤维切割至约100~150 μm的长度。
2. 将 10 克环氧树脂与 0.2 mL 的硬化剂混合在 25 mL 小瓶中,使用棉签制备环氧树脂溶液。
3. 仅将每个电极的尖端浸入环氧树脂和硬化剂溶液中约 15 s。
4. 将上述碳纤维微电极顶部浸入丙酮中约 3 s,以洗去碳纤维微电极桶中多余的环氧树脂。

3. 电镀

1. 将工作电极(碳纤维微电极)放在0.5 mM HAuCl₄溶液中,以及使用微操作器的氯化银(Ag/AgCl)。
2. 将工作电极和参考电极连接到电位和头级。
3. 打开 UNC HDCV 软件。更改软件上的设置以应用波形。在计算机设置中输入以下波形:在包含 0.5 mM HAuCl₄的 0.1 M KCl 溶液中扫描 0.2 V 至 +1.0 V,扫描速率为 50 mV/s,10 个周期。按绿色箭头应用波形。然后,按开始按钮开始记录测量值。

4. 扫描电子显微镜

注:使用扫描电子显微镜仪器(SEM)对光和金纳米粒子改性碳纤维微电极。将样品加载到黑色导电胶带上,并按照制造商的说明进行操作。

1. 打开仪器
   1. 转动启动和释放的密钥。
   2. 通过双击打开 InTouchScope 软件。
   3. 释放密钥。它应该自己降落在I符号上。
   4. 等待 EVAC 按钮停止闪烁。
   5. EVAC 按钮停止闪烁后,按 VENT 按钮。
   6. 等待 VENT 按钮停止闪烁。
   7. 确保工作距离 (WD) 为 20 mm = 30 mm。
   8. 等待时,准备示例。
2. 扫描
   1. 一旦 VENT 按钮停止闪烁,将样品加载到仪器中。
   2. 在装载样品时,确保样品架的弯曲部分指向仪器。
   3. 加载样品后,按 EVAC 按钮。
   4. 将工作距离调整到 10 mm。
   5. EVAC 按钮停止闪烁后,打开计算机。
   6. 单击桌面上的触控范围软件。有两个触摸范围软件,点击一个没有绿色和黄色圆圈。
   7. 打开软件后,单击 OBSERVE(屏幕右上角)可打开光束。在单击 OBSERVE 之前,确保 EVAC 按钮已停止闪烁。
   8. 开始分析样本。
   9. 确保电压、工作距离 (WD) 和探头电流 (PC) 设置为可接受。
   10. 缩小 (+50X) 以进行更高的设置,放大较低的设置。
   11. 将工作距离设置为 10 mm。
   12. 在拍摄示例图片之前,请确保图片将保存到所需的目标文件夹中。
   13. 要选择所需的文件夹,请单击设置(屏幕左上角)。
   14. 通过闪存驱动器从计算机导出图片。
3. 关闭
   1. 单击 OBSERVE 可关闭光束。
   2. 按下 VENT 按钮并等待其停止闪烁。
   3. 在等待 VENT 按钮停止闪烁时,将工作距离调整回 20 mm = 30 mm。
   4. 一旦 VENT 按钮停止闪烁,从仪器上卸载样品。
   5. 按下 EVAC 按钮,等待其停止闪烁。
   6. EVAC 按钮停止闪烁后,退出软件并关闭计算机。
   7. 转动O符号的钥匙以完全关闭仪器。

5. 快速扫描循环伏特测量测试

1. 将碳纤维微电极与 Ag/AgCl 参考电极一起连接到电位和头级。
2. 使用微操作器,通过手动调整 X、Y 和 Z 测量旋钮,将碳纤维微电极降至流单元中。
3. 在 DI 水中制备缓冲液(131.5 mM NaCl,3.25 mM KCl,1.2mM CaCl 2,1.25 mM NaH₂PO_4,1.2 mM MgCl_2,和 2.0 mM Na₂SO_4,pH值调整为 7.4)。
4. 用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 缓冲液 (pH = 7.4) 填充流动细胞。
5. 使用填充的 60 mL 缓冲注射器,以大约 1 mL/min 的速度将 PBS 缓冲液注入流细胞。
6. 将电极放入流动单元,按绿色按钮应用波形。观察示波器并切割电极或调整增益以防止过载。在每个电极运行之间留出大约 10 分钟的平衡。
7. 将默认波形设置为多巴胺波形。在 10 Hz 和 400 V/s 下扫描从 + 0.4 V 到 1.3 V。
8. 在上氯酸中制备10mM多巴胺、血清素、去甲肾上腺素等的库存溶液。将神经化学物质稀释至缓冲液中最终浓度为1μM,使用移液器在10 mL的PBS缓冲液中移液1μM的多巴胺溶液。
9. 要开始测量,请按记录按钮。10 s 后,将 0.2 mL 的 1 μM 多巴胺注射到流动细胞或任何其他神经递质浓度中。相应地调整浓度、扫描速率、波形(保持电位或开关电位)。将总运行时间设置为 30 s。
10. 使用 HDCV 分析软件分析运行情况。根据需要更改参数。
11. 实验完成后,通过注入3 mL的水,然后将空气注入流动单元的缓冲器和喷射口,分别清洗流量单元三次。
12. 关闭波形和仪器。

结果

在图1中,我们显示了一个原理图,其中FSCV测试用于测量体外神经递质的浓度。图 1显示了应用的多巴胺波形。三角形波形扫描从 -0.4 V 到 1.3 V 在 400 V/s。在图的左侧的第二部分,它显示多巴胺氧化多巴胺-正射奎酮(DOQ),从麻醉剂表面到电极表面的两个电子转移过程。最后,当前与时间图的叠加与颜色图叠加。当前与时间图是多巴胺氧?...

讨论

在这项研究中,我们演示了一种利用快速扫描循环伏位测量来检测神经递质(如多巴胺)的金纳米粒子改性碳纤维微电极的新方法。该方法是提高生物分子检测灵敏度的一种高效、绿色、相对廉价的方法。沉积在碳纤维表面的金的厚度可以通过电镀时间和电极液中黄金的浓度加以控制。除更快的电子转移动力学外,金改用碳纤维微电极的电活性表面积明显高于裸电极。与裸露的未改性电极材料相比,它?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dopamine hydrochloride	Sigma Aldrich	H8502-5G
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	P5493-1L
Pine WaveNeuro Potentiostat	Pine Instruments	NEC-WN-BASIC	This orders comes in bulk with all other accessories such as headstages, adapters, cords, and other electronics
Pine Flow Cell and Micromanipulator	Pine Instruments	NEC-FLOW-1	This is also another bulk order including the micromanipulator, flow cell, knobs, tubing, connectors, etc.
Glass-Capillary	A-M Systems	602500
T-650 Carbon Fiber	Goodfellow	C 005711
Epon 828 Epoxy	Miller-Stephenson	EPON 828 TDS
Diethelynetriamine	Sigma Aldrich	D93856-5ML
Gold (III) chloride	Sigma Aldrich	254169	Comes as either HAuCl4 or AuCl3
pH meter	Fisher	S90528
Farraday Cage	AMETEK TMC	81-334-03
Syringe Pump	NEW ERA PUMP	NE-1000
Eppendorf Pipettes and Tips	Eppendorf	2231000222	This is also a bulk order containing multiple pipettes and tips
10 -1,000 mL beakers	VWR	10536-390
Carbon fiber	Goodfellow	C 005711
SEM	JEOL	JSM-IT100