גולד ננו-חלקיק שונה סיבי פחמן מיקרואלקטרודות לגילוי משופר נוירוכימי

Summary

במחקר זה, אנו משנים פחמן סיבים מיקרואלקטרודות עם חלקיקי זהב כדי לשפר את הרגישות של זיהוי נוירוטרנסמיטר.

Abstract

במשך 30 שנים, סיבי פחמן מיקרואלקטרודות (CFMEs) כבר תקן זיהוי נוירוטרנסמיטר. בדרך כלל, סיבי פחמן מואבקים לתוך נימים זכוכית, משכה להתחדד, ולאחר מכן אטום באמצעות אפוקסי כדי ליצור חומרים אלקטרודה המשמשים לסריקה מהירה מחזורית בדיקות וולטממטריה. לשימוש CFMEs חשופים יש מספר מגבלות, למרות. בראש ובראשונה, סיבי הפחמן מכיל בעיקר פחמן המטוס בסיס, אשר יש שטח בשטח נמוך יחסית ותשואות רגישויות נמוכות יותר nanחומרים אחרים. יתר על כן, פחמן graphitic מוגבל על ידי הרזולוציה הטמפורלית שלה, ואת מוליכות נמוכה יחסית. לבסוף, נוירוכימיקלים וקרו ידועים לרעה על פני השטח של אלקטרודות פחמן שבו הם יוצרים חומרים פולימרים שאינם מוליך לחסום את הספיחה מוליך עצבי נוסף. עבור מחקר זה, אנו משנים CFMEs עם חלקיקי זהב כדי לשפר את בדיקות נוירוכימיות עם סריקת מחזורי וולטממטריה במהירות. Au^{3 +} הופקד על פני השטח של cfmes או שהיה מצופה בחשמל מתוך תמיסה קולאידית. מכיוון שהזהב הוא מתכת יציבה ויחסית, הוא חומר האלקטרודה האידיאלי למדידות אנליטיות של נוירוכימיקלים. ננו-חלקיק זהב שונה (אונפ-CFMEs) היה יציבות לתגובת דופמין עבור מעל 4 שעות. יתר על כן, התערוכה של אונפ-CFMEs רגישות מוגברת (זרם חמצוני גבוה יותר של מחזורי הוולטמגרמות) וקינטיקה מהירה יותר של העברת אלקטרון (נמוך יותר Δ_EP או הפרדת שיא) מאשר לא שונו בעבר cfmes. התפתחות האתר מספקת את הקמתה של חיישני האלקטרוכימי החדשניים לגילוי שינויים מהירים בריכוז הדופאמין ובחומרים נוירוכימיקלים אחרים במגבלות הנמוכות של גילוי. לעבודה זו יישומים נרחבים לשיפור המדידות הנוירוכימיות. הדור של הזהב ננו-חלקיק שונה CFMEs יהיה מאוד חשוב לפיתוח חיישני אלקטרודה הרומן לזהות נוירוטרנסמיטורים ב vivo מכרסמים ודגמים אחרים כדי ללמוד השפעות נוירוכימיות של שימוש בסמים, דיכאון, שבץ, איסכמיה, ומדינות התנהגותיות ומחלות אחרות.

Introduction

פחמן סיבים מיקרואלקטרודות (cfmes)¹ משמשים הטובים ביותר כחיישנים ביולוגיים כדי לזהות את החמצון של מספר נוירוטרנסמיטורים קריטיים², כולל דופמין³, נוראדרנלין⁴, סרוטונין⁵, אדנוזין⁶, היסטמין⁷, ואחרים⁸. תאימות וגודל של סיבי פחמן להפוך אותם אופטימלי עבור השרשה כמו יש נזק רקמות מוחלט לעומת אלקטרודות סטנדרטיות גדול יותר. ⁹ cfmes ידועים בעלי תכונות אלקטרוכימיות שימושיות והם מסוגלים לבצע מדידות מהירה בעת שימוש עם טכניקות אלקטרוכימיות מהיר, בדרך כלל מהירה סריקה מחזורית (fscv)^10,11. Fscv היא טכניקה הסורקת את הפוטנציאל המוחל במהירות ומספק מחזורי וולטמגרמה ספציפיים עבור אנליטים ספציפיים^12,13. הנוכחי טעינה גדולה המיוצר על ידי סריקה מהירה יציבה על סיבי פחמן והוא יכול להיות ברקע מופחתים כדי לייצר מחזורי וולטמגרמות ספציפיים.

בשל האלקטרוכימיה האופטימלית והחשיבות הנוירוביולוגית שלו, הדופמין נחקר באופן נרחב. קטכולאמין דופמין הוא שליח כימי חיוני המשחק תפקיד מרכזי בשליטה של תנועה, זיכרון, קוגניציה, ורגש בתוך מערכת העצבים. עודף או מחסור של דופמין יכול לגרום להפרעות נוירולוגיות ופסיכולוגיות רבות; בין אלה הן מחלת פרקינסון, סכיזופרניה, והתנהגות ממכרת. היום, מחלת פרקינסון ממשיכה להיות הפרעה נפוצה בשל ניוון של מידות נוירונים מעורבים בסינתזה דופמין¹⁴. תסמיני המחלה של פרקינסון כוללים רעידות, איטיות תנועה, נוקשות, ובעיות בשמירה על האיזון. מצד שני, ממריצים כגון קוקאין¹⁵ ו אמפטמין^16,17 לקדם את הגלישה של דופמין. שימוש בסמים בסופו של דבר מחליף את הזרימה הרגילה של דופמין ומצבים המוח לדרוש עודף דופמין, אשר בסופו של דבר מוביל התנהגויות ממכר.

בשנים האחרונות, יש דגש על שיפור פונקציונליות האלקטרודה בזיהוי נוירוטרנסמיטר¹⁸. השיטה הנפוצה ביותר של שיפור רגישות האלקטרודה היא על ידי ציפוי משטח סיבים. למרבה ההפתעה, יש כבר מחקר מוגבל נעשה על מתכת ננו-חלקיק electrodeposition תצהיר על סיבי פחמן¹⁹. אצילי מתכת-חלקיקים כגון זהב, עשוי להיות הופקד על המשטח סיבים עם חומרים פונקציונליים אחרים²⁰. לדוגמה, הגדלת אזור המשטח האלקטרואקטיבי עבור ספיחה של נוירוטרנסמיטר להתרחש. אלקטרומופקד חלקיקי מתכת בצורה מהירה, ניתן לטהר, ולדבוק סיב פחמן. אלקטרוכימיה ממשיכה להיות משמעותית הן התצהיר של חלקיקי מתכת אצילי שיפור פני השטח של סיבי פחמן, כפי שהוא מאפשר את השליטה של התגררות וצמיחה של חלקיקים אלה. לבסוף, מוגבר מאפיינים קטליטיים ומוליך, ותחבורה המונית משופר הם בין היתרונות האחרים של ניצול חלקיקי מתכת לניתוח אלקטרו.

קורס רצף המעבדה המתקדמת של האוניברסיטה האמריקנית (הכימיה הביולוגית הניסיונית I ו-II כימית 471/671-472/672) הוא שילוב של מעבדות אנליטיות, פיזיקליות, וביוכימיה. הסמסטר הראשון הוא סקירה של טכניקות מעבדה. הסמסטר השני הינו פרויקט מחקר מונחה סטודנטים והוביל למחקר^{בן 21}. עבור פרויקטים אלה, הסטודנטים בחנו בעבר את המנגנון של ביואוליכאל, חלבון, פפטיד, ו חומצת אמינו הקלה סינתזה של חלקיקי זהב^22,23. עבודה עדכנית יותר התמקדה היווצרות של זהב ננו-חלקיק (אונפ) הייצור על משטחי האלקטרודה ואת הערכה של השפעות האונפס על היכולת CFMEs לזהות נוירוטרנסמיטורים. בעבודה הנוכחית, המעבדה החלה טכניקה זו כדי להדגים כי הרגישות של CFMEs בזיהוי חמצון-דופמין מוגברת באמצעות הפקדת האלקטרופ על פני השטח סיבים. כל חשופים-CFME מאופיין על ידי סריקה שונים, יציבות ו דופמין-ריכוז כאשר מזהה דופמין-זרמים חמצוני למדוד חמצון דופמין על פני השטח של CFME. Au^{3 +} היה לאחר מכן חשמל או⁰ ו הופקד בו על משטח סיבים כמו חלקיקים, ואחריו סדרה של ניסויים אפיון. לאחר השוואה ישירה, הדודות-CFMEs נמצאו בעלי רגישות גבוהה יותר של זיהוי דופמין. הציפוי האחיד של הדודות על משטח הסיבים דרך הסיג החשמלי מעבד את שטח המשטח הגבוה יותר אלקטרואקטיבי; כך, הגברת הספיחה של דופמין על פני השטח אלקטרודה שונה. . זה הוביל לזרמי דופאמין גבוהים יותר ההפרדה הפוטנציאלית של חמצון דופמין ופסגות הפחתת (∆ E_p) של אונפ-cfmes היה גם קטן יותר, הרומז קינטיקה מהירה יותר העברת אלקטרון. עבודות עתידיות של מחקר זה כולל בדיקות vivo של הן חשופות ו-האונפ-CFMEs לאיתור דופמין.

Protocol

1. בניית מיקרואלקטרודות סיבי פחמן

1. הכנת סיבי פחמן
   1. כדי ליצור פחמן סיבים מיקרואלקטרודות, ראשית להפריד את סיבי הפחמן (סיבי פחמן, 7 מ"מ בקוטר) אחד אחד באמצעות ידיים, כפפות, ו מרית.
   2. משוך או הוציא סיב אחד. מחוטי הצמר המעוות
   3. מנושף סיב פחמן בודד לתוך נימי זכוכית (חבית בורוסיליקט זכוכית קפילר ללא מיקרופילמנט, 1.2 מ"מ קוטר חיצוני, 0.68 מ"מ קוטר פנימי).
   4. צור מחזיק אלקטרודה עבור האלקטרודות על ידי גזירה פיסת קרטון כי הוא כ 10 ס מ אורך על ידי 25 ס מ רוחב.
2. משוך את האלקטרודות. בעזרת פולר-קפיל אנכי
3. פתחו את דלת ההזזה. של פולר הנימים האנכי
4. לשחרר ולהסיר את מוט המחזיק מתכתי, על ידי סיבוב מקדחה-צ'אק נגד כיוון השעון עם מספיק מקום כדי להכניס את נימי הזכוכית.
5. הכניסו את נימי הזכוכית למחזיק האלקטרודות. הרימו את נימי הזכוכית לראש הנימים האנכיים באופן ידני.
6. הדקו את נימי הזכוכית בעזרת המקדח בכיוון השעון, מבלי לשבור או לנפץ את נימי הזכוכית.
7. להתאים את החימום 1, מחמם 2, ואת הגדרות מגנט ליצרן רמות הציע למשוך נימים זכוכית להתחדד משובח עבור חומרים אלקטרודה.
8. לחץ על לחצן התחל אדום כדי לחמם את הסליל מתפתל למשוך את האלקטרודות באמצעות לחץ, כוח הכבידה, והסקה.
9. תן לסליל המתפתל להתקרר. מהמצב האדום והלוהט שלו חותכים את סיבי הפחמן עם מספריים המחברים את שני אלקטרודות משכו מלמעלה למטה. השתמש בשיטת הקידוח-צ'אק כדי להסיר את נימי הזכוכית מהפולר האנכי באמצעות פיתול הכיוון נגד כיוון השעון.

2. הכנה למיקרואלקטרודה פחמן-סיב

1. תחת סטריאוסקופ או מיקרוסקופ, לחתוך את סיבי הפחמן בולטות מהמשטח של נימי הזכוכית עם מספריים כירורגית או להב תער חדה כדי כ 100 – 150 יקרומטר באורך.
2. הכינו תמיסה של אפוקסי על-ידי ערבוב של 10 גר' אפוקסי עם 0.2 מ ל של הרהארמר בבקבוקון במבחנה של 25 מ ל באמצעות ספוגית כותנה.
3. מטבל רק קצה של כל אלקטרודה לתוך התמיסה אפוקסי והרתחת במשך כ 15-s.
4. טובלים את העליון הנ ל של סיבי פחמן מיקרואלקטרודה באצטון עבור כ 3 s לשטוף את כל אפוקסי עודף מחבית של מיקרואלקטרודה סיב פחמן.

3. אלקטרודפוציה

1. מניחים את האלקטרודה עובד (פחמן סיבים מיקרואלקטרודה) בפתרון של 0.5 mM האוקלרנית₄ בנוסף לאלקטרודה ההפניה, כסף כסף כלוריד (Ag/agcl) באמצעות המיקרומניפולציה.
2. חברו את האלקטרודה העובדת ואת האלקטרודות להפניה לפוטנציאל ולשלב הקדמי.
3. פתח את תוכנת UNC HDCV. שנה את ההגדרות בתוכנה כדי להחיל את צורת הגל. הזן את צורת הגל הבאה לתוך הגדרות המחשב: לסרוק מ 0.2 V ל-1.0 V בתוך 0.1 M KCl פתרון המכיל 0.5 mM לפחות₄ בקצב סריקה של 50 mV/s עבור 10 מחזורים. לחץ על החץ הירוק כדי להחיל את צורת הגל. לאחר מכן, לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל בהקלטת המידות.

4. סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני

הערה: תמונה חשופים וזהב ננו-חלקיק שונה סיבי פחמן מיקרואלקטרודות באמצעות סריקת אלקטרון מיקרוסקופ כלי (SEM). טען את המדגם על סרט מוליך שחור ובעקבות ההוראות המתוארות ביצרן.

1. הפעלת המכשיר
   1. הפוך את המפתח להתחלה ולהפצה.
   2. פתח את התוכנה InTouchScope על ידי לחיצה כפולה.
   3. . שחררו את המפתח . זה אמור לנחות על הסימן שלי בעצמו
   4. המתן עד שלחצן הפינוי יפסיק להבהב.
   5. לאחר שלחצן הפינוי יפסיק להבהב, לחץ על לחצן האוורור.
   6. המתן עד שלחצן ה-VENT יפסיק להבהב.
   7. ודא כי מרחק העבודה (WD) הוא 20 מ"מ – 30 מ"מ.
   8. בעת המתנה, הכן את המדגם (ים).
2. סריקה
   1. לאחר שלחצן האוורור יפסיק להבהב, טען את המדגם (ים) לתוך הכלי.
   2. ודא שהחלק המעוקל של מחזיק המדגם מכוון לכיוון הכלי בעת טעינת מדגם (ים).
   3. לחץ על לחצן ' פינוי ' לאחר שהמדגם נטען.
   4. כוונן את מרחק העבודה ל-10 מ"מ.
   5. לאחר שלחצן הפינוי יפסיק להבהב, הפעל את המחשב.
   6. לחץ על התוכנה בטווח מגע, הממוקמת בשולחן העבודה. יש שתי תוכנות בטווח מגע, לחץ על אחד בלי העיגול הירוק והצהוב.
   7. לאחר התוכנה נפתחת, לחץ על להתבונן (הימני העליון של המסך), כדי להדליק את הקרן. ודא שלחצן ' פינוי ' הפסיק להבהב לפני הלחיצה על ' התבונן '.
   8. התחל לנתח את המדגם (ים).
   9. ודא שהגדרות מתח, מרחק עבודה (WD) והגדרות הבדיקה הנוכחיות (PC) הן מקובלות.
   10. הקטן התרחקות (~ 50X) להגדרה גבוהה יותר והתקרבות למיקום נמוך יותר.
   11. . הגדר את מרחק העבודה ב -10 מ"מ
   12. לפני נטילת תמונה של מדגם (ות), ודא שהתמונה תישמר בתיקיית היעד הרצויה.
   13. כדי לבחור את התיקיה הרצויה, לחץ על ההגדרות (למעלה משמאל למסך).
   14. יצא את התמונות מהמחשב באמצעות כונן הבזק.
3. ביטול
   1. לחץ על להתבונן כדי לכבות את הקרן.
   2. לחץ על לחצן האוורור והמתן עד שיפסיק להבהב.
   3. בזמן ההמתנה שלחצן ה-VENT יפסיק להבהב, התאם את מרחק העבודה בחזרה ל -20 מ"מ – 30 מ"מ.
   4. לאחר שלחצן האוורור יפסיק להבהב, פרוק את המדגם מכלי הנגינה.
   5. לחץ על לחצן ' פינוי ', והמתן עד שיפסיק להבהב.
   6. לאחר שלחצן הפינוי יפסיק להבהב, צא מהתוכנה וכבה את המחשב.
   7. הפוך את המפתח לסימן O כדי לכבות לחלוטין את המכשיר.

5. סריקה מהירה מחזורית בדיקות הוולטממטריה

1. לחבר את סיבי פחמן מיקרואלקטרודה לפוטנציאל ולשלב הראש יחד עם אלקטרודות Ag/AgCl התייחסות.
2. באמצעות המיקרומניפולציה, הנמך את סיבי הפחמן המיקרואלקטרודה אל תא הזרימה היטב על-ידי התאמת ידני של הידיות X, Y ו-Z.
3. להכין פתרון מאגר במים די (131.5 mM הנאקל, 3.25 mM KCl, 1.2 mM CaCl₂, 1.25 mM ארנה₂פו₄, 1.2 mmMgcl 2, ו 2.0 Mm Na₂כך₄ עם ה-pH מותאם ל 7.4).
4. מלאו את תא הזרימה עם מאגר מלוחים באגירה מפוספז (pH = 7.4).
5. בעזרת מזרק מאגר 60 mL מתמלא, הכנס את מאגר PBS לתוך תא הזרימה בערך 1 mL/min.
6. הניחו את האלקטרודה בתא הזרימה והחילו את צורת הגל על ידי לחיצה על הכפתור הירוק. התבוננו באולוסקופ וחתכו את האלקטרודה או התאימו את הרווח כדי למנוע עומס יתר. אפשר כ -10 דקות של שיווי משקל בין כל לרוץ אלקטרודה.
7. הגדר צורת גל ברירת המחדל. לסרוק מ – 0.4 V כדי 1.3 V ב 10 הרץ ו 400 V/s.
8. הכנת פתרון מלאי של 10 מ"מ דופמין, סרוטונין, נוראדרנלין, ועוד בחומצה perchloric. לדלל נוירוכימיקלים לריכוז הסופי של 1 μM במאגר ידי pipetting 1 μM של פתרון מניות דופמין ב 10 מ ל של מאגר PBS באמצעות פיפטה.
9. כדי להתחיל במדידות, לחץ על לחצן הרשומה. לאחר 10 s, להזריק 0.2 mL של 1 μM דופמין לתוך תא הזרימה או כל ריכוז אחר של מוליך עצבי. כוונן את הריכוז, קצב הסריקה, צורת גל (החזקת פוטנציאל או החלפת פוטנציאל) בהתאם. הגדר את זמן ההפעלה הכולל עבור 30 s.
10. נתח את ההפעלה באמצעות תוכנת ניתוח HDCV. שנה את הפרמטרים לפי הצורך.
11. לאחר השלמת הניסוי, נקו את תא הזרימה על-ידי הזרקת 3 מ ל מים ולאחר מכן האוויר לתוך המאגר ויציאות ההזרקה של תא הזרימה שלוש פעמים כל אחד.
12. . כבו את צורת הגל והכלי

תוצאות

עבור איור 1, אנו מראים סכמטי שבו FSCV בדיקות מנוצל כדי למדוד את הריכוז של הנוירוטרנסמיטורים בתוך מבחנה. איור 1 מציג את בעלי הדופאמין שהוחלו על צורת הדופמין. המשולש בצורת גל סריקות מ-0.4 V כדי 1.3 V ב 400 V/s. בחלק השני של הדמות משמאל, זה מציג את החמצון ש...

Discussion

במחקר זה, אנו להדגים שיטה הרומן לבנות זהב-ננו-חלקיק שונה סיבי פחמן מיקרואלקטרודות לאיתור של נוירוטרנסמיטורים כגון דופמין באמצעות סריקה מהירה מחזורית וולטמטריה. השיטה היא גישה יעילה, ירוקה, וזולה יחסית לשיפור הרגישות של גילוי ביואוכאל. עובי הזהב שהופקדו על פני סיבי הפחמן יכול להיות נשלט ע?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dopamine hydrochloride	Sigma Aldrich	H8502-5G
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	P5493-1L
Pine WaveNeuro Potentiostat	Pine Instruments	NEC-WN-BASIC	This orders comes in bulk with all other accessories such as headstages, adapters, cords, and other electronics
Pine Flow Cell and Micromanipulator	Pine Instruments	NEC-FLOW-1	This is also another bulk order including the micromanipulator, flow cell, knobs, tubing, connectors, etc.
Glass-Capillary	A-M Systems	602500
T-650 Carbon Fiber	Goodfellow	C 005711
Epon 828 Epoxy	Miller-Stephenson	EPON 828 TDS
Diethelynetriamine	Sigma Aldrich	D93856-5ML
Gold (III) chloride	Sigma Aldrich	254169	Comes as either HAuCl4 or AuCl3
pH meter	Fisher	S90528
Farraday Cage	AMETEK TMC	81-334-03
Syringe Pump	NEW ERA PUMP	NE-1000
Eppendorf Pipettes and Tips	Eppendorf	2231000222	This is also a bulk order containing multiple pipettes and tips
10 -1,000 mL beakers	VWR	10536-390
Carbon fiber	Goodfellow	C 005711
SEM	JEOL	JSM-IT100