Microelettrodi in fibra di carbonio modificati con nanoparticle d'oro per una migliore rilevazione neurochimica

Riepilogo

In questo studio, modifichiamo i microelettrodi in fibra di carbonio con nanoparticelle d'oro per migliorare la sensibilità del rilevamento del neurotrasmettitore.

Abstract

Per oltre 30 anni, i microelettrodi in fibra di carbonio (CFME) sono stati lo standard per il rilevamento dei neurotrasmettitori. Generalmente, le fibre di carbonio vengono aspirate in capillari di vetro, tirate a un cono fine e poi sigillate utilizzando un resina resina epossidica per creare materiali elettrodi che vengono utilizzati per test di voltammetria ciclica a scansione rapida. L'uso di CFME nudi ha diverse limitazioni, però. In primo luogo, la fibra di carbonio contiene per lo più carbonio piano basale, che ha una superficie relativamente bassa e produce sensibilità inferiore rispetto ad altri nanomateriali. Inoltre, il carbonio grafitico è limitato dalla sua risoluzione temporale e dalla sua conduttività relativamente bassa. Infine, neurochimici e macromolecole sono stati conosciuti per fallo sulla superficie di elettrodi di carbonio dove formano polimeri non conduttivi che bloccano ulteriori annunci neurotrasmettitori. Per questo studio, modifichiamo i CFME con nanoparticelle d'oro per migliorare i test neurochimici con la voltammetria ciclica a scansione rapida. L'Au³ è stato elettrodepositato o sofposto da una soluzione colloidale sulla superficie dei CFME. Poiché l'oro è un metallo stabile e relativamente inerte, è un materiale elettrodo ideale per misurazioni analitiche di sostanze neurochimiche. La nanoparticella d'oro modificata (AuNP-CFME) ha avuto una stabilità alla risposta della dopamina per oltre 4 h. Inoltre, AuNP-CFME s'intitola inoltre una maggiore sensibilità (corrente ossidativa di picco più alta dei voltammogrammi ciclici) e cinedi di trasferimento elettronico più veloci_(EP o separazione del picco) più in basso rispetto ai CFME non modificati. Lo sviluppo di AuNP-CFME fornisce la creazione di nuovi sensori elettrochimici per rilevare i cambiamenti rapidi nella concentrazione di dopamina e altre sostanze neurochimiche a limiti inferiori di rilevamento. Questo lavoro ha vaste applicazioni per il miglioramento delle misurazioni neurochimiche. La generazione di CFME modificate con nanoparticelle d'oro sarà di vitale importanza per lo sviluppo di nuovi sensori di elettrodi per rilevare i neurotrasmettitori in vivo nei roditori e in altri modelli per studiare gli effetti neurochimici dell'abuso di droga, depressione, ictus, ischemia, e altri stati comportamentali e di malattia.

Introduzione

Microelectrodi in fibra di carbonio (CFME)¹ sono meglio utilizzati come biosensori per rilevare l'ossidazione di diversi neurotrasmettitori cruciali², tra cui dopamina³, noradrenalina⁴, serotonina⁵, adenosina⁶, istamina⁷, e altri⁸. La biocompatibilità e le dimensioni delle fibre di carbonio le rendono ottimali per l'impianto in quanto vi è un danno tissutale mitigato rispetto agli elettrodi standard più grandi. ⁹ I CFME sono noti per possedere proprietà elettrochimiche utili e sono in grado di effettuare misurazioni rapide se utilizzate con tecniche elettrochimiche veloci, più comunemente tensionemiche ciclica a scansione rapida (FSCV)^10,11. FSCV è una tecnica che scansiona rapidamente il potenziale applicato e fornisce un voltammogramma ciclico specifico per analiti specifici^12,13. La grande corrente di ricarica prodotta dalla scansione veloce è stabile sulle fibre di carbonio e può essere sottratta in background per produrre voltammogrammi ciclici specifici.

Grazie alla sua elettrochimica ottimale e importanza neurobiologica, dopamina è stato ampiamente studiato. La dopamina catecholamina è un messaggero chimico essenziale che svolge un ruolo fondamentale nel controllo del movimento, memoria, cognizione, ed emozione all'interno del sistema nervoso. Un surplus o carenza di dopamina può causare numerose interferenze neurologiche e psicologiche; tra questi ci sono il morbo di Parkinson, la schizofrenia e il comportamento di dipendenza. Oggi, Il morbo di Parkinson continua ad essere un disturbo prevalente a causa della degenerazione dei neuroni midbrain coinvolti nella sintesi della dopamina¹⁴. Sintomi di malattia di Parkinson includono tremore, lentezza del movimento, rigidità, e problemi nel mantenimento dell'equilibrio. D'altra parte, stimolanti come la cocaina¹⁵ e l'anfetamina^16,17 promuovono l'overflow della dopamina. L'abuso di droghe alla fine sostituisce il flusso regolare della dopamina e condiziona il cervello per richiedere un surplus di dopamina, che alla fine porta a comportamenti di dipendenza.

Negli ultimi anni, c'è stata un'enfasi sul miglioramento della funzionalità degli elettrodi nel rilevamento del neurotrasmettitore¹⁸. Il metodo più diffuso per migliorare la sensibilità degli elettrodi è rivestire la superficie della fibra. Sorprendentemente, c'è stata una ricerca limitata fatta sull'elettrodeposizione delle nanoparticelle metalliche sulle fibre di carbonio¹⁹. Nobili nanoparticelle metalliche come l'oro, possono essere elettrodepositate sulla superficie della fibra con altri materiali funzionali²⁰. Per esempio, aumentando la superficie elettroattiva per l'adsorption neurotrasmettitore a verificarsi. Nanoparticelle metalliche elettrodepositate si formano rapidamente, possono essere purificate e aderire alla fibra di carbonio. L'elettrochimica continua ad essere significativa sia per la deposizione di nanoparticelle metalliche nobili che per il miglioramento superficiale delle fibre di carbonio, in quanto consente il controllo della nucleazione e della crescita di queste nanoparticelle. Infine, l'aumento delle caratteristiche catalitiche e conduttive e il miglioramento del trasporto di massa sono tra gli altri vantaggi dell'utilizzo di nanoparticelle metalliche per l'elettroanalisi.

Il corso di sequenza Advanced Laboratory dell'American Biological Chemistry I e II CHEM 471/671-472/672) è una combinazione di laboratori analitici, fisici e di biochimica. Il primo semestre è una panoramica delle tecniche di laboratorio. Il secondo semestre è un progetto diricerca 21 guidato da studenti e guidato. Per questi progetti, gli studenti hanno precedentemente esaminato il meccanismo di biomolecola, proteina, peptide e sintesi di nanoparticelle d'oro^22,23. Un lavoro più recente si è concentrato sulla formazione della produzione di nanoparticelle d'oro (AuNP) sulle superfici degli elettrodi e sulla valutazione degli effetti AuNP sulla capacità delle CME di rilevare i neurotrasmettitori. Nel lavoro attuale, il laboratorio ha applicato questa tecnica per dimostrare che la sensibilità dei CFME nel rilevare l'ossidazione della dopamina è migliorata attraverso l'elettrodeposizione di AuNP sulla superficie della fibra. Ogni bare-CFME è caratterizzato da varia scan-rate, stabilità e concentrazione di dopamina quando si rilevano correnti ossidative dopamina-ossidativo per misurare l'ossidazione della dopamina sulla superficie del CFME. Au³ è stato poi elettroridotto a Au⁰ e contemporaneamente elettrodepositato sulla superficie della fibra come nanoparticelle, seguito da una serie di esperimenti di caratterizzazione. Dopo un confronto diretto, gli AuNP-CFME sono stati trovati a possedere una maggiore sensibilità del rilevamento della dopamina. Il rivestimento uniforme di AuNP sulla superficie della fibra tramite elettrodeposizione rende più alta la superficie elettroattiva; quindi, aumentando l'adsorbente della dopamina sulla superficie dell'elettrodo modificato. Questo ha portato a più elevate correnti ossidative della dopamina. Anche la potenziale separazione dell'ossidazione edella riduzione della dopamina (EP ) di AuNP-CFME era più piccola, suggerendo una cinetica di trasferimento di elettroni più veloce. Le opere future di questo studio includono il test in vivo di entrambi i Nue- e AuNP-CFME per il rilevamento della dopamina.

Protocollo

1. Costruzione di microelettrodi in fibra di carbonio

1. Preparazione delle fibre di carbonio
   1. Per creare microelettrodi in fibra di carbonio, separare prima le fibre di carbonio (fibra di carbonio,7 mm di diametro) una ad una con mani, guanti e spatole.
   2. Tirare o strappare una fibra dal filo attorcigliato.
   3. Aspirare una fibra di carbonio isolata in un capillare di vetro (vetro capillare a canna singola senza microfilamento, diametro esterno di 1,2 mm, diametro interno di 0,68 mm).
   4. Creare un supporto per elettrodi tagliando un pezzo di cartone di circa 10 cm di lunghezza per 25 cm di larghezza.
2. Tirare gli elettrodi utilizzando un tirante capillare verticale.
3. Aprire la porta scorrevole dell'etraina capillare verticale.
4. Allenta e rimuovi l'asta metallica, ruotando il trapano-chuck in senso antiorario con spazio sufficiente per inserire il capillare di vetro.
5. Inserire il vetro capillare nel supporto dell'elettrodo. Sollevare manualmente il capillare di vetro fino alla parte superiore del capillare verticale.
6. Stringere il vetro capillare con i trapano-chucks in senso orario senza rompere o distruggere i capillari di vetro.
7. Regolare le impostazioni di Heater 1, Heater 2 e Magnete ai livelli suggeriti dal produttore per tirare i capillari di vetro a un cono fine per i materiali elettrodi.
8. Premere il pulsante di avvio rosso per riscaldare la bobina a bobina per estrarre gli elettrodi attraverso la pressione, la gravità e il riscaldamento.
9. Lasciare raffreddare la bobina rincantale dal suo stato caldo rosso. Tagliare la fibra di carbonio con le forbici che collegano i due elettrodi tirati dall'alto verso il basso. Utilizzare il metodo drill-chuck per rimuovere il capillare di vetro dall'estrattore capillare verticale ruotando in senso antiorario.

2. Preparazione del microelettrodo in fibra di carbonio

1. Sotto uno stereoscopio o un microscopio, tagliare la fibra di carbonio sporgente dalla superficie del vetro capillare con forbici chirurgiche o una lama affilata del rasoio a circa 100 –150 m di lunghezza.
2. Preparare una soluzione di resina epossidica mescolando 10 g di resina epossidica con 0,2 mL di indurimento in una fiala da 25 mL utilizzando un tampone di cotone.
3. Immergere solo la punta di ogni elettrodo nella soluzione epossidica e indurimento per circa 15 s.
4. Immergere la parte superiore di cui sopra del microelettrodo in fibra di carbonio in acetone per circa 3 s per lavare via qualsiasi epossidica in eccesso dalla canna del microelettrodo in fibra di carbonio.

3. Elettrodeposizione

1. Posizionare l'elettrodo funzionante (microelettrodo in fibra di carbonio) nella soluzione di 0,5 mM HAuCl₄ in aggiunta all'elettrodo di riferimento, cloruro argento-argento (Ag/AgCl) utilizzando il micromanipolatore.
2. Collegare l'elettrodo di lavoro e l'elettrodo di riferimento al potenziatore e al headstage.
3. Aprire il software HDCV UNC. Modificare le impostazioni del software per applicare la forma d'onda. Inserite la seguente forma d'onda nelle impostazioni del computer: scansione da 0,2 V a 1,0 V in soluzione KCl da 0,1 M contenente 0,5 mM HAuCl₄ ad una velocità di scansione di 50 mV/s per 10 cicli. Premere la freccia verde per applicare la forma d'onda. Quindi, premere il pulsante di avvio per iniziare la registrazione delle misurazioni.

4. Microscopia elettronica a scansione

NOTA: i microelettrodi in fibra di carbonio modificati in fibra di carbonio sono stati modificati utilizzando lo strumento di microscopia elettronica a scansione (SEM). Caricare il campione su nastro conduttivo nero e seguendo le istruzioni fornite dal produttore.

1. Accensione dello strumento
   1. Ruotare il tasto su START e rilasciare.
   2. Aprire il software InTouchScope facendo doppio clic su di esso.
   3. Rilasciare il tasto. Dovrebbe atterrare sul simbolo I da solo.
   4. Attendere che il pulsante EVAC smetta di lampeggiare.
   5. Quando il pulsante EVAC smette di lampeggiare, premere il pulsante VENT.
   6. Attendere che il pulsante VENT smetta di lampeggiare.
   7. Assicurarsi che la distanza di lavoro (WD) sia di 20 mm – 30 mm.
   8. In attesa, preparare i campioni.
2. Scansione
   1. Quando il pulsante VENT smette di lampeggiare, caricare i campioni nello strumento.
   2. Assicurarsi che la parte curva del portacampione sia rivolta verso lo strumento durante il caricamento dei campioni.
   3. Premere il pulsante EVAC una volta caricati i campioni.
   4. Regolare la distanza di lavoro a 10 mm.
   5. Quando il pulsante EVAC smette di lampeggiare, accendere il computer.
   6. Fare clic sul software In Touch Scope, che si trova sul desktop. Ci sono due software In Touch Scope, fare clic su quello senza il cerchio verde e giallo.
   7. Una volta aperto il software, fare clic su OBSERVE (in alto a destra dello schermo), per accendere la trave. Assicurarsi che il pulsante EVAC abbia smesso di lampeggiare prima di fare clic su OBSERVE.
   8. Iniziare ad analizzare i campioni.
   9. Assicurarsi che le impostazioni di tensione, distanza di lavoro (WD) e corrente sonda (PC) siano accettabili.
   10. Eseguire lo zoom indietro (50X) per ottenere un'impostazione più alta e ingrandire per ottenere un'impostazione inferiore.
   11. Impostare la distanza di lavoro a 10 mm.
   12. Prima di scattare una foto dei campioni, assicurarsi che l'immagine verrà salvata nella cartella di destinazione desiderata.
   13. Per scegliere la cartella desiderata, fare clic sulle impostazioni (in alto a sinistra dello schermo).
   14. Esportare le immagini dal computer tramite un'unità flash.
3. Spegnere
   1. Fare clic su OBSERVE per disattivare la trave.
   2. Premere il tasto VENT e attendere che smetta di lampeggiare.
   3. In attesa che il pulsante VENT smetta di lampeggiare, regolare la distanza di lavoro a 20 mm – 30 mm.
   4. Quando il pulsante VENT smette di lampeggiare, scaricare i campioni dallo strumento.
   5. Premere il pulsante EVAC e attendere che smetta di lampeggiare.
   6. Quando il pulsante EVAC smette di lampeggiare, uscire dal software e spegnere il computer.
   7. Girare il tasto sul simbolo O per spegnere completamente lo strumento.

5. Test di voltammetria ciclica a scansione rapida

1. Collegare il microelettrodo in fibra di carbonio al potentiostat e alla fase di headstage insieme all'elettrodo di riferimento Ag/AgCl.
2. Utilizzando il micromanipolatore, abbassare il microelettrodo in fibra di carbonio nel pozzo della cella di flusso regolando manualmente le manopole di misura X, Y e .
3. Preparare la soluzione buffer in acqua DI (131,5 mM NaCl, 3,25 mM KCl, 1,2 mM CaCl₂, 1,25 mM NaH₂PO₄, 1,2 mM MgCl₂e 2,0 mM Na2 SO₄ con il pH regolato a 7.4).
4. Riempire la cella di flusso con buffer salina con buffer salofo fosfato (PBS) buffer (pH - 7,4).
5. Utilizzando una siringa buffer da 60 mL riempita, iniettare il buffer PBS nella cella di flusso a circa 1 mL/min.
6. Posizionare l'elettrodo nella cella di flusso e applicare la forma d'onda premendo il pulsante verde. Osservare l'oscilloscopio e tagliare l'elettrodo o regolare il guadagno per evitare il sovraccarico. Lasciare per circa 10 min di equilibratione tra ogni corsa elettrodo.
7. Impostare la forma d'onda predefinita sulla forma d'onda della dopamina. Scansione da – da 0,4 V a 1,3 V a 10 Hz e 400 V/s.
8. Preparare la soluzione stock di 10 mM di dopamina, serotonina, noradrenalina, e altri in acido perclorico. Diluire le sostanze neurochimiche alla concentrazione finale di 1 M nel buffer con il pipettaggio di 1 M della soluzione di stock di dopamina in 10 mL di buffer PBS utilizzando una pipetta.
9. Per iniziare le misurazioni, premere il pulsante di registrazione. Dopo 10 s, iniettare 0,2 mL di 1 dopamina M nella cella di flusso o qualsiasi altra concentrazione di neurotrasmettitore. Regolare la concentrazione, il tasso di scansione, la forma d'onda (potenziale di mantenimento o potenziale di commutazione) di conseguenza. Impostare il tempo di esecuzione totale per 30 s.
10. Analizzare la corsa utilizzando il software di analisi HDCV. Modificare i parametri in base alle esigenze.
11. Al termine dell'esperimento, pulire la cella di flusso iniettando 3 mL di acqua e quindi aria nelle porte tampone e iniezione della cella di flusso tre volte ciascuna.
12. Spegnere la forma d'onda e lo strumento.

Risultati

Per figura 1, mostriamo uno schema in cui viene utilizzato il test FSCV per misurare la concentrazione di neurotrasmettitori in vitro. Figura 1 Mostra la forma d'onda della dopamina applicata. La forma d'onda del triangolo viene scansionata da -0,4 V a 1,3 V a 400 V/s. Nella seconda parte della figura a sinistra, mostra l'ossidazione della dopamina alla dopamina-orto-quinone (DOQ), un processo di trasferimento di due elettroni si...

Discussione

In questo studio, dimostriamo un nuovo metodo per costruire microelettrodi in fibra di carbonio modificati oro-nanoparticle per il rilevamento di neurotrasmettitori come la dopamina utilizzando la voltamemetria ciclica a scansione rapida. Il metodo è un approccio efficiente, verde e relativamente poco costoso per migliorare la sensibilità del rilevamento di biomolecole. Lo spessore dell'oro depositato sulla superficie della fibra di carbonio può essere controllato dal momento dell'elettrodeposizione e dalla concentraz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dopamine hydrochloride	Sigma Aldrich	H8502-5G
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	P5493-1L
Pine WaveNeuro Potentiostat	Pine Instruments	NEC-WN-BASIC	This orders comes in bulk with all other accessories such as headstages, adapters, cords, and other electronics
Pine Flow Cell and Micromanipulator	Pine Instruments	NEC-FLOW-1	This is also another bulk order including the micromanipulator, flow cell, knobs, tubing, connectors, etc.
Glass-Capillary	A-M Systems	602500
T-650 Carbon Fiber	Goodfellow	C 005711
Epon 828 Epoxy	Miller-Stephenson	EPON 828 TDS
Diethelynetriamine	Sigma Aldrich	D93856-5ML
Gold (III) chloride	Sigma Aldrich	254169	Comes as either HAuCl4 or AuCl3
pH meter	Fisher	S90528
Farraday Cage	AMETEK TMC	81-334-03
Syringe Pump	NEW ERA PUMP	NE-1000
Eppendorf Pipettes and Tips	Eppendorf	2231000222	This is also a bulk order containing multiple pipettes and tips
10 -1,000 mL beakers	VWR	10536-390
Carbon fiber	Goodfellow	C 005711
SEM	JEOL	JSM-IT100