Gold Nanopartikel Modifizierte Kohlenstofffaser-Mikroelektroden für verbesserte neurochemische Detektion

Zusammenfassung

In dieser Studie modifizieren wir Kohlenstofffaser-Mikroelektroden mit Gold-Nanopartikeln, um die Empfindlichkeit der Neurotransmitter-Detektion zu verbessern.

Zusammenfassung

Seit über 30 Jahren sind Kohlenstofffaser-Mikroelektroden (CFMEs) der Standard für die Detektion von Neurotransmittern. Im Allgemeinen werden Kohlefasern in Glaskapillaren angesaugt, zu einer feinen Verjüngung gezogen und dann mit einem Epoxid versiegelt, um Elektrodenmaterialien zu erstellen, die für schnelle zyklische Voltammetrietests verwendet werden. Die Verwendung von bloßen CFMEs hat jedoch mehrere Einschränkungen. Zuallererst enthält die Kohlefaser meist basalen Ebenenkohlenstoff, der eine relativ geringe Oberfläche hat und geringere Empfindlichkeiten als andere Nanomaterialien liefert. Darüber hinaus ist der graphitische Kohlenstoff durch seine zeitliche Auflösung und seine relativ geringe Leitfähigkeit begrenzt. Schließlich sind Neurochemikalien und Makromoleküle bekannt, an der Oberfläche von Kohlenstoffelektroden zu foulen, wo sie nichtleitende Polymere bilden, die weitere Neurotransmitteradsorption blockieren. Für diese Studie modifizieren wir CFMEs mit Gold-Nanopartikeln, um neurochemische Tests mit schneller zyklischer Voltammetrie zu verbessern. Au³⁺ wurde von einer kolloidalen Lösung auf die Oberfläche von CFMEs elektrodepositiert oder getaucht. Da Gold ein stabiles und relativ inertes Metall ist, ist es ein ideales Elektrodenmaterial für analytische Messungen von Neurochemikalien. Gold-Nanopartikel modifiziert (AuNP-CFMEs) hatte eine Stabilität auf Dopamin-Reaktion für über 4 h. Darüber hinaus weisen AuNP-CFMEs eine erhöhte Empfindlichkeit (höherer oxidativer Spitzenstrom der zyklischen Voltammogramme) und eine schnellere Elektronentransferkinetik (niedrigere_EP- oder Peak-Trennung) auf als nackte unveränderte CFMEs. Die Entwicklung von AuNP-CFMEs ermöglicht die Schaffung neuartiger elektrochemischer Sensoren zur Erkennung schneller Veränderungen der Dopaminkonzentration und anderer Neurochemikalien an niedrigeren Nachweisgrenzen. Diese Arbeit hat umfangreiche Anwendungen für die Verbesserung der neurochemischen Messungen. Die Erzeugung von Gold-Nanopartikel-modifizierten CFMEs wird für die Entwicklung neuartiger Elektrodensensoren zur Detektion von Neurotransmittern in vivo bei Nagetieren und anderen Modellen zur Untersuchung neurochemischer Wirkungen von Drogenmissbrauch, Depression, Schlaganfall, Ischämie, und andere Verhaltens- und Krankheitszustände.

Einleitung

Kohlenstofffaser-Mikroelektroden (CFMEs)¹ werden am besten als Biosensoren verwendet, um die Oxidation mehrerer wichtiger Neurotransmitter zu erkennen², einschließlich Dopamin³, Noradrenalin⁴, Serotonin⁵, Adenosin⁶, Histamin⁷und andere⁸. Die Biokompatibilität und Größe von Kohlenstofffasern machen sie optimal für die Implantation, da es im Vergleich zu größeren Standardelektroden gemilderte Gewebeschäden gibt. ⁹ CFMEs sind dafür bekannt, nützliche elektrochemische Eigenschaften zu besitzen und sind in der Lage, schnelle Messungen zu machen, wenn sie mit schnellen elektrochemischen Techniken verwendet werden, am häufigsten schnell scannenzyklische Voltammetrie (FSCV)^10,11. FSCV ist eine Technik, die das angewendete Potenzial schnell scannt und ein spezifisches zyklisches Voltammogramm für bestimmte Analyten^12,13bereitstellt. Der große Ladestrom, der durch schnelles Scannen erzeugt wird, ist auf Kohlefasern stabil und kann hintergrundsubtrahiert werden, um spezifische zyklische Voltammogramme zu erzeugen.

Aufgrund seiner optimalen Elektrochemie und neurobiologischen Bedeutung, Dopamin wurde weithin untersucht. Das Katecholamin Dopamin ist ein essentieller chemischer Botenstoff, der eine zentrale Rolle bei der Kontrolle der Bewegung spielt, Speicher, Kognition, und Emotion innerhalb des Nervensystems. Ein Überschuss oder Mangel an Dopamin kann zahlreiche neurologische und psychologische Störungen verursachen; dazu gehören Parkinson-Krankheit, Schizophrenie und Suchtverhalten. Heute, Parkinson-Krankheit ist weiterhin eine weit verbreitete Erkrankung aufgrund der Degeneration von Midbrain Neuronen in Dopamin-Synthese^{beteiligt 14}. Parkinson-Krankheit Symptome sind Zittern, Langsamkeit der Bewegung, Steifigkeit, und Probleme bei der Aufrechterhaltung des Gleichgewichts. Auf der anderen Seite fördern Stimulanzien wie Kokain¹⁵ und Amphetamin^16,17 den Überlauf von Dopamin. Drogenmissbrauch schließlich ersetzt den regelmäßigen Fluss von Dopamin und Bedingungen das Gehirn, um einen Überschuss an Dopamin zu verlangen, was schließlich zu Suchtverhalten führt.

In den letzten Jahren wurde ein Schwerpunkt auf die Verbesserung der Elektrodenfunktionalität in Neurotransmitter-Erkennung¹⁸. Die am weitesten verbreitete Methode zur Verbesserung der Elektrodenempfindlichkeit ist die Beschichtung der Faseroberfläche. Überraschenderweise wurde nur begrenzte Forschungen zur Metall-Nanopartikelelektrodeaufposition auf Kohlenstofffasern^{durchgeführt 19}. Edelmetall-Nanopartikel wie Gold können mit anderen funktionellen Materialien auf die Faseroberfläche elektrolegiert werden²⁰. Zum Beispiel, Erhöhung der elektroaktiven Oberfläche für Neurotransmitter Adsorption auftreten. Elektroverschrottete Metall-Nanopartikel bilden sich schnell, können gereinigt werden und haften an der Kohlenstofffaser. Die Elektrochemie ist nach wie vor sowohl für die Abscheidung von Edelmetall-Nanopartikeln als auch für die Oberflächenverbesserung von Kohlenstofffasern von Bedeutung, da sie die Kontrolle der Keimbildung und des Wachstums dieser Nanopartikel ermöglicht. Schließlich sind die erhöhten katalytischen und leitfähigen Eigenschaften und der verbesserte Massentransport unter anderem Vorteile der Verwendung von Metall-Nanopartikeln für die Elektroanalyse.

Der Advanced Laboratory Sequence Course der American University (Experimental Biological Chemistry I and II CHEM 471/671-472/672) ist eine Kombination von Analytischen, Physikalischen und Biochemischen Laboratorien. Das erste Semester ist ein Überblick über Labortechniken. Das zweite Semester ist ein studentisches und geführtes Forschungsprojekt²¹. Für diese Projekte haben die Studierenden zuvor den Mechanismus von Biomolekül, Protein, Peptid und Aminosäure-erleichterte Synthese von Gold-Nanopartikeln^22,23untersucht. Neuere Arbeiten konzentrierten sich auf die Bildung von Gold-Nanopartikeln (AuNP) auf Elektrodenoberflächen und die Bewertung von AuNPs-Effekten auf die Fähigkeit von CFMEs, Neurotransmitter zu erkennen. In der vorliegenden Arbeit hat das Labor diese Technik angewendet, um zu zeigen, dass die Empfindlichkeit von CFMEs beim Nachweis der Dopamin-Oxidation durch die Elektrodeposition von AuNP auf die Faseroberfläche erhöht wird. Jede bare-CFME zeichnet sich durch unterschiedliche Scanrate, Stabilität und Dopamin-Konzentration beim Nachweis von Dopamin-oxidativen Strömen aus, um die Dopaminoxidation auf der Oberfläche des CFME zu messen. Au³⁺ wurde dann auf Au⁰ elektroreduziert und gleichzeitig als Nanopartikel auf die Faseroberfläche elektrolegiert, gefolgt von einer Reihe von Charakterisierungsexperimenten. Nach einem direkten Vergleich, die AuNP-CFMEs wurden gefunden, um eine höhere Empfindlichkeit der Dopamin-Erkennung besitzen. Die gleichmäßige Beschichtung von AuNP auf die Faseroberfläche über Elektrodenposition macht eine höhere elektroaktive Oberfläche; so erhöht die Adsorption von Dopamin auf die modifizierte Elektrodenoberfläche. Dies führte zu höheren dopaminoxidativen Strömen. Die mögliche Trennung der Dopaminoxidations- und Reduktionsspitzen (E_p) von AuNP-CFMEs war ebenfalls kleiner, was auf eine schnellere Elektronentransferkinetik hindeutet. Zukünftige Arbeiten dieser Studie umfassen die In-vivo-Tests sowohl der Bare- als auch der AuNP-CFMEs zum Nachweis von Dopamin.

Protokoll

1. Bau von Kohlenstofffaser-Mikroelektroden

1. Herstellung von Kohlefasern
   1. Um Kohlefaser-Mikroelektroden zu erstellen, trennen Sie zuerst die Kohlefasern (Kohlenstofffaser, 7 mm Durchmesser) einzeln mit Händen, Handschuhen und Spachtel.
   2. Ziehen oder yank eine Faser aus dem verdrehten Garn.
   3. Saugen Sie eine isolierte Kohlefaser in eine Glaskapillare (Einfass-Borosilikatkapillarglas ohne Mikrofilament, 1,2 mm Außendurchmesser, 0,68 mm Innendurchmesser).
   4. Erstellen Sie einen Elektrodenhalter für die Elektroden, indem Sie ein Stück Karton schneiden, das etwa 10 cm lang und 25 cm breit ist.
2. Ziehen Sie die Elektroden mit einem vertikalen Kapillarzieher.
3. Öffnen Sie die Schiebetür des vertikalen Kapillarziehers.
4. Lösen und entfernen Sie die metallische Halterstange, indem Sie das Bohrfutter gegen den Uhrzeigersinn drehen und genügend Platz haben, um die Glaskapillare einzulegen.
5. Setzen Sie die Glaskapillare in den Elektrodenhalter ein. Heben Sie die Glaskapillare manuell von Hand an die Oberseite der vertikalen Kapillare.
6. Ziehen Sie die Glaskapillare mit den Bohrfuttern im Uhrzeigersinn fest, ohne die Glaskapillaren zu brechen oder zu zertrümmern.
7. Passen Sie die Einstellungen Für Heizung 1, Heizung 2 und Magnet an den Hersteller an, um Glaskapillaren auf eine feine Verjüngung für Elektrodenmaterialien zu ziehen.
8. Drücken Sie den roten Startknopf, um die gewickelte Spule zu erwärmen, um die Elektroden über Druck, Schwerkraft und Erwärmung zu ziehen.
9. Lassen Sie die gewickelte Spule von ihrem roten heißen Zustand abkühlen. Schneiden Sie die Kohlefaser mit einer Schere, die die beiden gezogenen Elektroden von oben nach unten verbindet. Verwenden Sie die Bohrfuttermethode, um die Glaskapillare aus dem vertikalen Kapillarzieher zu entfernen, indem Sie sich gegen den Uhrzeigersinn verdrehen.

2. Carbon-Fiber-Mikroelektroden-Vorbereitung

1. Schneiden Sie unter einem Stereoskop oder Mikroskop die Vonderatik der Kohlefaser mit einer chirurgischen Schere oder einer scharfen Rasierklinge auf eine Länge von ca. 100 –150 m ab.
2. Bereiten Sie eine Lösung von Epoxid vor, indem Sie 10 g Epoxid mit 0,2 ml Härter in einer 25 ml Durchstechflasche mit einem Wattestäbchen mischen.
3. Tauchen Sie nur die Spitze jeder Elektrode in die Epoxid- und Härterlösung für ca. 15 s.
4. Tauchen Sie die oben genannte Oberseite der Kohlefaser-Mikroelektrode in Aceton für ca. 3 s, um überschüssiges Epoxid aus dem Lauf der Kohlefaser-Mikroelektrode wegzuwaschen.

3. Elektrodenposition

1. Legen Sie die Arbeitselektrode (Kohlenstofffaser-Mikroelektrode) zusätzlich zur Referenzelektrode Silber-Silberchlorid (Ag/AgCl) mit dem Mikromanipulator in die Lösung von 0,5 mM HAuCl_4.
2. Verbinden Sie die Arbeitselektrode und die Referenzelektrode mit dem Potentiostat und der Kopfbühne.
3. Öffnen Sie die UNC HDCV-Software. Ändern Sie die Einstellungen in der Software, um die Wellenform anzuwenden. Geben Sie die folgende Wellenform in die Computereinstellungen ein: Scannen Sie von 0,2 V bis 1,0 V in 0,1 M KCl-Lösung mit 0,5 mM HAuCl₄ bei einer Scanrate von 50 mV/s für 10 Zyklen. Drücken Sie den grünen Pfeil, um die Wellenform anzuwenden. Drücken Sie dann die Starttaste, um mit der Aufzeichnung der Messungen zu beginnen.

4. Rasterelektronenmikroskopie

HINWEIS: Bild bare und Gold Nanopartikel modifiziert Kohlefaser Mikroelektroden mit Rasterelektronenmikroskopie -Instrument (SEM). Laden Sie die Probe auf schwarzes leitfähiges Band und befolgen Sie die vom Hersteller beschriebenen Anweisungen.

1. Einschalten des Instruments
   1. Drehen Sie den Schlüssel zu START und lassen Sie sie los.
   2. Öffnen Sie die InTouchScope-Software, indem Sie darauf doppelklicken.
   3. Geben Sie den Schlüssel los. Es sollte auf dem I-Symbol allein landen.
   4. Warten Sie, bis die EVAC-Taste aufhört zu blinken.
   5. Sobald die EVAC-Taste nicht mehr blinkt, drücken Sie die VENT-Taste.
   6. Warten Sie, bis die VENT-Taste das Blinken beendet.
   7. Stellen Sie sicher, dass der Arbeitsabstand (WD) bei 20 mm – 30 mm liegt.
   8. Bereiten Sie während des Wartens die Probe(n) vor.
2. Scannen
   1. Sobald die VENT-Taste nicht mehr blinkt, laden Sie die Probe(n) in das Instrument.
   2. Stellen Sie sicher, dass der gekrümmte Teil des Probenhalters beim Laden von Proben auf das Gerät zeigt.
   3. Drücken Sie die EVAC-Taste, sobald die Probe(n) geladen ist.
   4. Stellen Sie den Arbeitsabstand auf 10 mm ein.
   5. Sobald die EVAC-Taste nicht mehr blinkt, schalten Sie den Computer ein.
   6. Klicken Sie auf die In Touch Scope-Software auf dem Desktop. Es gibt zwei In Touch Scope Software, klicken Sie auf die ohne den grünen und gelben Kreis.
   7. Sobald sich die Software öffnet, klicken Sie auf OBSERVE (oben rechts auf dem Bildschirm), um den Strahl einzuschalten. Stellen Sie sicher, dass die EVAC-Taste nicht mehr blinkt, bevor Sie auf OBSERVE klicken.
   8. Beginnen Sie mit der Analyse der Probe(en).
   9. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen für Spannung, Arbeitsweg (WD) und Sondenstrom (PC) akzeptabel sind.
   10. Verkleinern Sie die Option für eine höhere Einstellung und vergrößern Sie sie für eine niedrigere Einstellung.
   11. Stellen Sie den Arbeitsabstand auf 10 mm ein.
   12. Stellen Sie vor der Aufnahme eines Bildes von Beispiel(en) sicher, dass das Bild im gewünschten Zielordner gespeichert wird.
   13. Um den gewünschten Ordner auszuwählen, klicken Sie auf die Einstellungen (oben links auf dem Bildschirm).
   14. Exportieren Sie die Bilder vom Computer über ein Flash-Laufwerk.
3. Ausschalten
   1. Klicken Sie auf OBSERVE, um den Balken auszuschalten.
   2. Drücken Sie die VENT-Taste und warten Sie, bis sie nicht mehr blinkt.
   3. Während Sie darauf warten, dass die VENT-Taste nicht mehr blinkt, stellen Sie den Arbeitsabstand wieder auf 20 mm – 30 mm ein.
   4. Sobald die VENT-Taste nicht mehr blinkt, entladen Sie die Probe(en) vom Instrument.
   5. Drücken Sie die EVAC-Taste, und warten Sie, bis sie nicht mehr blinkt.
   6. Sobald die EVAC-Taste nicht mehr blinkt, verlassen Sie die Software und fahren Sie den Computer herunter.
   7. Drehen Sie den Schlüssel zum O-Symbol, um das Gerät vollständig auszuschalten.

5. Schnelle scan zyklische Voltammetrie-Tests

1. Verbinden Sie die Carbonfaser-Mikroelektrode mit Potentiostat und Kopfbühne zusammen mit der Ag/AgCl-Referenzelektrode.
2. Senken Sie mit dem Mikromanipulator die Kohlefaser-Mikroelektrode gut in die Durchflusszelle, indem Sie die X-, Y- und Z-Messknöpfe manuell einstellen.
3. Pufferlösung in DI-Wasser (131,5 mM NaCl, 3,25 mM KCl, 1,2 mM CaCl₂, 1,25 mM NaH₂PO₄, 1,2 mM MgCl₂und 2,0 mM Na₂SO₄ mit dem pH-Wert auf 7,4) zubereiten.
4. Füllen Sie die Durchflusszelle mit Phosphatgepufferten(PBS) Puffer (pH = 7.4).
5. Mit einer gefüllten 60 ml Pufferspritze den PBS-Puffer bei ca. 1 ml/min in die Durchflusszelle einspritzen.
6. Legen Sie die Elektrode in die Durchflusszelle und wenden Sie die Wellenform an, indem Sie die grüne Taste drücken. Beobachten Sie das Oszilloskop und schneiden Sie entweder die Elektrode oder passen Sie die Verstärkung an, um eine Überlastung zu vermeiden. Lassen Sie ca. 10 min Ausgleich zwischen jedem Elektrodenlauf zu.
7. Legen Sie die Standard-Wellenform auf die Dopamin-Wellenform fest. Scannen von – 0,4 V bis 1,3 V bei 10 Hz und 400 V/s.
8. Bereiten Sie Stammlösung von 10 mM Dopamin, Serotonin, Noradrenalin, und andere in Perchlorsäure. Verdünnen Sie Neurochemikalien bis zur Endkonzentration von 1 M im Puffer, indem Sie 1 m der Dopamin-Stammlösung in 10 ml PBS-Puffer mit einer Pipette pipetieren.
9. Um mit den Messungen zu beginnen, drücken Sie die Aufnahmetaste. Nach 10 s, injizieren 0,2 ml von 1 M Dopamin in die Durchflusszelle oder jede andere Konzentration von Neurotransmitter. Passen Sie die Konzentration, Scanrate, Wellenform (Haltepotenzial oder Schaltpotential) entsprechend an. Legen Sie die Gesamtlaufzeit auf 30 s fest.
10. Analysieren Sie den Lauf mit der HDCV-Analysesoftware. Ändern Sie die Parameter nach Bedarf.
11. Nach Abschluss des Experiments reinigen Sie die Durchflusszelle, indem Sie jeweils 3 ml Wasser injizieren und dann dreimal in die Puffer- und Injektionsöffnungen der Durchflusszelle einspeisen.
12. Schalten Sie die Wellenform und das Instrument aus.

Ergebnisse

Für Abbildung 1zeigen wir einen Schaltplan, bei dem FSCV-Tests verwendet werden, um die Konzentration von Neurotransmittern in vitro zu messen. Abbildung 1 zeigt die angewendete Dopamin-Wellenform. Die Dreieckswellenform scannt von -0,4 V bis 1,3 V bei 400 V/s. Im zweiten Teil der Figur links zeigt es die Oxidation von Dopamin zu Dopamin-Ortho-Chinon (DOQ), ein zwei Elektronentransfer-Prozess tritt von der Oberfläche des Analyt...

Diskussion

In dieser Studie zeigen wir eine neuartige Methode zum Bau von Gold-Nanopartikel-modifizierten Kohlenstofffaser-Mikroelektroden für den Nachweis von Neurotransmittern wie Dopamin mit Hilfe von schneller zyklischer Voltammetrie. Die Methode ist ein effizienter, grüner und relativ kostengünstiger Ansatz zur Verbesserung der Empfindlichkeit der Biomoleküldetektion. Die Dicke des Goldes, das sich auf der Oberfläche der Kohlefaser ablagert, kann durch die Zeit der Elektrodeposition und die Konzentration von Gold in der E...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dopamine hydrochloride	Sigma Aldrich	H8502-5G
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	P5493-1L
Pine WaveNeuro Potentiostat	Pine Instruments	NEC-WN-BASIC	This orders comes in bulk with all other accessories such as headstages, adapters, cords, and other electronics
Pine Flow Cell and Micromanipulator	Pine Instruments	NEC-FLOW-1	This is also another bulk order including the micromanipulator, flow cell, knobs, tubing, connectors, etc.
Glass-Capillary	A-M Systems	602500
T-650 Carbon Fiber	Goodfellow	C 005711
Epon 828 Epoxy	Miller-Stephenson	EPON 828 TDS
Diethelynetriamine	Sigma Aldrich	D93856-5ML
Gold (III) chloride	Sigma Aldrich	254169	Comes as either HAuCl4 or AuCl3
pH meter	Fisher	S90528
Farraday Cage	AMETEK TMC	81-334-03
Syringe Pump	NEW ERA PUMP	NE-1000
Eppendorf Pipettes and Tips	Eppendorf	2231000222	This is also a bulk order containing multiple pipettes and tips
10 -1,000 mL beakers	VWR	10536-390
Carbon fiber	Goodfellow	C 005711
SEM	JEOL	JSM-IT100