向外观察:分离氰化物释放的碳水化合物聚合物和蛋白质

摘要

这里描述了分离蓝藻释放的碳水化合物聚合物和分离其外蛋白酶的协议。这两种程序都体现了获得高纯度聚合物或蛋白质的关键步骤,可用于进一步分析或应用。它们也可以根据特定的用户需求轻松调整。

摘要

蓝藻可以主动将多种生物分子分泌到细胞外环境中,如异质多糖和蛋白质。这些生物分子的鉴定和表征可以增进有关其分泌途径的知识,并有助于操纵它们。此外,其中一些生物分子在生物技术应用方面也很有趣。这里描述了两个协议,用于轻松和快速分离蓝藻释放的碳水化合物聚合物和蛋白质。释放的碳水化合物聚合物的分离方法基于使用有机溶剂在水溶液中多糖的传统沉淀技术。这种方法保留了聚合物的特性,同时避免了来自细胞碎片和培养基培养物的污染物的存在。在工艺结束时,冻干聚合物可供使用或定性,或可以进行进一步轮纯化,具体取决于最终预期用途。关于蓝藻外蛋白酶的分离,该技术基于通过离心和过滤去除主要污染物后无细胞介质的浓度。这种策略允许通过膜转运器或外膜囊泡可靠地分离通过细胞外环境的蛋白质。这些蛋白质随后可以使用标准质谱技术进行识别。这里提出的协议不仅适用于广泛的蓝藻,而且还适用于其他细菌菌株。此外,这些程序可以很容易地根据产品的最终用途、所需的纯度和细菌菌株进行定制。

引言

蓝藻被广泛认为是天然产品的丰富来源,具有广阔的生物技术/生物医学应用。因此,了解蓝藻分泌机制和优化提取/回收方法对于将蓝藻作为高效的微生物细胞工厂实施至关重要。

许多蓝藻菌株能够产生细胞外聚合物物质(EPS),主要由异聚糖形成,这些物质仍然与细胞表面相关或释放到^介质1中。与其他细菌相比,这些释放的碳水化合物聚合物具有明显的特性,这使得它们适用于广泛的应用(例如,抗病毒药物2、免疫刺激3、抗氧化剂4、金属夹合5,乳化6,和药物输送剂7,8。分离这些聚合物的方法不仅有助于提高产量,而且有助于提高纯度,提高聚合物获得的具体物理^特性。绝大多数这些方法分离聚合物依赖于沉淀策略从培养基,很容易完成由于聚合物的强烈电子性质9,10。此外,通过蒸发和/或冻干,可以迅速去除沉淀步骤中使用的溶剂。根据所预见的应用,在聚合物沉淀之后或之前可以耦合不同的步骤,以便定制最终产品,包括三氯乙酸 (TCA) 处理、过滤或尺寸排除色谱 (SEC)列^净化10.

蓝藻也能够通过依赖膜输送器(经典)11或囊泡(非经典)12的通道分泌多种蛋白质。因此,分析蓝藻外蛋白体是了解/操纵蓝藻蛋白分泌机制和了解这些蛋白质的具体细胞外功能的重要工具。对外蛋白酶的可靠分离和分析需要细胞外环境的浓度,因为分泌蛋白质的丰度相对较低。此外,其他物理或化学步骤(例如离心、过滤或蛋白质沉淀)可以优化获得的外乳激素的质量,丰富蛋白质^含量13,并避免污染物的存在(例如,色素、碳水化合物等)^14,15或细胞内蛋白质在样本中的优势。然而,其中一些步骤也可能限制可以检测到的蛋白质集,从而导致有偏差的分析。

本作品描述了从蓝藻培养培养物中分离释放的碳水化合物聚合物和外丙酮的有效方案。这些协议可以很容易地适应研究的具体目标和用户需求,同时保持此处介绍的基本步骤。

研究方案

1. 氰化物释放碳水化合物聚合物分离

1. 聚合物分离和去除污染物
   1. 在标准条件下培养蓝藻菌株[例如,在 12 小时光 (50 μE m^{+ 2}s⁺¹) /12 h 暗方案下 30°C,在 150 rpm 下的轨道抖动]。使用标准方案测量生长(例如,730 nm (OD_730nm)、叶绿素 a、干重等光学密度,然后根据苯酚-硫酸方法¹⁶测量释放多糖的产量。
   2. 将培养层转移到透析膜(分子量截止的12-14 kDa)中,对至少10卷脱离子水进行透析,持续搅拌24小时。
      注:根据透析的培养量和介质成分,可能需要更换透析水。
   3. 在 4°C 下在 15,000 x g下将培养基离心 15 分钟。将上清液转移到新的小瓶,并丢弃颗粒(细胞)。
   4. 在 20,000 x g下在 4°C 下再次离心 15 分钟,以去除细胞壁碎屑或脂多糖 (LPS) 等污染物。
   5. 将上清液转移到玻璃烧杯中,然后丢弃颗粒。
2. 聚合物的沉淀
   1. 将 2 卷 96% 乙醇添加到上清液中。
   2. 在4°C下孵育悬浮液,至少过夜。
   3. 聚合物回收
      1. 对于少量或不可见的沉淀聚合物:在 4°C 下将悬浮液在 13,000 x g下离心 25 分钟。丢弃上清液,将颗粒重新悬浮在 1 mL 或 2 mL 的灭菌脱离子水中。将水悬架转移到小瓶中。
         注意:上清液应轻轻丢弃,因为它很容易重新悬浮。
      2. 对于可见/大量沉淀聚合物:将沉淀的聚合物与无菌金属钳子收集到小瓶中。挤压聚合物并丢弃多余的乙醇。
   4. 可选:根据所需的聚合物纯化程度,在去离子水中重新悬浮聚合物后,用 96% 乙醇重复沉淀步骤。
3. 聚合物的冻干
   1. 将沉淀聚合物的小瓶保持在-80°C,至少过夜。
   2. 冷冻干燥(冻干)聚合物至少48小时(不要让悬浮液在冷冻干燥前解冻)。
   3. 将干燥的聚合物储存在室温 (RT) 下,直到进一步使用。
      注意:建议将聚合物存放在干燥器中,因为它可以随着时间的推移吸收水分。

2. 青氧杆菌外蛋白酶分离

1. 中等浓度
   1. 在标准条件下培养蓝藻[例如,在12小时光(50μE m⁺²s +1)/12小时暗团下30°C,在150rpm下轨道晃动]。使用标准程序(例如,OD_730nm、叶绿素a、干重等)监测氰球菌生长。
   2. 在 4,000 x g下离心培养物,在 RT 下 10 分钟。
   3. 将上清液转移到烧瓶中,并丢弃细胞颗粒。
   4. 通过 0.2 μm 孔径过滤器过滤变形介质。
      注:如果介质保持在 4°C,则协议可以在这里暂停一小段时间。
   5. 使用标称分子量截止为 3 kDa 的离心集中器,将介质浓缩约 500x(考虑过滤介质的初始体积)。入离应在 4,000 x g(最大1 h% 离心圆)的 15°C 下操作。
      注意:对于大多数集中器品牌,过滤器设备在使用前需要用超纯水离心冲洗。过滤器变湿后,不要让其干燥。不使用设备时,在储液罐上留有足够的液体。
      注:如果目的是研究蛋白质活性,将离心温度降低至4°C可能会有所帮助,但会增加样品浓度所需的时间。如果介质保持在 4°C,则协议可以在离心步骤之间短暂暂停。
   6. 用浓缩样品冲洗过滤装置样品储液罐的壁,并将内容转移到微离心管中。
   7. 使用灭基培养基对过滤装置样品储液罐执行额外的洗涤步骤,以确保最大的外蛋白酶恢复。
      注:要量化回收百分比,请按照特定制造商的说明进行操作。
   8. 将外蛋白酶样品储存在-20°C,直到进一步使用。
      注:建议在长期储存中添加蛋白酶抑制剂。
2. 外蛋白酶分析
   1. 根据制造商的说明,通过 96 孔板中的 BCA 蛋白质测定量量化蛋白质含量。
   2. 使用标准染色方案(例如,Coomassie 蓝色、银色染色)通过硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离蛋白质。
   3. 切出感兴趣的带/凝胶区域,并将其收集到含有适当体积超纯水的不同微离心管中。
   4. 通过质谱法对蛋白质进行鉴定和分析。

结果

图1描述了从蓝藻培养物中提取释放的碳水化合物聚合物的方法的原理图表示。图2显示了来自中度EPS生产商青霉素合成细胞的沉淀聚合物PCC 6803和高效EPS生产商Cyanothece sp.CCY 0110。 图3显示了不同程度污染的冻干聚合物,突出了离心步骤对最终产品纯度的重要性。图4描述了蓝藻外蛋白酶的隔离方法?...

讨论

为了更好地了解细菌分泌机制和研究已释放的产品,证明在细胞外细菌环境中(如释放)中存在的生物分子的有效分离和分析具有极其重要的意义。碳水化合物聚合物和蛋白质)。

青基体细胞外碳水化合物聚合物极其复杂,主要是由于构成其^成分1的不同单糖的数量和比例。用于分离这些聚合物物质的传统方法依赖于一个简单的概念,即这些富含糖的物质可溶于水溶?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dialysis membranes	Medicell Membranes Ltd	DTV.12000.07	Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll
Ethanol 96%	AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A.	4.000.02.02.00	Fermentation ethyl alcohol 96% AGA
PES Filter 0.2 μm	Fisher Scientific, Lda	15206869	Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR
Amicon Ultra-15, Ultracel-3K	Merck Millipore Ltd.	UFC900324	Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay	Fisher Scientific, Lda	10741395	Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration
Brillant Blue G Colloidal Concentrate	Sigma Aldrich Química SL	B2025-1EA	Coomassie blue