Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins Looking Outward

Résumé

Ici, des protocoles pour l'isolement des polymères de glucides libérés de cyanobactérien et l'isolement de leurs exoprotémomes sont décrits. Les deux procédures incarnent des étapes clés pour obtenir des polymères ou des protéines avec des degrés de haute pureté qui peuvent être utilisés pour une analyse ou des applications plus approfondies. Ils peuvent également être facilement adaptés en fonction des besoins spécifiques de l'utilisateur.

Résumé

Les cyanobactéries peuvent sécréter activement un large éventail de biomolécules dans l'environnement extracellulaire, comme les hétéropolysaccharides et les protéines. L'identification et la caractérisation de ces biomolécules peuvent améliorer les connaissances sur leurs voies de sécrétion et aider à les manipuler. En outre, certaines de ces biomolécules sont également intéressantes en termes d'applications biotechnologiques. Décrit ici sont deux protocoles pour l'isolement facile et rapide des polymères et des protéines de hydrate de carbone libérés de cyanobacterial. La méthode d'isolement des polymères de glucides libérés est basée sur les techniques conventionnelles de précipitation des polysaccharides dans des solutions aqueuses utilisant des solvants organiques. Cette méthode préserve les caractéristiques du polymère et évite simultanément la présence de contaminants provenant des débris cellulaires et du milieu de culture. À la fin du processus, le polymère lyophilisé est prêt à être utilisé ou caractérisé ou peut être soumis à d'autres tours de purification, selon l'utilisation finale prévue. En ce qui concerne l'isolement de l'exoprotéome cyanobactérien, la technique est basée sur la concentration du milieu sans cellules après l'élimination des principaux contaminants par centrifugation et filtration. Cette stratégie permet un isolement fiable des protéines qui atteignent le milieu extracellulaire par l'intermédiaire de transporteurs membranaires ou de vésicules de membrane externe. Ces protéines peuvent être identifiées par la suite à l'aide de techniques standard de spectrométrie de masse. Les protocoles présentés ici peuvent être appliqués non seulement à un large éventail de cyanobactéries, mais aussi à d'autres souches bactériennes. En outre, ces procédures peuvent être facilement adaptées en fonction de l'utilisation finale des produits, degré de pureté requis, et souche bactérienne.

Introduction

Les cyanobactéries sont largement reconnues comme des sources prolifiques de produits naturels avec des applications biotechnologiques/biomédicales prometteuses. Par conséquent, la compréhension des mécanismes de sécrétion cyanobactérienne et l'optimisation des méthodes d'extraction/récupération sont essentielles pour mettre en œuvre des cyanobactéries en tant qu'usines efficaces de cellules microbiennes.

De nombreuses souches cyanobactériennes sont capables de produire des substances polymères extracellulaires (EPS), principalement formées par des hétéropolysaccharides, qui restent associées à la surface cellulaire ou sont libérées dans le milieu¹. Ces polymères de glucides libérés ont des caractéristiques distinctes par rapport à ceux d'autres bactéries, qui les rendent appropriés pour un large éventail d'applications (par exemple, les antiviraux², immunostimulatoire³, antioxydant⁴, métal-chéating⁵, émulsionnant⁶, et les agents de livraison de médicaments^7,8). La méthodologie pour l'isolement de ces polymères contribue en grande partie non seulement à l'amélioration du rendement, mais aussi à l'augmentation de la pureté et les propriétés physiques spécifiques du polymère obtenu⁹. Une grande majorité de ces méthodes d'isolement des polymères s'appuient sur des stratégies de précipitation du milieu de culture qui sont facilement réalisées en raison de la forte nature anionique du polymère^9,10. En outre, l'élimination des solvants utilisés dans l'étape de précipitation peut être rapidement réalisée par évaporation et/ou lyophilisation. Selon l'application prévue, différentes étapes peuvent être couplées après ou avant la précipitation de polymère afin d'adapter le produit final, qui incluent le traitement d'acide trichloroacétique (TCA), la filtration, ou la chromatographie d'exclusion de taille (SEC) la purification de colonne¹⁰.

Les cyanobactéries sont également capables de sécrétiser un large éventail de protéines à travers des voies dépendantes des transporteurs membranaires (classiques)¹¹ ou médiées par des vésicules (non classiques)¹². Par conséquent, l'analyse de l'exoprotéome cyanobactérien constitue un outil essentiel, à la fois pour comprendre / manipuler les mécanismes de sécrétion de protéines cyanobactériennes et de comprendre la fonction extracellulaire spécifique de ces protéines. L'isolement et l'analyse fiables des exoprotéméomes exigent la concentration du milieu extracellulaire, puisque l'abondance des protéines sécrétées est relativement faible. En outre, d'autres étapes physiques ou chimiques (p. ex. centrifugation, filtration ou précipitation sinique) peuvent optimiser la qualité de l'exoprotémome obtenu, enrichir la teneur en protéines¹³et éviter la présence de contaminants (p. ex., pigments, glucides, etc. ) ^{14 (en) , 15} ou la prédominance des protéines intracellulaires dans les échantillons. Cependant, certaines de ces étapes peuvent également restreindre l'ensemble de protéines qui peuvent être détectées, conduisant à une analyse biaisée.

Ce travail décrit des protocoles efficaces pour l'isolement des polymères et exoprotéomes de glucides libérés des médias de culture de cyanobactéries. Ces protocoles peuvent être facilement adaptés aux objectifs spécifiques de l'étude et aux besoins des utilisateurs, tout en maintenant les étapes de base présentées ici.

Protocole

1. Isolement de polymère de hydrate de carbone libéré de cyanobactérien

1. Isolement des polymères et élimination des contaminants
   1. Cultiver la souche cyanobactérienne dans des conditions standard [p. ex., 30 oC sous une lumière de 12 h (50 e m²s¹)/12 h de régime foncé, avec une secousse orbitale à 150 tr/min]. Mesurer la croissance à l'aide de protocoles standard [p. ex., densité optique à 730 nm (OD_730nm),chlorophylle a, poids sec, etc.], puis mesurer la production de polysaccharides libérés selon la méthode de l'acide phénol-sulfurique¹⁶.
   2. Transférer la culture dans des membranes de dialyse (12-14 kDa de coupure de poids moléculaire) et dialyser contre un minimum de 10 volumes d'eau déionisée pendant 24 h avec une agitation continue.
      REMARQUE : Selon le volume de culture à dialyser et à composer à moyen terme, il peut être nécessaire de changer l'eau de dialyse.
   3. Centrifuger la culture à 15 000 x g pendant 15 min à 4 oC. Transférer le supernatant dans une nouvelle fiole et jeter la pastille (cellules).
   4. Centrifugeuse à nouveau à 20 000 x g pendant 15 min à 4 oC pour éliminer les contaminants tels que les débris de la paroi cellulaire ou les lipopolysaccharides (LPS).
   5. Transférer le supernatant dans un bécher en verre et jeter la boulette.
2. Précipitation du polymère
   1. Ajouter 2 volumes d'éthanol à 96 % au supernatant.
   2. Incuber la suspension à 4 oC, au moins toute la nuit.
   3. Récupération des polymères
      1. Pour les petites quantités ou non visibles de polymère précipité : centrifugeuse de la suspension à 13 000 x g pendant 25 min à 4 oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 1 ml ou 2 ml d'eau désionisée autoclaved. Transférer la suspension aqueuse sur une fiole.
         CAUTION: Le supernatant doit être jeté doucement, car il peut devenir facilement suspendu.
      2. Pour les quantités visibles/grandes de polymère précipité : ramassez le polymère précipité avec des forceps métalliques stériles à un flacon. Pressez le polymère et jetez l'excès d'éthanol.
   4. Facultatif : selon le degré de purification des polymères requis, répétez l'étape de précipitation avec 96 % d'éthanol après la résuspension des polymères dans l'eau déionisée.
3. Lyophilisation du polymère
   1. Gardez les flacons avec le polymère précipité à -80 oC, au moins toute la nuit.
   2. Lyophiliser le polymère pendant au moins 48 h (ne laissez pas la suspension décongeler avant le lyophilisation).
   3. Conserver le polymère séché à température ambiante (RT) jusqu'à ce qu'il soit utilisé davantage.
      REMARQUE : Il est conseillé de stocker le polymère dans un dessiccateur, car il peut absorber l'eau au fil du temps.

2. Isolement d'exoprotéome cyanobactérien

1. Concentration moyenne
   1. Cultiver des cyanobactéries dans des conditions standard [p. ex., 30 oC sous une lumière de 12 h (50 e m²s¹)/12 h de régime sombre, avec une secousse orbitale à 150 tr/min]. Surveiller la croissance du cyanobacterium à l'aide de procédures standard (p. ex._{730 nm}OD, chlorophylle a, poids sec, etc. ).
   2. Centrifugeles les cultures à 4 000 x g, pour 10 min à RT.
   3. Transférer le supernatant dans une fiole et jeter le granule de cellule.
   4. Filtrer le milieu décanté à l'intermédiaire d'un filtre de taille pore de 0,2 m.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici pendant une courte période de temps, si le milieu est maintenu à 4 oC.
   5. Concentrez le milieu environ 500x (compte tenu du volume initial du milieu filtré), en utilisant des concentrateurs centrifuges avec une coupure de poids moléculaire nominale de 3 kDa. La centrifugation doit être opérée à 4 000 x g (maximum 1 h par centrifugation) à 15 oC.
      CAUTION: Pour la majorité des marques de concentrateurs, le dispositif de filtre doit être rincé par centrifugation avec de l'eau ultrapure avant utilisation. Une fois que le filtre est mouillé, ne le laissez pas sécher. Laissez suffisamment de liquide sur le réservoir lorsque l'appareil n'est pas utilisé.
      REMARQUE : La réduction de la température de centrifugation à 4 oC peut être utile si l'objectif est d'étudier l'activité protéique, bien qu'elle augmente le temps nécessaire à la concentration de l'échantillon. Le protocole peut être mis en pause entre les étapes de centrifugation pendant de courtes périodes de temps si le milieu est maintenu à 4 oC.
   6. Rincer les parois du réservoir d'échantillon de l'appareil filtre avec l'échantillon concentré et transférer le contenu dans un tube de microcentrifuge.
   7. Effectuer une étape de lavage supplémentaire du réservoir d'échantillon de dispositif de filtre avec le milieu de culture autoclaved pour assurer la récupération maximale d'exoprotémome.
      REMARQUE : Pour quantifier le pourcentage de récupération, suivez les instructions du fabricant spécifique.
   8. Conserver les échantillons d'exoprotémome à -20 oC jusqu'à ce qu'ils soient utilisés davantage.
      REMARQUE : L'ajout d'inhibiteurs de la protéase est recommandé pour le stockage à long terme.
2. Analyse de l'exoprotéome
   1. Quantifier la teneur en protéines par l'analyse des protéines BCA dans une assiette de 96 puits selon les instructions du fabricant.
   2. Séparez les protéines par l'électrophores gel de sulfate-polyacrylamide de dodecyl de sodium (SDS-PAGE), en utilisant des protocoles de coloration standard (p. ex., bleu Coomassie, coloration argentée).
   3. Découpez les bandes/gel régions d'intérêt et collectez-les dans différents tubes de microcentrifuge contenant des volumes appropriés d'eau ultra-pure.
   4. Procéder à l'identification et à l'analyse des protéines par spectrométrie de masse.

Résultats

Une représentation schématique de la méthode décrite pour extraire les polymères de glucides libérés des cultures cyanobactériennes est représentée dans la figure 1. Les polymères précipités du producteur modéré d'EPS cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 et l'efficace producteur d'EPS Cyanothece sp. CCY 0110 sont présentés à la figure 2. Dans la figure 3, les polymères lyophilisés avec diff...

Discussion

Pour mieux comprendre les mécanismes de sécrétion bactérienne et étudier les produits libérés, il est d'une extrême importance de démontrer l'isolement efficace et l'analyse des biomolécules présentes dans l'environnement bactérien extracellulaire (tels que libérés polymères et protéines).

Les polymères de glucides extracellulaires cyanobactériens sont extrêmement complexes, principalement en raison du nombre et de la proportion de différents monosaccharides qui constituent...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dialysis membranes	Medicell Membranes Ltd	DTV.12000.07	Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll
Ethanol 96%	AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A.	4.000.02.02.00	Fermentation ethyl alcohol 96% AGA
PES Filter 0.2 μm	Fisher Scientific, Lda	15206869	Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR
Amicon Ultra-15, Ultracel-3K	Merck Millipore Ltd.	UFC900324	Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay	Fisher Scientific, Lda	10741395	Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration
Brillant Blue G Colloidal Concentrate	Sigma Aldrich Química SL	B2025-1EA	Coomassie blue