JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, siyanobakteryal serbest karbonhidrat polimerlerinin izolasyonu ve exoproteomlarının izolasyonu için protokoller açıklanmıştır. Her iki prosedür de, daha fazla analiz veya uygulama için kullanılabilecek yüksek saflık derecelerine sahip Polimerler veya proteinleri elde etmek için önemli adımları somutlaştırmak. Ayrıca, belirli kullanıcı ihtiyaçlarına göre kolayca adapte edilebilir.

Özet

Siyanobacteria, heteropolizakkaritler ve proteinler gibi, geniş bir yelpazede biomolekülleri hücre içi ortama aktif olarak salgılasabilir. Bu Biomoleküllerin tanımlanması ve karakterize edilmesi, salgısı yolları hakkında bilgi geliştirebilir ve onları manipüle etmenize yardımcı olabilir. Ayrıca, bu biyomoleküllerin bazıları da biyoteknolojik uygulamalar açısından ilginç. Burada açıklanan cyanobacterial serbest karbonhidrat polimerleri ve proteinlerin kolay ve hızlı yalıtım için iki protokol vardır. Yayımlanan karbonhidrat polimerlerinin yalıtım yöntemi, organik çözücüler kullanarak sulu çözümlerde polisakkaritlerin geleneksel yağış tekniklerini temel alır. Bu yöntem polimer özelliklerini korur ve aynı anda hücre enkaz ve kültür ortamından kirleticilerin varlığını önler. Sürecin sonunda, liyofilize polimer kullanılmak üzere hazır veya karakterize veya son amaçlanan kullanıma bağlı olarak, arıtma daha fazla tur maruz kalabilirler. Cyanobacterial exoproteomun izolasyonu ile ilgili olarak, teknik, büyük kirleticilerin santrifüjleme ve filtrasyon ile kaldırılmasından sonra hücre içermeyen ortamın konsantrasyonuna dayanır. Bu strateji, membran taşıyıcıları veya dış membran veziküller üzerinden ekstrülüler ortama ulaşan proteinleri güvenilir bir şekilde yalıtmayı sağlar. Bu proteinler daha sonra standart kütle spektrometresi teknikleri kullanılarak tespit edilebilir. Burada sunulan protokoller sadece geniş bir siyanobacteria yelpazesine değil, aynı zamanda diğer bakteriyel suşların da uygulanabilmektedir. Ayrıca, bu prosedürler, ürünlerin son kullanımına, gerekli saflık derecesine ve bakteriyel gerilime göre kolayca uyarlanmış olabilir.

Giriş

Siyanobacteria, umut verici biyoteknolojik/biyomedikal uygulamalar ile doğal ürünlerin üretken kaynakları olarak yaygın olarak tanınır. Bu nedenle, siyanobakteryal salgılanma mekanizmaları ve ekstraksiyon/kurtarma yöntemlerinin optimizasyonu anlayışı, etkili mikrobiyal hücre fabrikaları olarak siyanobasitemi uygulamak için esastır.

Birçok siyanobacterial suşları, ağırlıklı olarak heteropolizakkaritler tarafından oluşturulan, hücre yüzeyine ilişkili kalan veya orta1' e serbest bırakılan, ekstrülüler polimerik maddeler (EPS) üretebilir. Bu serbest karbonhidrat polimerleri, diğer bakterilere kıyasla farklı özelliklere sahiptir, bu da onları geniş bir uygulama yelpazesi için uygun hale getiren (örn., antiviral2, immünostimulatuar3, antioksidan4, Metal-şelasyon5, Emulsifying6, ve ilaç teslim ajanlar7,8). Bu polimerlerin yalıtım metodolojisi büyük ölçüde sadece geliştirilmiş verim için değil, aynı zamanda artan saflık ve polimerin spesifik fiziksel özellikleri elde9katkıda bulunur. Polimerlerin izolasyonu için bu yöntemlerin büyük bir çoğunluğu, polimer güçlü anyonik doğa9,10nedeniyle kolayca gerçekleştirilen kültür ortamından yağış stratejileri güveniyor. Ayrıca, yağış adımda kullanılan çözücüler kaldırılması hızla buharlaşma ve/veya lyophilization ile elde edilebilir. Öngörülen uygulamaya bağlı olarak, trichloroasetik asit (TCA) tedavisi, filtrasyon veya boyut dışlama Kromatografi (SEC) dahil olmak üzere son ürünü terzi etmek için polimer yağışından sonra veya önce farklı adımlar birleştirilebilir. sütun arıtma10.

Cyanobacteria da membran taşıyıcıları (klasik)11 veya veziküller (klasik olmayan)12tarafından aracılı bağlı yollar aracılığıyla çeşitli proteinleri salgılayarak edebiliyoruz. Bu nedenle, siyanobakterial dış proteomun analizi, siyanobacterial protein salgısı mekanizmalarını anlamak/manipüle etmek ve bu proteinlerin belirli bir hücre dışı fonksiyonunu anlamak için önemli bir araçtır. Gizli proteinlerin bolluğu nispeten düşük olduğu için, exoproteomlerin güvenilir yalıtımı ve analizi, ekstrüler ortamın konsantrasyonunu gerektirir. Buna ek olarak, diğer fiziksel veya kimyasal adımlar (örneğin, santrifüjleme, filtrasyon veya protein yağış) elde edilen dış proteomun kalitesini optimize edebilir, protein içeriği13' ü zenginleştirebilir ve kirleticilerin varlığını önleyerek (örn. Pigmentler, karbonhidratlar, vb.) 14 , 15 veya numunelerde hücre içi proteinlerin üstünlüğü. Ancak, bu adımlardan bazıları da tespit edilebilir protein kümesini kısıtlayabilir, önyargılı bir analiz yol.

Bu çalışma, serbest karbonhidrat polimerleri ve siyanobacteria kültür medyadan exoproteomes izolasyonu için etkili protokoller açıklar. Bu protokoller, burada sunulan temel adımları korurken, çalışmanın belirli hedeflerine ve Kullanıcı ihtiyaçlarına kolayca adapte edilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. siyanobacterial serbest karbonhidrat polimer yalıtım

  1. Polimer yalıtım ve kirleticilerin çıkarılması
    1. Standart koşullar altında siyanobacterial gerginliği geliştirin [Örneğin, 12 saat ışık altında 30 °C (50 μE m− 2s− 1)/12 h karanlık rejim, 150 RPM 'de orbital sallayarak). Standart protokolleri kullanarak büyüme ölçmek [örn., 730 nm optik yoğunluğu (OD730nm), klorofil a, Kuru ağırlık, vb], sonra fenol-sülfürik asit yöntemine göre yayımlanan polisakkaritler üretimini ölçmek16.
    2. Kültürü diyaliz membranlarına aktarın (12-14 molekül ağırlığı kesme kDa) ve sürekli karıştırma ile 24 saat boyunca en az 10 hacimde deiyonize suya karşı Dialyze edilir.
      Not: Dialyze ve orta kompozisyon kültür hacmine bağlı olarak, Dializ suyu değiştirmek için gerekli olabilir.
    3. 4 °C ' de 15 dakika için 15.000 x g 'de kültürü santrifüjle. Yeni bir şişeye süpernatant aktarmak ve Pelet (hücreler) atın.
    4. Hücre duvarı enkaz veya lipopolysaccharides (LPS) gibi kirleticileri kaldırmak için 4 °C ' de 15 dk 20.000 x g 'de tekrar santrifüjler.
    5. Süpernatant bir cam kabı aktarmak ve pellet atın.
  2. Polimer yağış
    1. Supernatant için 96% etanol 2 hacim ekleyin.
    2. Süspansiyonu 4 °C ' de en az bir gecede kulyın.
    3. Polimer geri kazanımı
      1. Küçük veya görünmez miktarda çöktürülmüş polimer için: süspansiyonu 13.000 x g 'de 25 dakika boyunca 4 °c ' de santrifüjler. Süpernatant atın ve 1 ml veya 2 ml otoklav deiyonize su Pelet pelletini. Sulu süspansiyonu bir şişeye aktarın.
        Dikkat: süpernatant kolayca resuspended hale gelebilir gibi, yavaşça atılmalıdır.
      2. Çöktürülmüş polimer görünür/büyük miktarlarda için: bir şişeye steril metal forseps ile çökelmiş polimer toplamak. Polimer sıkın ve aşırı etanol atın.
    4. Opsiyonel: gerekli polimer arıtma derecesine bağlı olarak, deiyonize suda polimerlerin Resuspension sonra% 96 etanol ile yağış adımı tekrarlayın.
  3. Polimerin lyophilization
    1. En az bir gecede-80 °C ' de çöktürülmüş polimer ile şişeleri tutun.
    2. Dondurma-kuru (lyophilize) en az 48 h için polimer (donma-kurutmadan önce süspansiyon defrost izin vermeyin).
    3. Daha fazla kullanım kadar oda sıcaklığında (RT) kurutulmuş polimer saklayın.
      Not: bir kurutucu içinde polimer depolamak tavsiye edilir, zaman içinde su absorbe gibi.

2. cyanobacterial exoproteome yalıtım

  1. Orta konsantrasyon
    1. Standart koşullarda siyanobacteria geliştirin [Örneğin, 12 saat ışık altında 30 °C (50 μE m− 2s− 1)/12 h karanlık rejim, 150 RPM 'de orbital sallayarak). Standart prosedürleri kullanarak siyanobacterium büyümesini izleyin (örn. , od730nm, klorofil a, Kuru ağırlık, vb.).
    2. 4.000 x g 'de kültürleri Santrifüjü , RT 'de 10 dk.
    3. Süpernatant bir Flask aktarmak ve hücre Pellet atın.
    4. 0,2 μm gözenek boyutu filtresiyle yapıştırılı ortamı filtreleyin.
      Not: ortam 4 °C ' de tutulduğunda protokol kısa bir süre için burada duraklatılabilir.
    5. 3 kDa nominal moleküler ağırlık kesme ile santrifüj Konsantratörleri kullanarak, orta yaklaşık 500x (filtrelenmiş orta ilk hacmi dikkate alınarak) konsantre. Santrifüjleme 15 °C ' de 4.000 x g (santrifüjleme başına maksimum 1 saat) olarak çalıştırılmalıdır.
      Dikkat: konsantratör markalarının çoğunluğu için, filtre cihazının kullanmadan önce Ultra Saf suyla santrifüjleme ile durulması gerekir. Filtre Islandıktan sonra, kurumasına izin vermeyin. Cihaz kullanılırken rezervuar üzerinde yeterli sıvı bırakın.
      Not: santrifüjleme sıcaklığını 4 °C ' ye düşürmek, amaç protein aktivitesini incelemek ise, numune konsantrasyonu için gerekli süreyi arttıracak olsa da yararlı olabilir. Ortam 4 °C ' de tutulduğunda, kısa zaman dilimleri için santrifüjleme adımları arasında protokol duraklatılabilir.
    6. Filtre cihazı örnek rezervuar duvarlarını konsantre örnekle durulayın ve içeriği bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    7. Maksimal exoproteome kurtarma sağlamak için Otoklavlanmış kültür orta ile filtre cihazı örnek rezervuar ek bir yıkama adım gerçekleştirin.
      Not: kurtarma yüzdesini ölçmek Için, belirli üreticinin talimatlarını izleyin.
    8. Exoproteome örneklerini daha fazla kullanıma kadar-20 °C ' de saklayın.
      Not: uzun süreli depolama için proteaz inhibitörlerinin eklenmesi önerilir.
  2. Exoproteome Analizi
    1. Üreticinin talimatlarına göre 96-Well plaka BCA protein tahlil tarafından protein içeriği ölçmek.
    2. Proteinleri, standart boyama protokolleri (örn. Coomassie mavi, gümüş boyama) kullanılarak sodyum dodecil sülfat-Poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) ile ayırın.
    3. İlgi bantları/jel bölgeleri kes ve ultra saf su uygun hacimleri içeren farklı mikrosantrifüjler tüpleri onları toplamak.
    4. Kütle spektrometresi ile proteinlerin tanımlanması ve analizine devam edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1' de, siyanobakteryal kültürlerden serbest bırakılan karbonhidrat polimerlerini ayıklamak için açıklanan yöntemin şematik bir gösterimi gösterilmiştir. Orta EPS üreticilerinden siyanobacterium Synechocystis Sp. pcc 6803 ve verimli EPS üreticisi cyanothece sp. ccy 0110 ' den çöktürülmüş polimerler Şekil 2' de gösterilir. Şekil 3' te, farklı kirlilik derecelerine sahip likofilize poli...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bakteriyel salgılanma mekanizmalarını daha iyi anlamak ve serbest bırakılan ürünleri incelemek için, ekstraselüler bakteriyel ortamda mevcut olan Biomoleküllerin verimli yalıtımı ve analizini göstermek çok önemlidir (örneğin, serbest karbonhidrat polimerler ve proteinler).

Siyanobacterial ekstraküler karbonhidrat polimerleri, özellikle kompozisyon1' i oluşturan farklı monosakkaritlerin sayısı ve oranı nedeniyle son derece karmaşıktır. Bu poli...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Fundo Europeu de desenvolvimento Regional (FEDER) fonları tarafından rekabetçilik 2020-Operacional YARıŞMA ve uluslararasılaşma programı (POCı), Portekiz 2020 ve Portekiz fonları ile FCT-Fundação para a Ciência e aracılığıyla finanse edilmiştir. bir Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino proje çerçevesinde POCI-01-0145-FEDER-028779 ve Grant SFRH/BD/99715/2014 (CF) üstün.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Dialysis membranesMedicell Membranes Ltd DTV.12000.07Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll 
Ethanol 96%AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A.4.000.02.02.00Fermentation ethyl alcohol 96% AGA
PES Filter 0.2 μmFisher Scientific, Lda15206869Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR 
Amicon Ultra-15, Ultracel-3KMerck Millipore Ltd.UFC900324Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa
Thermo Scientific Pierce BCA Protein AssayFisher Scientific, Lda10741395Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration
Brillant Blue G Colloidal Concentrate Sigma Aldrich Química SLB2025-1EACoomassie blue 

Referanslar

  1. Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
  2. Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
  3. Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
  4. Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
  5. Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
  6. Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
  7. Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206(2017).
  8. Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
  9. Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
  10. Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
  11. Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
  12. Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
  13. Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
  14. Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
  15. Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
  16. Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
  17. Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
  18. Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565(2015).
  19. Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , CRC Press. 343-358 (2016).
  20. Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
  21. Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
  22. Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyokimyasay 147ekstr ler karbonhidrat polimerleriserbest polisakkaritlerexoproteomsalg lanmassiyanobacteriaSynechocystis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır