Blick nach außen: Isolierung von cyanobakteriellen freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen

Carlos Flores; Paula Tamagnini

doi:10.3791/59590

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In diesem Artikel

Zusammenfassung
Zusammenfassung
Einleitung
Protokoll
Ergebnisse
Diskussion
Offenlegungen
Danksagungen
Materialien
Referenzen
Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier werden Protokolle zur Isolierung von cyanobakteriell freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und zur Isolierung ihrer Exoproteome beschrieben. Beide Verfahren verkörpern wichtige Schritte zur Gewinnung von Polymeren oder Proteinen mit hohen Reinheitsgraden, die für weitere Analysen oder Anwendungen verwendet werden können. Sie können auch einfach an die spezifischen Benutzerbedürfnisse angepasst werden.

Zusammenfassung

Cyanobakterien können aktiv eine Breite von Biomolekülen in die extrazelluläre Umgebung absondern, wie Heteropolysaccharide und Proteine. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Biomoleküle kann das Wissen über ihre Sekretionswege verbessern und helfen, sie zu manipulieren. Darüber hinaus sind einige dieser Biomoleküle auch im Hinblick auf biotechnologische Anwendungen interessant. Hier sind zwei Protokolle für eine einfache und schnelle Isolierung von cyanobakteriell freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Proteinen beschrieben. Das Verfahren zur Isolierung freigesetzter Kohlenhydratpolymere basiert auf konventionellen Fällungstechniken von Polysacchariden in wässrigen Lösungen mit organischen Lösungsmitteln. Dieses Verfahren bewahrt die Eigenschaften des Polymers und vermeidet gleichzeitig das Vorhandensein von Verunreinigungen aus Zellablagerungen und Kulturmedium. Am Ende des Prozesses ist das lyophilisierte Polymer einsatzbereit oder charakterisiert oder kann je nach Endverwendung weiteren Reinigungsrunden unterzogen werden. In Bezug auf die Isolierung des cyanobakteriellen Exproteoms basiert die Technik auf der Konzentration des zellfreien Mediums nach Entfernung der Hauptverunreinigungen durch Zentrifugation und Filtration. Diese Strategie ermöglicht eine zuverlässige Isolierung von Proteinen, die über Membrantransporter oder äußere Membranbläschen ins extrazelluläre Milieu gelangen. Diese Proteine können anschließend mit Standard-Massenspektrometrie-Techniken identifiziert werden. Die hier vorgestellten Protokolle können nicht nur auf eine breite Palette von Cyanobakterien angewendet werden, sondern auch auf andere Bakterienstämme. Darüber hinaus können diese Verfahren leicht auf die endgültige Verwendung der Produkte, den erforderlichen Reinheitsgrad und die Bakterienstämme zugeschnitten werden.

Einleitung

Cyanobakterien sind weithin als produktive Quellen von Naturprodukten mit vielversprechenden biotechnologischen/biomedizinischen Anwendungen anerkannt. Daher sind das Verständnis von cyanobakteriellen Sekretionsmechanismen und die Optimierung der Extraktions-/Wiederherstellungsmethoden unerlässlich, um Cyanobakterien als effiziente mikrobielle Zellfabriken zu implementieren.

Viele cyanobakterielle Stämme sind in der Lage, extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) herzustellen, die hauptsächlich durch Heteropolysaccharide gebildet werden, die mit der Zelloberfläche assoziiert bleiben oder in das Medium¹freigesetzt werden. Diese freigesetzten Kohlenhydratpolymere haben im Vergleich zu anderen Bakterien deutliche Eigenschaften, die sie für eine Vielzahl von Anwendungen (z. B. antivirale Mittel², immunstimulierend³, Antioxidans⁴, Metall-Chelatierung⁵, emulgierend⁶, und Drogen-Liefermittel⁷^,⁸). Die Methodik zur Isolierung dieser Polymere trägt nicht nur zu einer verbesserten Ausbeute bei, sondern auch zu erhöhter Reinheit und den spezifischen physikalischen Eigenschaften des erhaltenen Polymers⁹. Ein Großteil dieser Verfahren zur Isolierung der Polymere stützt sich auf Niederschlagsstrategien aus dem Kulturmedium, die aufgrund der starken anionischen Natur des Polymers leicht zu erreichen sind⁹^,¹⁰. Darüber hinaus kann die Entfernung der im Niederschlagsschritt verwendeten Lösungsmittel durch Verdunstung und/oder Lyophilisierung schnell erreicht werden. Je nach vorgesehener Anwendung können verschiedene Schritte nach oder vor der Polymerfällung gekoppelt werden, um das Endprodukt zuzuschneiden, einschließlich Trichloressigsäure (TCA) Behandlung, Filtration oder Größenausschlusschromatographie (SEC) Säulenreinigung¹⁰.

Cyanobakterien sind auch in der Lage, eine breite Palette von Proteinen durch Wege abhängig von Membrantransportern (klassisch)¹¹ oder vermittelt durch Vesikel (nicht-klassische)¹²zu sezernieren. Daher stellt die Analyse des cyanobakteriellen Exproteoms ein wesentliches Werkzeug dar, um sowohl cyanobakterielle Proteinsekretionsmechanismen zu verstehen/manipulieren als auch die spezifische extrazelluläre Funktion dieser Proteine zu verstehen. Zuverlässige Isolierung und Analyse von Exoproteomen erfordern die Konzentration des extrazellulären Milieus, da der Überfluss an abgesonderten Proteinen relativ gering ist. Darüber hinaus können andere physikalische oder chemische Schritte (z. B. Zentrifugation, Filtration oder Proteinfällung) die Qualität des erhaltenen Exoproteoms optimieren, den Proteingehalt¹³anreichern und das Vorhandensein von Verunreinigungen (z. B. Pigmente, Kohlenhydrate, etc.) ¹⁴ ^, ¹⁵ oder die Dominanz intrazellulärer Proteine in den Proben. Einige dieser Schritte können jedoch auch die Gruppe von Proteinen einschränken, die nachgewiesen werden können, was zu einer voreingenommenen Analyse führt.

Diese Arbeit beschreibt effiziente Protokolle zur Isolierung von freigesetzten Kohlenhydratpolymeren und Exoproteomen aus Cyanobakterien-Kulturmedien. Diese Protokolle können leicht an die spezifischen Ziele und Benutzerbedürfnisse der Studie angepasst werden, wobei die hier vorgestellten grundlegenden Schritte beibehalten werden.