Взгляд наружу: Изоляция цианобактериальных высвобождаемых углеводных полимеров и белков

Резюме

Здесь описаны протоколы изоляции цианобактериальных высвобождаемых углеводных полимеров и изоляции их экзопротеомов. Обе процедуры воплощают ключевые шаги для получения полимеров или белков с высокой степенью чистоты, которые могут быть использованы для дальнейшего анализа или применения. Они также могут быть легко адаптированы в соответствии с конкретными потребностями пользователей.

Аннотация

Цианобактерии могут активно выделять широкий спектр биомолекул во внеклеточной среде, таких как гетерополисачхариды и белки. Идентификация и характеристика этих биомолекул может улучшить знания об их путях секреции и помочь манипулировать ими. Кроме того, некоторые из этих биомолекул также интересны с точки зрения биотехнологических применений. Описаны два протокола для легкой и быстрой изоляции цианобактериальных высвобождаемых углеводных полимеров и белков. Метод изоляции высвобожденных углеводных полимеров основан на обычных методах осадков полисахаридов в вацвовых растворах с использованием органических растворителей. Этот метод сохраняет характеристики полимера и одновременно позволяет избежать присутствия загрязняющих веществ из клеточного мусора и культуры среды. В конце процесса лиофилизированный полимер готов к использованию или характеристике или может быть подвергнут дальнейшим раундам очистки, в зависимости от конечного предназначенного использования. Что касается изоляции цианобактериального экзопротеома, метод основан на концентрации среды, свободной от клеток, после удаления основных загрязнителей путем центрифугации и фильтрации. Эта стратегия позволяет обеспечить надежную изоляцию белков, которые достигают внеклеточной среды через мембранные транспортеры или внешние мембранные пузырьки. Эти белки могут быть впоследствии идентифицированы с помощью стандартных методов масс-спектрометрии. Представленные здесь протоколы могут применяться не только к широкому спектру цианобактерий, но и к другим бактериальным штаммам. Кроме того, эти процедуры могут быть легко с учетом окончательного использования продуктов, степень чистоты требуется, и бактериальный штамм.

Введение

Цианобактерии широко признаны в качестве плодовитых источников натуральных продуктов с перспективными биотехнологическими/биомедицинскими применениями. Поэтому понимание механизмов секреции цианобактерий и оптимизация методов извлечения/восстановления необходимы для внедрения цианобактерий как эффективных фабрик микробных клеток.

Многие цианобактериальные штаммы способны производить внеклеточные полимерные вещества (EPS), в основном образованные гетерополисахаридов, которые остаются связаны с поверхностью клетки или высвобождаются в среду¹. Эти выпущенные углеводные полимеры имеют различные особенности по сравнению с другими бактериями, которые делают их пригодными для широкого спектра применений (например, противовирусные², иммуностимулятор³, антиоксидант⁴, металл-хелатирование⁵, эмульгирующий^6,и агенты доставки лекарств^7,8). Методология изоляции этих полимеров во многом способствует не только повышению урожайности, но и повышению чистоты и специфических физических свойств полученного⁹полимера. Подавляющее большинство из этих методов для изоляции полимеров полагаться на осадки стратегии из культуры среды, которые легко достигается из-за сильной анионической природы полимера^9,10. Кроме того, удаление растворителей, используемых в шаге осадков, может быть быстро достигнуто путем испарения и/или лиофилизации. В зависимости от предполагаемого применения, различные шаги могут быть соединены либо после или до выпадения полимера для того, чтобы адаптировать конечный продукт, который включает в себя трихлороацетической кислоты (TCA) лечение, фильтрация, или размер исключения хроматографии (SEC) очистка столбца¹⁰.

Цианобактерии также способны выделять широкий спектр белков через пути, зависящие от мембранных транспортеров (классические)¹¹ или опосредованных пузырьками (неклассическими)¹². Таким образом, анализ цианобактериального экзопротеома представляет собой важный инструмент, как понять / манипулировать механизмами секреции цианобактерий белка и понять специфическую внеклеточную функцию этих белков. Надежная изоляция и анализ экзопротеомов требуют концентрации внеклеточной среды, так как обилие выделяемых белков относительно низкое. Кроме того, другие физические или химические шаги (например, центрифугация, фильтрация или протеиновые осадки) могут оптимизировать качество полученного экзопротеома, обогащая содержание белка¹³и избегая присутствия загрязняющих веществ (например, пигменты, углеводы и т.д.. . ^{14 Год , 15} или преобладание внутриклеточных белков в образцах. Тем не менее, некоторые из этих шагов могут также ограничить набор белков, которые могут быть обнаружены, что приводит к предвзятому анализу.

Эта работа описывает эффективные протоколы для изоляции выпущенных углеводных полимеров и экзопротеомов от цианобактерий культуры средств массовой информации. Эти протоколы могут быть легко адаптированы к конкретным целям и потребностям пользователей исследования, сохраняя при этом основные шаги, представленные здесь.

протокол

1. Цианобактериальная высвобождение углеводной полимерной изоляции

1. Полимерная изоляция и удаление загрязняющих веществ
   1. Культивировать цианобактериальный штамм в стандартных условиях , например, 30 градусов по Цельсию при освещении 12 ч (50 м^{Эм 2}с¹)/12 г темного режима, с орбитальной тряской при 150 об/мин. Измерьте рост с помощью стандартных протоколов (например, оптическая плотность на 730 нм (OD_730nm),хлорофилла, сухого веса и т.д.», затем измерять производство высвобождение полисахаридов в соответствии с фенол-серной кислоты метод¹⁶.
   2. Перенос культуры в диализные мембраны (12-14 кДа отсечения молекулярного веса) и диализ против минимум 10 томов деионизированной воды на 24 ч с непрерывным перемешиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от объема культуры для диализа и среднего состава, может потребоваться изменение диализа воды.
   3. Центрифуги культуры на 15000 х г в течение 15 мин при 4 градусах По Цельсию. Перенесите супернатант в новый флакон и отбросьте гранулы (клетки).
   4. Центробежа снова на 20000 х г в течение 15 мин при 4 кв КС, чтобы удалить загрязняющие вещества, такие как мусор стенки клеток или липополисахариды (LPS).
   5. Перенесите супернатант в стеклянный стакан и отбросьте гранулы.
2. Осадки полимера
   1. Добавьте 2 тома 96% этанола к супернатану.
   2. Инкубировать подвеску при 4 градусах Цельсия, по крайней мере на ночь.
   3. Восстановление полимера
      1. Для небольших или не видимых количеств осажденного полимера: центрифуга подвески при 13000 х г в течение 25 минут при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и отрепретите гранулы в 1 мл или 2 мл автоклавированной деионированной воды. Перенесите свовую подвеску на флакон.
         ВНИМАНИЕ: Супернатант следует отбрасывать осторожно, так как он может стать легко resuspended.
      2. Для видимого/большого количества осажденного полимера: соберите осаждаемый полимер со стерильными металлическими щипками в флакон. Сожмите полимер и отбросьте избыток этанола.
   4. Необязательно: в зависимости от степени требуемой очистки полимера повторите шаг осадков с 96% этанола после повторного перевеса полимеров в деионизированной воде.
3. Лиофилизация полимера
   1. Держите флаконы с осаждаемым полимером при -80 градусов по Цельсию, по крайней мере на ночь.
   2. Заморозить сухой (лиофилизм) полимер не менее 48 ч (не позволяйте подвеске размораживать сяротку перед замораживанием сушиния).
   3. Храните сушеный полимер при комнатной температуре (RT) до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранение полимера в обезвоживание рекомендуется, так как он может поглощать воду с течением времени.

2. Изоляция цианобактериального экзопротеома

1. Средняя концентрация
   1. Выращивайте цианобактерии в стандартных условиях , например, 30 градусов по Цельсию под 12 ч света (50 м²с¹)/12 ч темный режим, с орбитальной встряхивания при 150 об/мин. Мониторинг роста цианобактерия с помощью стандартных процедур (например, OD_730nm,хлорофилла, сухого веса и т.д.. .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
   2. Центрифуга культур на 4000 х г, в течение 10 минут на RT.
   3. Перенесите супернатант в колбу и отбросьте клеточные гранулы.
   4. Фильтр декантированных среды через 0,2 мкм порразмерный фильтр.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь на короткий период времени, если среда хранится при 4 градусах Цельсия.
   5. Сосредоточьте среду примерно в 500 раз (учитывая первоначальный объем фильтрованной среды), используя центробежные концентраторы с номинальным молекулярным отсечкой веса 3 кДа. Центрифугация должна работать при 4000 х г (максимум 1 ч процентрифифации раунда) при 15 градусах Цельсия.
      ВНИМАНИЕ: Для большинства концентраторных брендов, фильтр устройство должно быть промыто центрифугации с ультрачистой водой перед использованием. Как только фильтр мокрый, не дайте ему высохнуть. Оставьте достаточно жидкости на резервуаре, когда устройство не используется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Снижение температуры центрифугации до 4 градусов по Цельсию может быть полезно, если цель состоит в том, чтобы изучить активность белка, хотя это увеличит время, необходимое для концентрации образца. Протокол может быть приостановлен между этапами центрифугирования в течение коротких периодов времени, если среда хранится при 4 градусах Цельсия.
   6. Промыть стенки фильтровального резервуара образца устройства с концентрированным образцом и перенести содержимое в микроцентрифугную трубку.
   7. Выполните дополнительную ступень стирки резервуара образца фильтровального устройства с автоклавизированной культурой среды для обеспечения максимального восстановления экзопротеома.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы количественно процент восстановления, следуйте инструкциям конкретного производителя.
   8. Храните образцы экзопротеома при -20 градусов до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление ингибиторов протеазы рекомендуется для длительного хранения.
2. Анализ экзопротеома
   1. Количественное содержание белка с помощью протеина BCA анализ в 96-наилучшим образом пластины в соответствии с инструкциями производителя.
   2. Отделите белки натрием dodecyl сульфат-полиакриламид гель электрофоресис (SDS-PAGE), используя стандартные протоколы окрашивания (например, Coomassie синий, серебристый окрашивания).
   3. Вырежьте полосы / гели регионов, представляющих интерес и собирать их в различных микроцентрифуговых труб, содержащих соответствующие объемы ультра-чистой воды.
   4. Продолжить идентификацию и анализ белков с помощью масс-спектрометрии.

Результаты

Схематическое представление метода, описанного для извлечения освобожденных углеводных полимеров из цианобактериальных культур, изображено на рисунке 1. Осажденные полимеры от умеренного производителя EPS цианобактерий Synechocystis sp. PCC 6803 и эффективного производител...

Обсуждение

Чтобы лучше понять механизмы бактериальной секреции и изучить высвобожденные продукты, крайне важно продемонстрировать эффективную изоляцию и анализ биомолекул, присутствующих в внеклеточной бактериальной среде (например, выпущенных углеводных полимеров и белков).

Ц?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dialysis membranes	Medicell Membranes Ltd	DTV.12000.07	Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll
Ethanol 96%	AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A.	4.000.02.02.00	Fermentation ethyl alcohol 96% AGA
PES Filter 0.2 μm	Fisher Scientific, Lda	15206869	Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR
Amicon Ultra-15, Ultracel-3K	Merck Millipore Ltd.	UFC900324	Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa
Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay	Fisher Scientific, Lda	10741395	Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration
Brillant Blue G Colloidal Concentrate	Sigma Aldrich Química SL	B2025-1EA	Coomassie blue