内生菌与人类肠道微生物群使用体外浴发酵系统的相互作用分析

摘要

本文描述了一种使用体外批次发酵系统研究内生菌与人类肠道微生物群之间的相互作用的协议。

摘要

人类肠道微生物已成为促进人类健康、预防疾病的重要研究对象。因此，研究内生菌（如药物和益生菌）与肠道微生物群之间的相互作用已成为一个重要的研究课题。然而，由于生物伦理学和经济限制，在体内与人类志愿者进行的实验对于此类研究来说并不理想。因此，动物模型被用来评估体内的这些相互作用。然而，动物模型研究仍然受到生物伦理学考虑的限制，此外，动物和人类的微生物群的组成和多样性也各不相同。另一种研究策略是使用批量发酵实验，允许评估体外生物和肠道微生物群之间的相互作用。为了评估这一策略，双歧杆菌（比夫）外聚糖（EPS）被用作具有代表性的异种生物。然后，利用薄层色谱（TLC）、16S rRNA基因高通量测序的细菌群落成分分析、气相色谱等多种方法，对Bif EPS与人类肠道微生物群的相互作用进行了研究。短链脂肪酸（SCFA）。这里介绍的是一个协议，研究内生菌和人类肠道微生物群之间的相互作用，使用体外批次发酵系统。重要的是，该协议也可以修改，以研究其他内生菌和肠道微生物群之间的一般相互作用。

引言

胃微生物群在人类肠道的功能和宿主健康中起着重要的作用。因此，肠道微生物群最近成为疾病预防和治疗的重要^目标。此外，肠道细菌与宿主肠道细胞相互作用，调节基本宿主过程，包括代谢活动、营养利用、免疫系统调节，甚至大脑功能和决策^2，3.内生菌具有影响肠道微生物群的细菌组成和多样性的巨大潜力。因此，内生菌和人类肠道微生物群之间的相互作用吸引了越来越多的研究关注4，5，6，7，8，9。

由于生物伦理学和经济限制，很难评估内生菌与体内人类肠道微生物群之间的相互作用。例如，未经美国食品和药物管理局许可，无法进行调查内生菌与人类肠道微生物群之间相互作用的实验，招募志愿者的成本很高。因此，动物模型经常用于此类调查。然而，由于动物与人类相关的社区成分不同，且多样性，动物模型的使用受到限制。探索内生菌与人类肠道微生物群相互作用的体外替代方法是利用批量培养实验。

外聚糖（EPS）是益生菌，对维持人类健康有^{重大贡献10。}由不同的单糖组合物和结构组成的不同 EPS 可以表现出不同的功能。以前的分析已经确定了Bif EPS的组成，这是当前^研究11中具有代表性的异种生物。然而，在EPS组成和多样性方面，没有考虑到宿主相关的代谢效应。

此处描述的协议使用来自 12 名志愿者的粪便微生物群来发酵 Bif EPS。然后，结合使用薄层色谱法 （TLC）、16S rRNA 基因高通量测序和气相色谱 （GC） 来研究 EPS 与人类肠道微生物群之间的相互作用。与体内实验相比，该协议的明显优点是成本低，避免了宿主新陈代谢的干扰作用。此外，所述协议可用于其他研究，研究内生菌和人类肠道微生物群之间的相互作用。

研究方案

本议定书遵循湖南科学与工程大学（中国湖南）和浙江公学（浙江，中国）伦理委员会的指导方针。

1. 细菌的制备

1. 制备双歧杆菌中溴
   1. 在950 mL蒸馏水中结合以下成分:肉提取物，5 g/L;酵母提取物，5克/升;病例蛋白，10克/升;大豆，5克/升;葡萄糖，10克/升;K₂HPO₄， 2.04 g/L;MgSO₄±7H₂O，0.22 g/L;MnSO₄.H₂0， 0.05 g/L;纳Cl，5克/升;补间 80，1 mL;盐溶液，40 mL（CaCl₂.2H₂O，0.25 g/L;KH₂PO₄， 1 g/L;NaHCO₃， 10 g/L;纳Cl，2克/升）;和雷沙祖林，0.4 mL（2.5毫克/升）。使用 2 M NaOH 将 pH 调整到 6.8。
   2. 高压灭菌在121°C下15分钟，让肉汤在厌氧条件下冷却至室温（RT）（10% H2，10% CO 2，80% N₂）。在介质中加入过滤灭菌的半胱氨酸-HCl（0.5克/升）和莫皮罗金（5毫克/升）。
2. 在厌氧条件下，在厌氧条件下将一种无二分量（50 μL）冷冻双歧杆菌加到含有5 mL的双歧杆菌培养管中，然后在厌氧培养箱中培养24小时，在37°C下。

2. 制备双歧杆菌EPS

1. PYG琼脂介质的制备
   1. 结合以下内容:肽，20 g/L;酵母提取物，10克/升;葡萄糖，5克/升;纳Cl， 0.08 g/L;CaCl₂， 0.008 g/L;MgSO₄±7H₂O，0.008 g/L;K₂HPO₄， 0.04 g/L;KH₂PO₄， 0.04 g/L;NaHCO₃， 0.4 g/L;12 g/L. 使用 10 M NaOH 将 pHH 调整为 7.2。
   2. 在121°C下高压灭菌介质15分钟，冷却至+50°C。然后，每1升培养基，加入0.5 mL的过滤灭菌维生素K₁溶液（1克维生素K1溶解在99 mL的99%乙醇中），5 mL的血敏溶液（0.5克血明溶解在1 mL的1 mol/L NaOH中，然后带蒸馏水至100 mL，以及0.5克半胱氨酸-HCl。
   3. 在浇注 PYG 板之前，在介质中加入过滤灭菌的 5-bromo-4-氯-3-indolyl β-D-角蛋白（X-Gal，0.06 g/L）、LiCl®3H₂O （5.7 g/L） 和木皮罗金 （5 mg/L）。
      注:X-Gal 和 LiCl.3H₂O 允许通过着色变化识别板上的B. 长膜菌落。
2. 接种20μL的B.龙菌株（步骤1.2）到PYG板，并放置在厌氧培养箱在37°C72小时。
3. 使用称重勺从 PYG 板收集粘液细菌菌落，然后使用涡旋振荡器完全悬浮在 10 mL 的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
   注:细菌和EPS混合物应通过涡旋或反复上下移液完全悬浮，直到纤维完全溶解在PBS中。
4. 将悬架在 6，000 x g下离心 5 分钟。
5. 小心地将上生子转移到新的离心管中，通过反复反转和混合，与三卷冷99%乙醇完全混合。
6. 将混合物在 6，000 x g下离心 5 分钟，并完全去除上生子。
7. 使用速度真空对 EPS 提取物进行刮擦和干燥，从离心管中取出沉淀物。

3. 发酵介质的制备

1. 基本文化媒介六的准备
   1. 结合以下内容:肽，3 g/L;胰腺酮，3克/升;酵母提取物，4.5克/升;粘素，0.5 g/L;胆汁盐3号，0.4克/升;纳Cl，4.5克/升;KCl，2.5 克/升;MgCl₂±6H₂O，4.5 g/L;1 mL 补间 80;CaCl₂.6H₂O，0.2 g/L;KH₂PO₄， 0.4 g/L;MgSO₄±7H₂O，3.0 g/L;MnCl₂+4H₂O，0.32 g/L;FeSO₄+7H2O，0.1 g/L;CoSO₄±7H₂O，0.18 g/L;CaCl₂+2H₂O，0.1 g/L;ZnSO₄+7H₂O，0.18 g/L;CuSO₄±5H₂O，0.01 g/L;和 NiCl₂+6H₂O，0.092 g/L. 使用 1 M HCl 将 pHH 调整为 6.5。
   2. 如第 2.1 节所述，准备血敏和半胱氨酸，并在高压灭菌和冷却后添加。
2. 使用 VI 基介质准备包含不同碳源的培养基介质。在高压灭菌之前，向介质 VI 添加 8 g/L 的 Bif EPS 纤维，包括 VI_Bif 组。此外，将 8 克/L 淀粉添加到中等 VI 以表示 VI 组淀粉。最后，在不添加碳源的情况下使用中VI作为对照（第六组）。
   注:Bif EPS和淀粉首先使用磁性搅拌器溶解在热水中，然后与制备的VI介质混合。
3. 在 121°C 下对所有介质进行 15 分钟的高压灭菌，并冷却至 RT。
4. 将每种介质的子样本（5 mL）转移到厌氧培养管中，并将剩余的介质储存在4°C。

4. 人类粪便样品制备

1. 使用粪便容器从健康的成年人类志愿者那里收集新鲜排便后立即收集新鲜粪便样本，然后用于浆料制备。
   注:在采集样本之前，应对所有志愿者进行筛查，以确保在捐赠样品前至少3个月内不会接受抗生素、益生菌或益生菌治疗。此外，所有捐助者必须提供知情的书面同意。
2. 将新鲜粪便样品（1 g）转移到10 mL的0.1M厌氧PBS（pH 7.0）到玻璃烧杯中，然后用玻璃棒制备10%（w/v）浆料。
3. 使用 0.4 mM 筛过滤粪便浆。然后，使用过滤过的浆料的子样本对批次培养发酵实验进行接种，并将剩余部分储存在-80°C以进行进一步分析。
   注:步骤4.2~4.3在厌氧室中执行。

5. 体外批次发酵

1. 将过滤后的粪便浆（500μL）加入在厌氧室中步骤3.2中制备的发酵培养基，然后在37°C下孵育。
2. 在厌氧室中以24小时和48小时收集2 mL的发酵样品，然后在6000 x g下在腔外离心3分钟。
3. 小心地将上生子转移到新的离心管中，用于多糖降解分析和短链脂肪酸 （SCFA） 测量。
4. 将离心颗粒储存在-80°C，随后用于细菌基因组DNA提取。

6. 人类粪便微生物群的EPS降解

1. 将 0.2 μL 的发酵上生子加载到预涂覆的硅胶-60 TLC 铝板上，然后用干燥剂干燥。
2. 在 20 mL 的甲酸/n-丁醇/水 （6:4:1， v:v:v:v） 溶液中开发板，并使用干燥剂干燥。
3. 将板浸泡在orinol试剂中进行染色，然后用干燥剂干燥。
   1. 通过在25 mL蒸馏水中溶解900毫克的液化醇试剂，然后加入375 mL的乙醇，制备orcinol试剂。随后，应缓慢加入浓缩硫酸，将溶液彻底混合。
4. 在烤炉中加热120°C3分钟，通过测量TLC带评估EPS的降解。

7. EPS对人体肠道微生物群的影响

1. 冷冻解冻步骤 4.3 中制备的原始粪便样本和步骤 5.4 中制备的发酵样品。
2. 按照制造商的说明，使用粪便细菌基因组DNA提取试剂盒从所有样品中提取细菌基因组DNA（gDNA）。
3. 使用微分光光度计和琼脂凝胶电泳测定DNA浓度、整合度和尺寸分布。
4. 使用前面描述的正向和反向引物¹²从提取的 gDNA 中处理细菌 16S rRNA 基因的 PCR:
   -前导引（条形码底漆338F）:ACTCCTACAGGGAGCA
   -反向引物 （806R）: GGACTACHVGGGWTCTAT
   使用以下热循环器条件:
   1. 94 °C 5 分钟
   2. 94 °C，30 s。
   3. 55 °C，30 s。
   4. 72 °C 1 分钟
   5. 对 35 个循环重复 2⁄4
   6. 72 °C 5 分钟
   7. 4°C 保持，直到从热循环器中拆下。
5. 使用超高通量微生物群落分析，在DNA测序公司进行PCR产品的高通量测序。
6. 使用微生物生态学定量洞察 （QIIME） 序列分析管道¹³获得干净、高质量的序列。
7. 使用生物信息学工具（如 Mothur 软件套件¹⁴）为大于 97% 的核苷酸相似性的 16S rRNA 基因序列定义操作分类单位 （ONU）。
8. 从每个 OTU 中选择一个代表性序列，并使用 RDP 分类器以及 SILVA 分类数据库对代表性序列¹⁵进行分类。
9. 使用生物信息学^工具16计算Good的覆盖率、阿尔法多样性指标（包括辛普森和香农指数）和丰富度（观察到的OTUS数量）。

8. 人肠道微生物群EPS对SCFA生产的影响

1. 加入步骤5.3至2 mL离心管中制备的发酵上生子（1 mL）。
2. 在每个样品中加入0.2 mL的25%（w/v）元磷酸，并通过涡旋彻底混合溶液。
3. 将混合物在13，000 x g下离心20分钟，并将上生子转移到新鲜管中。
4. 同时，制备120 mM醋酸、丙酮、丁基、异丁基、瓦列克和异黄酸的溶液。然后，将每剂酸的1mL加入1.2 mL的25%（w/v）元磷酸，并作为标准鸡尾酒使用。
5. 使用 0.22 μM 膜过滤样品。
6. 根据前面描述的协议11，17，使用高性能气相色谱检测SCFA浓度。
   注: InertCap FFAP 列 （0.25 mM x 30 m x 0.25 μM） 用于气相色谱 （GC）。然后，使用 GC 解决方案软件包中的单点内部标准方法，根据峰值区域对 SCFA 浓度进行量化。

结果

在厌氧孵育72小时后，在PYG板上的B.长膜培养中观察到粘膜EPS的产生（图1A）。培养物的离心，随后是乙醇沉淀和干燥，导致纤维素样EPS的收集（图1B）。干燥EPS和可溶性淀粉然后用作发酵培养的碳源。TLC因其成本低、结果周转快而用于寡糖分离和纯度^分析。虽然人类粪便微生物群淀粉的降解速度比Bif EPS快（图2）...

讨论

在过去十年中，在了解人类肠道微生物群的组成和活动方面取得了重大进展。由于这些研究，全息生物概念已经出现，它代表宿主和相关微生物群落之间的相互作用，如在人类和他们的肠道微生物群^{之间19，20。}此外，人类甚至现在被视为超级^生物21，其中肠道微生物群已被确认为人类功能器官之一22，23。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm membrane filters	Millipore	SLGP033RB	Use to filter samples
0.4-mm Sieve	Thermo Fischer	308080-99-1	Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Solarbio	X1010	Use to prepare color plate
Acetic	Sigma-Aldrich	71251	Standard sample for SCFA
Agar	Solarbio	YZ-1012214	The component of medium
Anaerobic chamber	Electrotek	AW 400SG	Bacteria culture and fermentation
Autoclave	SANYO	MLS-3750	Use to autoclave
Bacto soytone	Sigma-Aldrich	70178	The component of medium
Baking oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A	Use to heat and bake
Beef Extract	Solarbio	G8270	The component of medium
Bifidobacterium longum Reuter	ATCC	ATCC® 51870™	Bacteria
Bile Salts	Solarbio	YZ-1071304	The component of medium
Butyric	Sigma-Aldrich	19215	Standard sample for SCFA
CaCl2	Solarbio	C7250	Salt solution of medium
Capillary column	SHIMADZU-GL	InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm)	Used to SCFA detection
Casein Peptone	Sigma-Aldrich	39396	The component of medium
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall ST 8	Use for centrifugation
CoSO4.7H2O	Solarbio	C7490	The component of medium
CuSO4.5H2O	Solarbio	203165	The component of medium
Cysteine-HCl	Solarbio	L1550	The component of medium
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2O	Solarbio	YZ-111614	The component of medium
Formic Acid	Sigma-Aldrich	399388	Used to TLC
Gas chromatography	Shimadzu Corporation	GC-2010 Plus	Used to SCFA detection
Glass beaker	Fisher Scientific	FB10050	Used for slurry preparation
Glucose	Solarbio	G8760	The component of medium
Haemin	Solarbio	H8130	The component of medium
HCl	Sigma-Aldrich	30721	Basic solution used to adjust the pH of the buffers
Isobutyric	Sigma-Aldrich	46935-U	Standard sample for SCFA
Isovaleric Acids	Sigma-Aldrich	129542	Standard sample for SCFA
K2HPO4	Solarbio	D9880	Salt solution of medium
KCl	Solarbio	P9921	The component of medium
KH2PO4	Solarbio	P7392	Salt solution of medium
LiCl.3H2O	Solarbio	C8380	Use to prepare color plate
Meat Extract	Sigma-Aldrich-Aldrich	70164	The component of medium
Metaphosphoric Acid	Sigma-Aldrich	B7350	Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2O	Solarbio	M8160	The component of medium
MgSO4.7H2O	Solarbio	M8300	Salt solution of medium
MISEQ	Illumina	MiSeq 300PE system	DNA sequencing
MnSO4.H20	Sigma-Aldrich	M8179	Salt solution of medium
Mupirocin	Solarbio	YZ-1448901	Antibiotic
NaCl	Solarbio	YZ-100376	Salt solution of medium
NaHCO3	Sigma-Aldrich	792519	Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000	NanoDrop Technologies	ND-2000	Determine DNA concentrations
NaOH	Sigma-Aldrich	30620	Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanol	ChemSpider	71-36-3	Used to TLC
NiCl2	Solarbio	746460	The component of medium
Orcinol	Sigma-Aldrich	447420	Used to prepare orcinol reagents
Propionic	Sigma-Aldrich	94425	Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit	QIAGEN	51504	Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powder	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A610100-0001	Used to prepare the lipid suspension
Resazurin	Solarbio	R8150	Anaerobic Equipment
Speed Vacuum Concentrator	LABCONCO	CentriVap	Use to prepare EPSs
Starch	Solarbio	YZ-140602	Use to the carbon source
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	150692	Used to prepare orcinol reagents
T100 PCR	BIO-RAD	1861096	PCR amplification
TLC aluminium sheets	MerckMillipore	116835	Used to TLC
Trypticase Peptone	Sigma-Aldrich	Z699209	The component of medium
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293	The component of medium
Tween 80	Solarbio	T8360	Salt solution of medium
Valeric	Sigma-Aldrich	75054	Standard sample for SCFA
Vitamin K1	Sigma-Aldrich	V3501	The component of medium
Vortex oscillator	Scientific Industries	Vortex.Genie2	Use to vortexing
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625	The component of medium
ZnSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251	The component of medium