체외 목욕 발효 시스템을 사용하여 내분비병제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용 분석

요약

여기서 설명된 프로토콜은 시험관 내 배치 발효 시스템을 사용하여 내생생물학과 인간 장내 미생물 간의 상호작용을 조사하는 프로토콜이다.

초록

인간의 장내 미생물은 최근 인간의 건강을 증진하고 질병을 예방하는 연구의 중요한 대상이되었습니다. 따라서, endobiotics 사이 상호 작용의 조사 (예를 들어, 마약과 prebiotics) 그리고 창 자 microbiota 중요 한 연구 주제가 되고있다. 그러나, 인간 자원 봉사자와 생체 내 실험은 생물 윤리 및 경제적 제약으로 인해 이러한 연구에 이상적이지 않습니다. 그 결과, 동물 모델은 생체 내에서 이러한 상호작용을 평가하는 데 사용되어 왔다. 그럼에도 불구 하 고, 동물 모델 연구는 여전히 생물 윤리 고려에 의해 제한 됩니다., 동물 대 인간에서 microbiota의 다른 조성및 다양 성 뿐만 아니라. 대체 연구 전략은 시험관내 내생생물학과 장내 미생물 간의 상호 작용을 평가할 수 있는 일괄 발효 실험의 사용입니다. 이러한 전략을 평가하기 위해, 비피도박테리아(Bif) 외다당류(EPS)를 대표적인 제노바이오틱으로 사용하였다. 그 후, Bif EPS와 인간 장내 미생물 간의 상호작용은 16S rRNA 유전자고 처리량 시퀀싱 및 가스 크로마토그래피와 같은 얇은 층 크로마토그래피(TLC), 세균 공동체 조성 분석과 같은 여러 가지 방법을 사용하여 조사되었습니다. 짧은 사슬 지방산 (SCFA)의. 여기에 제시된 프로토콜은 시험관 내 배치 발효 시스템을 사용하여 내생생물학과 인간 장내 미생물 간의 상호작용을 조사하는 프로토콜이다. 중요 한 것은, 이 프로토콜은 또한 다른 endobiotics와 창 자 microbiota 사이 일반적인 상호 작용을 조사 하기 위해 수정될 수 있습니다.

서문

창자 미생물은 인간의 창자 기능과 숙주 건강에 중요한 역할을 합니다. 따라서, 창자 미생물은 최근 질병 예방 및 치료^1의중요한 표적이되었습니다. 또한, 창 자 박테리아 호스트 장 세포와 상호 작용 하 고 기본적인 호스트 프로세스를 조절, 신진 대사 활동을포함 하 여, 영양소 가용성, 면역 체계 변조, 심지어 뇌 기능 및 의사 결정 2,³ . Endobiotics 세균 성 구성 및 창 자 microbiota의 다양성에 영향을 미칠 상당한 잠재력을 가지고. 따라서, 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호작용은^4,5,^6,7,^8,9.

생체 윤리 및 경제적 제약으로 인해 생체 내 내 생물 학 및 인간의 창 자 microbiota 사이의 상호 작용을 평가 하기 어렵다. 예를 들어, 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호작용을 조사하는 실험은 식품의약품안전청의 허가 없이는 수행할 수 없으며, 자원봉사자 모집은 비용이 많이 듭니다. 따라서 동물 모델은 종종 그러한 조사에 사용됩니다. 그러나, 동물 모델의 사용은 동물-대 인간 관련 지역 사회에서 상이한 미생물 조성물 및 다양성으로 인해 제한된다. 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용을 탐구하는 대안체외 방법은 배치 배양 실험을 통해서이다.

외다당류(EPS)는 인간의 건강 유지에 크게 기여하는 프리바이오틱스(EPS)(10)이다. 상이한 단당류 조성물 및 구조로 구성된 뚜렷한 EPS는 뚜렷한 기능을 나타낼 수 있다. 이전 분석은 Bif EPS의 조성을 결정하였는데, 이는 현재 연구^11에서표적화된 대표적인 xenobiotic이다. 그러나, 호스트 관련 신진 대사 효과 EPS 조성 및 다양성에 관한 고려 되지 않은.

여기에 설명된 프로토콜은 12명의 자원봉사자들로부터 Bif EPS를 발효시키기 위해 배설물 미생물을 사용합니다. 얇은 층 크로마토그래피 (TLC), 16S rRNA 유전자 높은 처리량 시퀀싱 및 가스 크로마토그래피 (GC)는 EPS와 인간 장 내 미생물 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 조합하여 사용됩니다. 생체 내 실험에 비해이 프로토콜의 뚜렷한 장점은 그것의 낮은 비용과 호스트의 신진 대사에서 방해 효과의 회피. 또한, 설명된 프로토콜은 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용을 조사하는 다른 연구에서 사용될 수 있다.

프로토콜

이 프로토콜은 후난 과학 공학 대학 (후난, 중국) 및 절강 공샹 대학 (절강, 중국)의 윤리위원회의 지침을 따릅니다.

1. 박테리아의 준비

1. 비피도박테리움 배지 국물의 제조
   1. 950 mL의 증류수에 다음 구성 요소를 결합하십시오 : 고기 추출물, 5 g / L; 효모 추출물, 5 g / L; 카제인 펩톤, 10 g/L; 콩톤, 5 g / L; 포도당, 10 g/L; _K2HPO_4,2.04 g/L; MgSO₄·7H 2O, 0.22 g/L; MnSO₄. H₂0, 0.05 g/L; NaCl, 5 g/L; 트웬 80, 1 mL; 소금 용액, 40 mL (CaCl₂.2H₂O, 0.25 g / L; _KH2PO_4,1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); 및 resazurin, 0.4 mL (2.5 mg /L). 2 M NaOH로 pH를 6.8로 조정합니다.
   2. 121°C에서 15분간 오토클레이브하고 국물을 혐기성 조건하에서 실온(RT)으로 냉각시키십시오(10% H_2,10% CO2, 80% N 2). 필터 멸균 시스테인-HCl (0.5 g/L) 및 무크로신 (5 mg/L)을 배지에 추가합니다.
2. 혐기성 조건 하에서 5 mL의 비피도박테리움 배지 국물을 배양튜브에 냉동 비피도박테리움 롱룸의 aliquot(50 μL)를 첨가한 다음, 37°C에서 24시간 동안 혐기성 인큐베이터에서 배양한다.

2. 비피도박테리아 EPS 의 준비

1. PYG 한천 배지의 준비
   1. 다음을 결합: 펩톤, 20 g/L; 효모 추출물, 10 g / L; 포도당, 5 g/L; NaCl, 0.08 g/L; CaCl₂, 0.008 g/L; MgSO₄·7H 2O, 0.008 g/L; _K2HPO₄, 0.04 g/L; _KH2PO_4,0.04 g/L; NaHCO₃, 0.4 g/L; 한천, 12 g/L. 10 M NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다.
   2. 121°C에서 15분간 용지를 오토클레이브하고 ~50°C까지 냉각시. 그런 다음 배지 1L당 0.5 mL의 필터 멸균 비타민 K₁ 용액(99% 에탄올 99mL에 용해된 비타민 K₁ 1 개), 해민 용액 5 mL (1 mol /L NaOH 1 mL에 용해 된 해민 0.5 g)을 추가하십시오. , 증류수로 100 mL까지 키우고, 0.5 g의 시스테인-HCl을 키웠다.
   3. PYG 플레이트를 붓기 전에 필터 멸균 된 5-브로모-4 클로로-3-β-D-galactopyraside (X-Gal, 0.06 g /L), LiCl·3H₂O (5.7 g/L) 및 무피로신 (5 mg/L)을 배지에 추가하십시오.
      참고 : X-Gal 및 LiCl.3H₂O는 착색 변화를 통해 플레이트에 B. longum 식민지를 식별 할 수 있습니다.
2. B. longum 균주의 20 μL을 PYG 플레이트에 접종하고 72 시간 동안 37 °C에서 혐기성 인큐베이터에 놓습니다.
3. 계량 스쿱을 사용하여 PYG 플레이트에서 점막 세균 콜로니를 수집한 다음 와류 발진기를 사용하여 인산완충 식염수(PBS)의 10mL에서 완전히 다시 중단합니다.
   참고: 섬유가 PBS에 완전히 용해될 때까지 세균 및 EPS 혼합물을 소용돌이 또는 위아래로 반복적으로 반복하여 완전히 다시 매달아야 합니다.
4. 서스펜션을 6,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
5. 조심스럽게 새로운 원심 분리튜브에 초자연자를 옮기고 반복적인 반전과 블렌딩으로 3부량의 차가운 99% 에탄올과 완전히 섞어보십시오.
6. 혼합물을 6,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 초자연자를 완전히 제거하십시오.
7. 속도 진공을 사용하여 하룻밤 동안 EPS 추출물을 긁어 내고 건조시킴으로써 원심분리관에서 침전물을 제거한다.

3. 발효매체의 준비

1. 기본 배양 배지 VI의 준비
   1. 다음을 결합: 펩톤, 3 g/L; 트립톤, 3 g/L; 효모 추출물, 4.5 g/L; 뮤신, 0.5 g/L; 담즙 염 제 3, 0.4 g/ L; NaCl, 4.5 g/L; KCl, 2.5 g/L; MgCl₂·6H 2O, 4.5 g/L; 1 mL 트웬 80; CaCl₂.6H₂O, 0.2 g/L; _KH2PO_4,0.4 g/L; MgSO₄·7H 2O, 3.0 g/L; MnCl₂·4H 2O, 0.32 g/L; FeSO₄·7H2O, 0.1 g/L; CoSO₄·7H 2O, 0.18 g/L; CaCl₂·2H 2O, 0.1 g/L; ZnSO₄·7H 2O, 0.18 g/L; CuSO₄·5H 2O, 0.01 g/L; NiCl₂·6H 2O, 0.092 g/L. 1 M HCl으로 pH를 6.5로 조정합니다.
   2. 섹션 2.1에서 와 같이 해민과 시스테인을 준비하고 오토클레이브 및 냉각 후 추가합니다.
2. VI 베이스 미디어를 통해 다양한 탄소 원을 포함하는 배양 배지를 준비합니다. 오토클레이브에 앞서, 비프 EPS 섬유 8 g/L을 중간 VI에 첨가하고, VI_Bif 군으로 구성된다. 또한 중간 VI에 8 g/L 전분을 추가하여 그룹 VI_Starch를 나타냅니다. 마지막으로, 탄소 원을 첨가하지 않고 중간 VI가 대조군(group VI)으로 사용된다.
   참고: Bif EPS 및 전분은 먼저 자기 교반기를 사용하여 뜨거운 물에 용해된 다음 준비된 VI 배지와 혼합합니다.
3. 121 °C에서 모든 매체를 15분 동안 오토클레이브하고 RT로 냉각시.
4. 혐기성 인큐베이터에서 배양 튜브에 각 배지의 하위 샘플(5 mL)을 옮기고, 나머지 배지를 4°C에 저장한다.

4. 인간 배설물 샘플 준비

1. 대변 용기를 사용하여 건강한 성인 인간 자원 봉사자로부터 신선한 배변 직후 신선한 배설물을 수집하고 슬러리 준비에 사용합니다.
   참고: 샘플 수집 전에, 모든 자원 봉사자는 샘플을 기증하기 전에 적어도 3 개월 동안 항생제, 프로바이오틱스 또는 프리바이오틱 치료를 받지 않도록 선별해야 합니다. 또한 모든 기부자는 통보된 서면 동의를 제공해야 합니다.
2. 신선한 배설물 샘플(1g)을 0.1 M 혐기성 PBS(pH 7.0)의 10 mL로 유리 비커에 옮긴 다음 유리 막대를 사용하여 10% (w/v) 슬러리를 준비합니다.
3. 0.4 mM 체를 사용하여 배설물 슬러리를 필터링하십시오. 이어서, 여과된 슬러리의 서브샘플을 사용하여 배치 배양 발효 실험을 접종하고, 추가 분석을 위해 나머지를 -80°C에 저장한다.
   참고 : 단계 4.2-4.3 혐기성 챔버에서 수행됩니다.

5. 시험관 내 배치 발효

1. 여과된 배설물 슬러리(500 μL)를 혐기성 챔버 내에서 단계 3.2에서 제조된 발효 배지에 첨가한 다음 37°C에서 배양합니다.
2. 혐기성 챔버에서 24 시간 및 48 h에서 발효 샘플 2 mL을 수집 한 다음 챔버 외부의 원심 분리기를 6,000 x g에서 3 분 동안 수집합니다.
3. 다당류 분해 분석 및 단쇄 지방산(SCFA) 측정에 사용될 새로운 원심분리관으로 조심스럽게 주축을 옮긴다.
4. 원심분리 펠릿을 -80°C에 저장하고 이어서 세균게놈 DNA 추출에 사용한다.

6. 인간 배설물 미생물에 의한 EPS 저하

1. 미리 코팅된 실리카 젤-60 TLC 알루미늄 플레이트에 0.2 μL의 발효 된 과식제를 적재한 다음 헤어 드라이어를 사용하여 건조시십시오.
2. 포름산/n-부탄올/물(6:4:1, v:v:v) 용액의 20 mL로 플레이트를 개발하고 헤어 드라이어를 사용하여 건조시십시오.
3. 오크시놀 시약에 접시를 담그고 염색한 다음 헤어 드라이어를 사용하여 건조시다.
   1. 25 mL의 증류수에 900 mg의 리세놀을 용해한 다음 375 mL의 에탄올을 추가하여 오시놀 시약을 준비하십시오. 그 후, 농축 된 황산을 천천히 첨가하고 용액을 철저히 혼합해야합니다.
4. 베이킹 오븐에서 120°C에서 3분 동안 열판을 가열하고 TLC 밴드를 측정하여 EPS의 열화를 평가합니다.

7. 인간의 장 내 미생물에 EPS의 효과

1. 4.3단계에서 제조된 본래 배설물 샘플을 동결해 및 5.4단계에서 제조된 발효 시료.
2. 대변 세균 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 모든 샘플에서 세균 게놈 DNA(gDNA)를 추출하여 제조업체의 지시에 따른 다.
3. 미세 분광광도계 및 한천 겔 전기 영동을 사용하여 DNA 농도, 통합및 크기 분포를 결정합니다.
4. 앞서 설명한 다음을 사용하여 추출된 gDNA로부터 세균 16S rRNA 유전자의 PCR을 진행한다^12:
   -포워드 프라이머(바코드 프라이머 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
   -리버스 프라이머 (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
   다음 열 사이클러 조건을 사용합니다.
   1. 94 °C에서 5 분.
   2. 30s에 대한 94 °C.
   3. 30s에 대한 55 °C.
   4. 72 °C에서 1 분.
   5. 35주기 동안 2-4 반복
   6. 72 °C에서 5 분.
   7. 열 사이클러에서 제거 될 때까지 4 °C 를 유지하십시오.
5. 초고처리량 미생물 커뮤니티 분석을 사용하여 DNA 시퀀싱 회사에서 PCR 제품의 고처리량 시퀀싱을 수행합니다.
6. 미생물 생태학(QIIME) 서열 분석^{파이프라인(13)에}대한 정량적 통찰력을 사용하여 깨끗하고 고품질의 시퀀스를 구한다.
7. Mothur 소프트웨어 제품군^14와같은 생물정보학 도구를 사용하여 97% 이상의 뉴클레오티드 유사성을 가진 16S rRNA 유전자 서열에 대한 운영 분류학 단위(OTUs)를 정의한다.
8. 각 OTU에서 대표 시퀀스를 선택하고 SILVA 분류 데이터베이스와 함께 RDP 분류기를 사용하여 대표 서열^15를분류합니다.
9. 생물정보학^도구를사용하여 Good의 커버리지, 알파 다이버시티 메트릭(심슨 및 섀넌 지수 포함) 및 풍부성(OTUs 관찰 수)을 계산합니다.

8. 인간의 장 내 미생물에 의해 SCFA 생산에 EPS의 효과

1. 5.3~2 mL 원심분리기 튜브에서 제조된 발효 상피제(1 mL)를 첨가한다.
2. 각 시료에 25%(v)의 메타포스포릭산을 0.2 mL 추가하고 와류를 통해 솔루션을 철저히 혼합합니다.
3. 혼합물을 13,000 x g에서 20 분 동안 원심 분리하고 슈퍼 나탄제를 신선한 튜브로 옮니다.
4. 이와 함께, 120 mM 아세틱, 프로피온, 부티릭, 이소부티릭, 발레릭 및 이소발레르산의 용액을 준비합니다. 그런 다음, 준비된 각 산의 1 mL을 25% (v) 메타포스포릭산의 1.2 mL에 넣고 표준 칵테일로 사용하십시오.
5. 0.22 μM 멤브레인을 사용하여 샘플을 필터링합니다.
6. 앞서 설명한 프로토콜^11,17에따라 고성능 가스 크로마토그래피를 사용하여 SCFA 농도를 검출합니다.
   참고: 불활성캡 FFAP 컬럼(0.25mM x 30m x 0.25 μM)은 가스 크로마토그래피(GC)에 사용됩니다. 그런 다음 GC 솔루션 소프트웨어 패키지의 단일 지점 내부 표준 방법을 사용하여 피크 영역을 기준으로 SCFA 농도를 정량화합니다.

결과

점막 EPS의 생산은 72 시간 동안 혐기성 배양 후 PYG 플레이트에 대한 B. longum 배양물에서 관찰 될 수있다 (도1A). 배양 스크레이프의 원심분리, 에탄올 침전 및 건조에 이어, 셀룰로오스유사 EPS의수집을 초래하였다(도 1B). 건조된 EPS 및 수용성 전분은 발효 배양용 탄소 공급원으로 사용되었습니다. TLC는 낮은 비용과 신속한 결과 턴어라운드로 인해 ?...

토론

지난 10년 동안 인간의 장내 미생물 구성과 활동을 이해하는 데 상당한 진전이 있었습니다. 이러한 연구의 결과로, 홀로비오온 개념은 인간과 그들의 창자 microbiota 사이와 같은 호스트와 관련미생물 군사회사이 상호 작용을 나타내는 19,^20. 더욱이, 인간은 지금도 초고생물(21)으로 여겨지고 있으며, 여기서 장내 미생물은 인간^22,...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm membrane filters	Millipore	SLGP033RB	Use to filter samples
0.4-mm Sieve	Thermo Fischer	308080-99-1	Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Solarbio	X1010	Use to prepare color plate
Acetic	Sigma-Aldrich	71251	Standard sample for SCFA
Agar	Solarbio	YZ-1012214	The component of medium
Anaerobic chamber	Electrotek	AW 400SG	Bacteria culture and fermentation
Autoclave	SANYO	MLS-3750	Use to autoclave
Bacto soytone	Sigma-Aldrich	70178	The component of medium
Baking oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A	Use to heat and bake
Beef Extract	Solarbio	G8270	The component of medium
Bifidobacterium longum Reuter	ATCC	ATCC® 51870™	Bacteria
Bile Salts	Solarbio	YZ-1071304	The component of medium
Butyric	Sigma-Aldrich	19215	Standard sample for SCFA
CaCl2	Solarbio	C7250	Salt solution of medium
Capillary column	SHIMADZU-GL	InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm)	Used to SCFA detection
Casein Peptone	Sigma-Aldrich	39396	The component of medium
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall ST 8	Use for centrifugation
CoSO4.7H2O	Solarbio	C7490	The component of medium
CuSO4.5H2O	Solarbio	203165	The component of medium
Cysteine-HCl	Solarbio	L1550	The component of medium
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2O	Solarbio	YZ-111614	The component of medium
Formic Acid	Sigma-Aldrich	399388	Used to TLC
Gas chromatography	Shimadzu Corporation	GC-2010 Plus	Used to SCFA detection
Glass beaker	Fisher Scientific	FB10050	Used for slurry preparation
Glucose	Solarbio	G8760	The component of medium
Haemin	Solarbio	H8130	The component of medium
HCl	Sigma-Aldrich	30721	Basic solution used to adjust the pH of the buffers
Isobutyric	Sigma-Aldrich	46935-U	Standard sample for SCFA
Isovaleric Acids	Sigma-Aldrich	129542	Standard sample for SCFA
K2HPO4	Solarbio	D9880	Salt solution of medium
KCl	Solarbio	P9921	The component of medium
KH2PO4	Solarbio	P7392	Salt solution of medium
LiCl.3H2O	Solarbio	C8380	Use to prepare color plate
Meat Extract	Sigma-Aldrich-Aldrich	70164	The component of medium
Metaphosphoric Acid	Sigma-Aldrich	B7350	Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2O	Solarbio	M8160	The component of medium
MgSO4.7H2O	Solarbio	M8300	Salt solution of medium
MISEQ	Illumina	MiSeq 300PE system	DNA sequencing
MnSO4.H20	Sigma-Aldrich	M8179	Salt solution of medium
Mupirocin	Solarbio	YZ-1448901	Antibiotic
NaCl	Solarbio	YZ-100376	Salt solution of medium
NaHCO3	Sigma-Aldrich	792519	Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000	NanoDrop Technologies	ND-2000	Determine DNA concentrations
NaOH	Sigma-Aldrich	30620	Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanol	ChemSpider	71-36-3	Used to TLC
NiCl2	Solarbio	746460	The component of medium
Orcinol	Sigma-Aldrich	447420	Used to prepare orcinol reagents
Propionic	Sigma-Aldrich	94425	Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit	QIAGEN	51504	Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powder	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A610100-0001	Used to prepare the lipid suspension
Resazurin	Solarbio	R8150	Anaerobic Equipment
Speed Vacuum Concentrator	LABCONCO	CentriVap	Use to prepare EPSs
Starch	Solarbio	YZ-140602	Use to the carbon source
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	150692	Used to prepare orcinol reagents
T100 PCR	BIO-RAD	1861096	PCR amplification
TLC aluminium sheets	MerckMillipore	116835	Used to TLC
Trypticase Peptone	Sigma-Aldrich	Z699209	The component of medium
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293	The component of medium
Tween 80	Solarbio	T8360	Salt solution of medium
Valeric	Sigma-Aldrich	75054	Standard sample for SCFA
Vitamin K1	Sigma-Aldrich	V3501	The component of medium
Vortex oscillator	Scientific Industries	Vortex.Genie2	Use to vortexing
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625	The component of medium
ZnSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251	The component of medium