Análise de interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana usando sistemas de fermentação de banho in vitro

Resumo

Descrito aqui é um protocolo para investigar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana usando sistemas in vitro de fermentação em lote.

Resumo

Os microrganismos intestinais humanos tornaram-se recentemente um importante alvo de pesquisa na promoção da saúde humana e prevenção de doenças. Conseqüentemente, investigações de interações entre endobióticos (por exemplo, drogas e prebióticos) e microbiota intestinal tornaram-se um importante tópico de pesquisa. No entanto, experimentos in vivo com voluntários humanos não são ideais para tais estudos devido à bioética e restrições econômicas. Como resultado, modelos animais têm sido utilizados para avaliar essas interações in vivo. No entanto, estudos de modelos animais ainda são limitados por considerações de Bioética, além de diferentes composições e diversidades de microbiota em animais versus humanos. Uma estratégia de pesquisa alternativa é o uso de experimentos de fermentação em lote que permitam a avaliação das interações entre endobióticos e microbiota intestinal in vitro. Para avaliar esta estratégia, os exopolissacarídeos bifidobacterianos (bif) (EPS) foram usados como um xenobiótico representativo. Em seguida, as interações entre bif EPS e microbiota intestinal humana foram investigadas usando vários métodos, tais como cromatografia em camada delgada (TLC), análise composicional da comunidade bacteriana com sequenciamento de alto rendimento do gene 16S rRNA e cromatografia gasosa de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs). Aqui apresentamos um protocolo para investigar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana utilizando sistemas de fermentação em lote in vitro. É importante ressaltar que este protocolo também pode ser modificado para investigar interações gerais entre outros endobióticos e microbiota intestinal.

Introdução

A microbiota intestinal desempenha um papel importante no funcionamento dos intestinos humanos e na saúde do hospedeiro. Consequentemente, a microbiota intestinal tornou-se recentemente um importante alvo para a prevenção e terapia da doença¹. Além disso, as bactérias do intestino interagem com as células intestinais do hospedeiro e regulam os processos de acolhimento fundamentais, incluindo atividades metabólicas, disponibilidades de nutrientes, modulação do sistema imunológico e até mesmo função cerebral e tomada de decisão^2,3 . Os endobióticos têm um potencial considerável para influenciar a composição bacteriana e a diversidade da microbiota intestinal. Assim, as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana têm atraído a atenção crescente da pesquisa^4,5,6,7,8,9.

É difícil avaliar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana in vivo devido à bioética e restrições econômicas. Por exemplo, experimentos que investigam as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana não podem ser realizados sem a permissão da administração de alimentos e drogas, e o recrutamento de voluntários é caro. Conseqüentemente, os modelos animais são usados frequentemente para tais investigações. No entanto, o uso de modelos animais é limitado devido a diferentes composições de microbiota e diversidade em comunidades animais vs. humanas associadas. Um método alternativo in vitro para explorar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana é através do uso de experimentos de cultura de lotes.

Os exopolissacarídeos (EPSs) são prebióticos que contribuem significativamente para a manutenção da saúde humana¹⁰. Os EPSS distintos que consistem em composições e em estruturas diferentes do monossacarídeos podem expor funções distintas. As análises prévias determinaram a composição de BIF EPSs, que são o xenobiótico representativo apontado no estudo atual¹¹. No entanto, os efeitos metabólicos associados ao hospedeiro não foram considerados em relação à composição e diversidade do EPS.

O protocolo descrito aqui usa a microbiota fecal de 12 voluntários para fermentar bif EPSs. A cromatografia de camada fina (TLC), o sequenciamento do gene 16S rRNA de alta taxa de transferência e a cromatografia gasosa (GC) são então usadas em combinação para investigar as interações entre EPSs e microbiota intestinal humana. As vantagens distintas deste protocolo em comparação com experimentos in vivo são seu baixo custo e evitação de efeitos interferentes do metabolismo do hospedeiro. Além disso, o protocolo descrito pode ser utilizado em outros estudos que investiguem interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana.

Protocolo

Este protocolo segue as directrizes do Comitê de éticas da Universidade de Hunan da ciência e da engenharia (Hunan, China), e da Universidade de Zhejiang GongShang (Zhejiang, China).

1. preparação de bactérias

1. Preparação do caldo médio Bifidobacterium
   1. Combine os seguintes componentes em 950 mL de água destilada: extrato de carne, 5 g/L; extrato de levedura, 5 g/L; peptona de caseína, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glicose, 10 g/L; K₂HPO₄, 2, 4 g/L; MgSO₄· 7h₂O, 0,22 g/L; MnSO₄. H₂0, 0, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 mL; solução salina, 40 mL (CaCl₂. 2h₂O, 0,25 g/L; KH₂po₄, 1 g/L; NaHCO₃, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); e resazurina, 0,4 mL (2,5 mg/L). Ajuste o pH a 6,8 com NaOH de 2 M.
   2. Autoclave a 121 ° c por 15 min e permitir que o caldo esfrie até a temperatura ambiente (RT) em condições anaeróbias (10% H₂, 10% co₂, 80% N₂). Adicionar filtro-esterilizado cysteine-HCl (0,5 g/L) e mupirocina (5 mg/L) para o meio.
2. Adicionar uma alíquota (50 μL) de Bifidobacterium longum congelado a um tubo de cultura com 5 ml de caldo médio Bifidobacterium em condições anaeróbias, em seguida, cultura em uma incubadora anaeróbia para 24 h a 37 ° c.

2. preparação de EPSs bifidobacterianos

1. Preparação do meio de agar PYG
   1. Combine o seguinte: peptona, 20 g/L; extrato de levedura, 10 g/L; glicose, 5 g/L; NaCl, 0, 8 g/L; CaCl₂, 0, 8 g/L; MgSO₄· 7h₂O, 0, 8 g/L; K₂HPO₄, 0, 4 g/L; KH₂po₄, 0, 4 g/L; NaHCO₃, 0,4 g/L; Agar, 12 g/L. Ajuste o pH para 7,2 usando NaOH de 10 M.
   2. Autoclave a mídia em 121 ° c por 15 min e arrefecer a ~ 50 ° c. Em seguida, por 1 L de meio, adicione 0,5 mL de solução de vitamina K₁ com filtro esterilizado (1 g de vitamina k₁ dissolvida em 99 mL de etanol a 99%), 5 ml de solução de hemina (0,5 g de hemina dissolvida em 1 ml de NaOH 1 mol/L , em seguida, trouxe até 100 mL com água destilada), e 0,5 g de cisteína-HCl.
   3. Antes de derramar as placas PYG, Adicionar filtro-esterilizado 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-GAL, 0, 6 g/L), LiCl · 3H₂o (5,7 g/l) e mupirocina (5 mg/l) para o meio.
      Nota: X-GAL e LiCl. 3H₂o permitem a identificação de colônias de B. longum em placas através de alterações de coloração.
2. Inocular 20 μL de estirpes de B. longum (passo 1,2) para placas de PYG e colocar numa incubadora anaeróbia a 37 ° c por 72 h.
3. Colete colônias bacterianas mucoides das placas PYG usando uma colher de pesagem e, em seguida, Ressuspender completamente em 10 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) usando um oscilador vortex.
   Nota: as misturas bacterianas e EPS devem ser rerespirados completamente por vortexing ou pipetagem para cima e para baixo repetidamente até que as fibras sejam completamente dissolvidas em PBS.
4. Centrifugar a suspensão a 6.000 x g durante 5 min.
5. Transfira cuidadosamente os sobrenadantes para um novo tubo de centrifugação e misture completamente com três volumes de etanol 99% frio por inversão repetida e mistura.
6. Centrifugue a mistura a 6.000 x g durante 5 min e retire completamente os sobrenadantes.
7. Remova os precipitados dos tubos de centrifugação raspando e secando os extratos do EPS durante a noite usando um vácuo da velocidade.

3. preparação do meio de fermentação

1. Preparação do meio de cultura básico VI
   1. Combine o seguinte: peptona, 3 g/L; triptona, 3 g/L; extrato de levedura, 4,5 g/L; mucin, 0,5 g/L; sais biliares n º 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl₂· 6h₂O, 4,5 g/L; 1 mL de Tween 80; CaCl₂. 6h₂O, 0,2 g/L; KH₂po₄, 0,4 g/L; MgSO₄· 7h₂O, 3,0 g/L; MnCl₂· 4h₂O, 0,32 g/L; FeSO₄· 7H2O, 0,1 g/L; CoSO₄· 7h₂O, 0,18 g/L; CaCl₂· 2h₂O, 0,1 g/L; ZnSO₄· 7h₂O, 0,18 g/L; CuSO₄· 5h₂O, 0, 1 g/L; e NiCl₂· 6h₂o, 0, 92 g/L. ajustar o pH para 6,5 com 1 M HCL.
   2. Prepare o haemin e o cisteína como feito na seção 2,1 e adicione após o autoclavagem e refrigerar.
2. Prepare mídia de cultura que contenha diferentes fontes de carbono com uma mídia base VI. Antes da autoclavagem, adicione 8 g/L de fibras de BIF EPS ao VI médio, compreendendo o grupo VI_Bif. Além disso, adicione 8 g/L de amido ao meio VI para representar o grupo VI_Starch. Finalmente, o VI médio sem adição de uma fonte de carbono é usado como o controle (grupo VI).
   Nota: o bif EPS e o amido são dissolvidos primeiramente na água quente usando um agitador magnético, misturado então com o meio preparado de VI.
3. Autoclave todos os meios a 121 ° c por 15 min e permitem esfriar a RT.
4. Transfira uma subamostra (5 mL) de cada meio para tubos de cultura em uma incubadora anaeróbia e armazene os suportes restantes a 4 ° c.

4. preparação fecal humana da amostra

1. Colete amostras fecais frescas imediatamente após a defecação fresca de voluntários humanos adultos saudáveis usando recipientes de fezes e, subsequentemente, use para preparação de chorume.
   Nota: antes da coleta da amostra, todos os voluntários devem ser rastreados para garantir a não recepção de antibióticos, probióticos ou tratamentos prebióticos por pelo menos 3 meses antes de doar amostras. Além disso, todos os doadores devem fornecer consentimento informado e por escrito.
2. Transfira uma amostra fecal fresca (1 g) a 10 mL do PBS anaeróbio de 0,1 M (pH 7,0) em copos de vidro, a seguir use as hastes de vidro para preparar uma pasta de 10% (w/v).
3. Use uma peneira de 0,4 mM para filtrar a pasta fecal. Em seguida, use uma subamostra da pasta filtrada para inocular experimentos de fermentação de cultura em lote e armazene o restante em-80 ° c para análises adicionais.
   Nota: as etapas 4.2 – 4.3 são conduzidas em uma câmara anaeróbia.

5. fermentação em lote in vitro

1. Adicionar pasta fecal filtrada (500 μL) ao meio de fermentação preparado na etapa 3,2 dentro de uma câmara anaeróbia, em seguida, incubar a 37 ° c.
2. Colete 2 mL de amostras fermentadas a 24 h e 48 h na câmara anaeróbia e depois Centrifugue fora da câmara a 6.000 x g durante 3 min.
3. Transfira com cuidado os sobrenadantes a um tubo de centrifugação novo que seja usado para a análise da degradação do polissacarídeo e as medidas dos ácidos gordos da curto-corrente (scfas).
4. Armazene as pelotas da centrifugação em-80 ° c e use subseqüentemente para a extração genomic bacteriana do ADN.

6. degradação do EPS pela microbiota fecal humana

1. Carregue 0,2 μL de sobrenadantes fermentados em placas de alumínio pré-revestidas de sílica gel-60 TLC e seque com um secador de cabelo.
2. Desenvolver as placas em 20 mL de um ácido fórmico/n-butanol/água (6:4:1, v:v: v) solução e secar usando um secador de cabelo.
3. Mergulhe as placas no reagente de orcinol para tingir, em seguida, seque usando um secador de cabelo.
   1. Prepare reagentes de orcinol dissolvendo 900 mg de Lichenol em 25 mL de água destilada, acrescentando 375 mL de etanol. Subsequentemente, o ácido sulfúrico concentrado deve ser lentamente adicionado e a solução completamente misturada.
4. Placas de calor a 120 ° c por 3 min em um forno de cozimento e avaliar a degradação do EPS através da medição de bandas TLC.

7. efeitos do EPS na microbiota intestinal humana

1. Congelar-degelo as amostras fecais originais preparadas na etapa 4,3 e amostras fermentadas preparadas na etapa 5,4.
2. Extraia o ADN genomic bacteriano (gDNA) de todas as amostras usando um jogo genomic bacteriano da extração do ADN do tamborete que segue as instruções do fabricante.
3. Determine as concentrações de DNA, integridades e distribuições de tamanho usando um microespectrofotômetro e eletroforese em gel de agar.
4. Conduza o PCR de genes bacterianos do rRNA 16S do gDNA extraído usando os seguintes primers para diante e reversos previamente descritos¹²:
   -primer Forward (código de barras primer 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
   -primer reverso (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
   Use as seguintes condições de ciclador térmico:
   1. 94 ° c por 5 min.
   2. 94 ° c por 30 s.
   3. 55 ° c por 30 s.
   4. 72 ° c por 1 min.
   5. Repita 2 – 4 para 35 ciclos
   6. 72 ° c por 5 min.
   7. 4 ° c segure até a remoção do termociclador.
5. Conduza o sequenciamento de alta produtividade de produtos de PCR em uma empresa de sequenciamento de DNA usando análise de comunidade microbiana de alto débito.
6. Obtenha sequências limpas e de alta qualidade usando o pipeline de análise quantitativa de insights quantitativos em ecologia microbiana (QIIME)¹³.
7. Definir unidades taxonômicas operacionais (OTUs) para sequências de genes rRNA 16S com maior que 97% de similaridade de nucleotídeo utilizando ferramentas de Bioinformática como o Mothur Software Suite¹⁴.
8. Escolha uma sequência representativa de cada OTU e use o classificador RDP junto com o banco de dados taxonômico SILVA para classificar as sequências representativas¹⁵.
9. Calcule a cobertura de Good, as métricas de diversidade alfa (incluindo o índice de Simpson e Shannon) e a riqueza (número observado de OTUs) usando as ferramentas de Bioinformática¹⁶.

8. efeitos do EPS na produção de SCFA por microbiota intestinal humana

1. Adicionar sobrenadantes fermentados (1 mL) preparados na etapa 5,3 a 2 mL de tubos de centrifugação.
2. Adicione 0,2 mL de ácido metaposfórico a 25% (p/v) a cada uma das amostras e misture cuidadosamente as soluções por vortexing.
3. Centrifugue as misturas a 13.000 x g durante 20 min e transfira os sobrenadantes para tubos frescos.
4. Concomitantemente, prepare soluções de 120 mM de ácido acético, propiônico, butírico, isobutírico, valérico e isovalérico. Em seguida, adicione 1 mL de cada ácido preparado a 1,2 mL de ácido metaposfórico a 25% (p/v) e utilize como cocktails padrão.
5. Filtre as amostras usando uma membrana de 0,22 μM.
6. Detecte concentrações de scfa utilizando cromatografia gasosa de alta performance de acordo com os protocolos descritos anteriormente^11,17.
   Nota: uma coluna de InertCap FFAP (0,25 mM x 30 m x 0,25 μM) é utilizada para cromatografia gasosa (GC). As concentrações de SCFA são então quantificadas com base em áreas de pico usando o método padrão interno de ponto único no pacote de software GC Solution.

Resultados

A produção de EPS mucoide pode ser observada em culturas de B. longum em placas de PYG após incubação anaeróbia por 72 h (Figura 1a). A centrifugação de raspagens de cultura, seguida pela precipitação e secagem do etanol, resultou na coleta de EPS celulose-like (Figura 1b). EPS secos e amido solúvel foram então utilizados como fontes de carbono para culturas de fermentação. O TLC foi utilizado para análise de separação e pureza de oligo...

Discussão

Registaram-se progressos significativos no sentido da compreensão da composição e das actividades da microbiota intestinal humana na última década. Como consequência desses estudos, surgiu o conceito de holobiont, que representa as interações entre hospedeiros e comunidades microbianas associadas, como entre humanos e sua microbiota intestinal^19,20. Além disso, os seres humanos são considerados mesmo agora como superorganismos²¹,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm membrane filters	Millipore	SLGP033RB	Use to filter samples
0.4-mm Sieve	Thermo Fischer	308080-99-1	Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Solarbio	X1010	Use to prepare color plate
Acetic	Sigma-Aldrich	71251	Standard sample for SCFA
Agar	Solarbio	YZ-1012214	The component of medium
Anaerobic chamber	Electrotek	AW 400SG	Bacteria culture and fermentation
Autoclave	SANYO	MLS-3750	Use to autoclave
Bacto soytone	Sigma-Aldrich	70178	The component of medium
Baking oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A	Use to heat and bake
Beef Extract	Solarbio	G8270	The component of medium
Bifidobacterium longum Reuter	ATCC	ATCC® 51870™	Bacteria
Bile Salts	Solarbio	YZ-1071304	The component of medium
Butyric	Sigma-Aldrich	19215	Standard sample for SCFA
CaCl2	Solarbio	C7250	Salt solution of medium
Capillary column	SHIMADZU-GL	InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm)	Used to SCFA detection
Casein Peptone	Sigma-Aldrich	39396	The component of medium
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall ST 8	Use for centrifugation
CoSO4.7H2O	Solarbio	C7490	The component of medium
CuSO4.5H2O	Solarbio	203165	The component of medium
Cysteine-HCl	Solarbio	L1550	The component of medium
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2O	Solarbio	YZ-111614	The component of medium
Formic Acid	Sigma-Aldrich	399388	Used to TLC
Gas chromatography	Shimadzu Corporation	GC-2010 Plus	Used to SCFA detection
Glass beaker	Fisher Scientific	FB10050	Used for slurry preparation
Glucose	Solarbio	G8760	The component of medium
Haemin	Solarbio	H8130	The component of medium
HCl	Sigma-Aldrich	30721	Basic solution used to adjust the pH of the buffers
Isobutyric	Sigma-Aldrich	46935-U	Standard sample for SCFA
Isovaleric Acids	Sigma-Aldrich	129542	Standard sample for SCFA
K2HPO4	Solarbio	D9880	Salt solution of medium
KCl	Solarbio	P9921	The component of medium
KH2PO4	Solarbio	P7392	Salt solution of medium
LiCl.3H2O	Solarbio	C8380	Use to prepare color plate
Meat Extract	Sigma-Aldrich-Aldrich	70164	The component of medium
Metaphosphoric Acid	Sigma-Aldrich	B7350	Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2O	Solarbio	M8160	The component of medium
MgSO4.7H2O	Solarbio	M8300	Salt solution of medium
MISEQ	Illumina	MiSeq 300PE system	DNA sequencing
MnSO4.H20	Sigma-Aldrich	M8179	Salt solution of medium
Mupirocin	Solarbio	YZ-1448901	Antibiotic
NaCl	Solarbio	YZ-100376	Salt solution of medium
NaHCO3	Sigma-Aldrich	792519	Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000	NanoDrop Technologies	ND-2000	Determine DNA concentrations
NaOH	Sigma-Aldrich	30620	Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanol	ChemSpider	71-36-3	Used to TLC
NiCl2	Solarbio	746460	The component of medium
Orcinol	Sigma-Aldrich	447420	Used to prepare orcinol reagents
Propionic	Sigma-Aldrich	94425	Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit	QIAGEN	51504	Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powder	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A610100-0001	Used to prepare the lipid suspension
Resazurin	Solarbio	R8150	Anaerobic Equipment
Speed Vacuum Concentrator	LABCONCO	CentriVap	Use to prepare EPSs
Starch	Solarbio	YZ-140602	Use to the carbon source
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	150692	Used to prepare orcinol reagents
T100 PCR	BIO-RAD	1861096	PCR amplification
TLC aluminium sheets	MerckMillipore	116835	Used to TLC
Trypticase Peptone	Sigma-Aldrich	Z699209	The component of medium
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293	The component of medium
Tween 80	Solarbio	T8360	Salt solution of medium
Valeric	Sigma-Aldrich	75054	Standard sample for SCFA
Vitamin K1	Sigma-Aldrich	V3501	The component of medium
Vortex oscillator	Scientific Industries	Vortex.Genie2	Use to vortexing
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625	The component of medium
ZnSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251	The component of medium