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Résumé

Décrit ici est un protocole pour étudier les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain utilisant des systèmes de fermentation in vitro de lot.

Résumé

Les micro-organismes intestinaux humains sont récemment devenus une cible importante de la recherche dans la promotion de la santé humaine et la prévention des maladies. Par conséquent, les études sur les interactions entre les endobiotiques (p. ex., les médicaments et les prébiotiques) et le microbiote intestinal sont devenues un sujet de recherche important. Cependant, les expériences in vivo avec des volontaires humains ne sont pas idéales pour de telles études en raison de la bioéthique et des contraintes économiques. En conséquence, des modèles animaux ont été utilisés pour évaluer ces interactions in vivo. Néanmoins, les études de modèles animaux sont encore limitées par des considérations de bioéthique, en plus de compositions et de diversités différentes du microbiote chez les animaux par rapport aux humains. Une autre stratégie de recherche est l'utilisation d'expériences de fermentation par lots qui permettent d'évaluer les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal in vitro. Pour évaluer cette stratégie, les exopolysaccharides bifidobactériens (Bif) ont été utilisés comme xénobiotique représentatif. Ensuite, les interactions entre Bif EPS et le microbiote intestinal humain ont été étudiées à l'aide de plusieurs méthodes telles que la chromatographie à couches minces (TLC), l'analyse compositionnelle de la communauté bactérienne avec le séquençage à haut débit du gène rRNA 16S et la chromatographie gazeuse. d'acides gras à chaîne courte (SCFA). Présenté ici est un protocole pour étudier les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l'aide de systèmes de fermentation par lots in vitro. Fait important, ce protocole peut également être modifié pour étudier les interactions générales entre d'autres endobiotiques et le microbiote intestinal.

Introduction

Le microbiote intestinal joue un rôle important dans le fonctionnement des intestins humains et dans la santé de l'hôte. Par conséquent, le microbiote intestinal est récemment devenu une cible importante pour la prévention et la thérapie des maladies1. En outre, les bactéries intestinales interagissent avec les cellules intestinales hôtes et régulent les processus fondamentaux de l'hôte, y compris les activités métaboliques, les disponibilités nutritives, la modulation du système immunitaire, et même la fonction cérébrale et la prise de décision2,3 . Les endobiotiques ont un potentiel considérable pour influencer la composition bactérienne et la diversité du microbiote intestinal. Ainsi, les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain ont attiré l'attention croissante de la recherche4,5,6,7,8,9.

Il est difficile d'évaluer in vivo les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain en raison de la bioéthique et des contraintes économiques. Par exemple, des expériences sur les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain ne peuvent être réalisées sans la permission de la Food and Drug Administration, et le recrutement de volontaires coûte cher. Par conséquent, les modèles animaux sont souvent utilisés pour de telles enquêtes. Cependant, l'utilisation de modèles animaux est limitée en raison de différentes compositions de microbiotes et de la diversité dans les communautés associées aux animaux par rapport à l'homme. Une autre méthode in vitro pour explorer les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain est l'utilisation d'expériences de culture par lots.

Les exopolysaccharides (EPS) sont des prébiotiques qui contribuent de manière significative au maintien de la santé humaine10. Les EPS distincts qui se composent de différentes compositions et structures monosaccharides peuvent présenter des fonctions distinctes. Des analyses antérieures ont déterminé la composition des EPS Bif, qui sont le xénobiotique représentatif visé dans la présente étude11. Cependant, les effets métaboliques associés à l'hôte n'ont pas été pris en considération en ce qui concerne la composition et la diversité de l'EPS.

Le protocole décrit ici utilise le microbiote fécal de 12 volontaires pour fermenter les EPS Bif. La chromatographie à couches minces (TLC), le séquençage à haut débit du gène 16S rRNA et la chromatographie gazeuse (GC) sont ensuite utilisés en combinaison pour étudier les interactions entre les SPE et le microbiote intestinal humain. Les avantages distincts de ce protocole par rapport aux expériences in vivo sont son faible coût et l'évitement des effets d'interférence du métabolisme de l'hôte. En outre, le protocole décrit peut être utilisé dans d'autres études qui étudient les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain.

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Protocole

Ce protocole suit les lignes directrices du comité d'éthique de l'Université des sciences et de l'ingénierie du Hunan (Hunan, Chine) et de l'Université Zhejiang Gongshang (Zhejiang, Chine).

1. Préparation des bactéries

  1. Préparation du bouillon bifidobacterium moyen
    1. Mélanger les composants suivants dans 950 ml d'eau distillée : extrait de viande, 5 g/L; extrait de levure, 5 g/L; peptone de caséine, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glucose, 10 g/L; K2HPO4, 2,04 g/L; MgSO47H2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Entre-4 80, 1 ml; solution de sel, 40 mL (CaCl2.2H2O, 0,25 g/L; KH2PO4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); et la résine, 0,4 ml (2,5 mg/L). Ajuster le pH à 6,8 avec 2 M NaOH.
    2. Autoclave à 121 oC pendant 15 min et laisser refroidir le bouillon à température ambiante (RT) dans des conditions anaérobies (10 % H2, 10 % CO2, 80 % N2). Ajouter la cystéine-HCl stérilisée par filtre (0,5 g/L) et la mupirocine (5 mg/L) au milieu.
  2. Ajouter un aliquot (50 l) de Bifidobacterium longum congelé à un tube de culture avec 5 ml de bouillon bifidobacterium moyen dans des conditions anaérobies, puis la culture dans un incubateur anaérobie pendant 24 h à 37 oC.

2. Préparation des EPS bifidobactériens

  1. Préparation du milieu d'agar PYG
    1. Combiner ce qui suit : peptone, 20 g/L; extrait de levure, 10 g/L; glucose, 5 g/L; NaCl, 0,08 g/L; CaCl2, 0,008 g/L; MgSO47H2O, 0,008 g/L; K2HPO4, 0,04 g/L; KH2PO4, 0,04 g/L; NaHCO3, 0,4 g/L; agar, 12 g/L. Ajuster le pH à 7,2 à l'aide de 10 M NaOH.
    2. Autoclave zèle le support à 121 oC pendant 15 min et refroidissez-le à 50 oC. Puis, par 1 L de milieu, ajouter 0,5 mL de vitamine K1 stérolisée par filtre (1 g de vitamine K1 dissous en 99 ml d'éthanol à 99 %), 5 mL de solution d'hémin (0,5 g d'hémindin dissous en 1 ml de 1 mol/L NaOH , a ensuite apporté jusqu'à 100 ml avec de l'eau distillée), et 0,5 g de cystéine-HCl.
    3. Avant de verser les plaques PYG, ajouter les plaques PYG stérilisées 5-bromo-4-chloro-3-indolylMD-D-galactopyranoside (X-Gal, 0,06 g/L), LiCl-3H2O (5,7 g/L) et mupirocin (5 mg/L) au milieu.
      REMARQUE : X-Gal et LiCl.3H2O permettent l'identification des colonies de Longum de B. sur des plaques par des changements de coloration.
  2. Inoculer 20 oL de souches de B. longum (étape 1.2) aux plaques PYG et placer dans un incubateur anaérobie à 37 oC pendant 72 h.
  3. Recueillir les colonies bactériennes mucoïdes des plaques PYG à l'aide d'une pelle de pesage, puis resuspendre complètement dans 10 ml de saline tamponnée de phosphate (PBS) à l'aide d'un oscillateur vortex.
    REMARQUE : Les mélanges bactériens et EPS doivent être complètement suspendus par le vortex ingou vers le haut ou le tuyautt de haut en bas à plusieurs reprises jusqu'à ce que les fibres soient complètement dissous dans PBS.
  4. Centrifugelant la suspension à 6 000 x g pendant 5 min.
  5. Transférer soigneusement les supernatants dans un nouveau tube de centrifugeuse et mélanger complètement avec trois volumes d'éthanol froid à 99 % par inversion et mélange répétés.
  6. Centrifuger le mélange à 6 000 x g pendant 5 min et retirer complètement les supernatants.
  7. Retirer les précipités des tubes de centrifugeuse en grattant et en séchant les extraits d'EPS pendant la nuit à l'aide d'un aspirateur de vitesse.

3. Préparation du milieu de fermentation

  1. Préparation de la culture de base moyen VI
    1. Combiner ce qui suit : peptone, 3 g/L; tryptone, 3 g/L; extrait de levure, 4,5 g/L; mucine, 0,5 g/L; sels de bile no 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl26H2O, 4,5 g/L; 1 mL Tween 80; CaCl2.6H2O, 0.2 g/L; KH2PO4, 0,4 g/L; MgSO47H2O, 3,0 g/L; MnCl24H2O, 0,32 g/L; FeSO47H2O, 0,1 g/L; CoSO47H2O, 0,18 g/L; CaCl2H2O, 0,1 g/L; ZnSO47H2O, 0,18 g/L; CuSO45H2O, 0,01 g/L; et NiCl2x 6H2O, 0,092 g/L. Ajuster le pH à 6,5 avec 1 M HCl.
    2. Préparer l'hémine et la cystéine comme fait dans la section 2.1 et ajouter après l'autoclacage et le refroidissement.
  2. Préparer des supports culturels qui contiennent différentes sources de carbone avec un média de base VI. Avant l'autoclacnage, ajouter 8 g/L de fibres Bif EPS à un VI moyen, comprenant le groupe VI-Bif. De plus, ajoutez 8 g/L d'amidon à un ive moyen pour représenter le groupe VI-Starch. Enfin, le moyen VI sans ajout d'une source de carbone est utilisé comme contrôle (groupe VI).
    REMARQUE : Le Bif EPS et l'amidon sont d'abord dissous dans l'eau chaude à l'aide d'un agitateur magnétique, puis mélangés à un milieu VI préparé.
  3. Autoclave tous les médias à 121 oC pendant 15 min et laisser refroidir à RT.
  4. Transférer un sous-échantillon (5 ml) de chaque milieu dans des tubes de culture dans un incubateur anaérobie, et conserver le support restant à 4 oC.

4. Préparation d'échantillons fécaux humains

  1. Recueillir des échantillons de matières fécales fraîches immédiatement après la défécation fraîche de volontaires humains adultes en bonne santé à l'aide de récipients d'excréments, et ensuite utiliser pour la préparation de boue.
    REMARQUE : Avant la collecte de l'échantillon, tous les volontaires devraient subir un dépistage afin de s'assurer qu'ils ne reçoivent pas d'antibiotiques, de probiotiques ou de traitements prébiotiques pendant au moins 3 mois avant de donner des échantillons. De plus, tous les donateurs doivent fournir un consentement éclairé et écrit.
  2. Transférer un échantillon fécal frais (1 g) à 10 ml de 0,1 M DE PBS anaérobie (pH 7,0) dans des béchers en verre, puis utiliser des tiges de verre pour préparer une boue de 10 % (w/v).
  3. Utilisez un tamis de 0,4 mM pour filtrer la boue fécale. Ensuite, utilisez un sous-échantillon de la boue filtrée pour inoculer les expériences de fermentation de la culture par lots, et entreposez le reste à -80 oC pour d'autres analyses.
    REMARQUE : Les étapes 4.2-4.3 sont effectuées dans une chambre anaérobie.

5. Fermentation par lots in vitro

  1. Ajouter la boue fécale filtrée (500 l) au milieu de fermentation préparé à l'étape 3.2 dans une chambre anaérobie, puis incuber à 37 oC.
  2. Recueillir 2 ml d'échantillons fermentés à 24 h et 48 h dans la chambre anaérobie, puis centrifuger à l'extérieur de la chambre à 6 000 x g pendant 3 min.
  3. Transférer soigneusement les supernatants dans un nouveau tube de centrifugeuse qui sera utilisé pour l'analyse de la dégradation des polysaccharides et les mesures des acides gras à chaîne courte (SCFA).
  4. Entreposer les granulés de centrifugation à -80 oC et les utiliser par la suite pour l'extraction de l'ADN génomique bactérien.

6. Dégradation de l'EPS par le microbiote fécal humain

  1. Chargez 0,2 L de supernatants fermentés sur des plaques d'aluminium en silice pré-enduite 60 TLC, puis séchez à l'aide d'un sèche-cheveux.
  2. Développer les plaques dans 20 ml d'un acide formique / n-butanol / eau (6:4:1, v:v:v) solution et sécher à l'aide d'un sèche-cheveux.
  3. Faire tremper les assiettes dans le réactif orcinol pour les colorer, puis sécher à l'aide d'un sèche-cheveux.
    1. Préparer les réactifs orcinol en dissolvant 900 mg de Lichenol dans 25 ml d'eau distillée, puis en ajoutant 375 ml d'éthanol. Par la suite, l'acide sulfurique concentré devrait être lentement ajouté et la solution complètement mélangée.
  4. Chauffer les plaques à 120 oC pendant 3 min dans un four à pâtisserie et évaluer la dégradation de l'EPS en mesurant les bandes de TLC.

7. Effets de l'EPS sur le microbiote intestinal humain

  1. Décongeler-décongeler les échantillons fécaux originaux préparés à l'étape 4.3 et les échantillons fermentés préparés à l'étape 5.4.
  2. Extraire l'ADN génomique bactérien (ADNG) de tous les échantillons à l'aide d'une trousse d'extraction d'ADN génomique bactérien des selles suivant les instructions du fabricant.
  3. Déterminer les concentrations d'ADN, les intégrosités et les distributions de taille à l'aide d'un micro-spectrophotomètre et d'une électrophorèse de gel d'agar.
  4. Conduisez PCR des gènes bactériens 16S rRNA de l'ADNc extrait à l'aide des amorces avant et inverses décrites précédemmentprécédemment 12:
    - Amorce avant (amorce à code à barres 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCACA
    -amorce inversée (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
    Utilisez les conditions suivantes :
    1. 94 oC pendant 5 min.
    2. 94 oC pour 30 s.
    3. 55 oC pour 30 s.
    4. 72 oC pour 1 min.
    5. Répéter 2 à 4 pendant 35 cycles
    6. 72 oC pendant 5 min.
    7. 4 oC jusqu'à l'enlèvement du cycleur thermique.
  5. Effectuer un séquençage à haut débit des produits PCR dans une entreprise de séquençage de l'ADN à l'aide d'une analyse communautaire microbienne à très haut débit.
  6. Obtenir des séquences propres et de haute qualité à l'aide du pipeline d'analyse de séquences13.
  7. Définir les unités taxonomiques opérationnelles (OTUs) pour les séquences de gènes 16S rRNA avec plus de 97% de similitude nucléotide à l'aide d'outils bioinformatiques tels que la suite logicielle Mothur14.
  8. Choisissez une séquence représentative de chaque OTU et utilisez le classificateur RDP avec la base de données taxonomique SILVA pour classer les séquences représentatives15.
  9. Calculer la couverture de Good, les mesures de la diversité alpha (y compris l'indice Simpson et Shannon) et la richesse (nombre observé d'OTUs) à l'aide d'outils de bioinformatique16.

8. Effets de l'EPS sur la production de SCFA par microbiote intestinal humain

  1. Ajouter les supernatants fermentés (1 ml) préparés à l'étape 5,3 à 2 ml de tubes centrifugeurs.
  2. Ajouter 0,2 ml d'acide métaphosphorique de 25 % (w/v) à chacun des échantillons et mélanger soigneusement les solutions par vortex.
  3. Centrifuger les mélanges à 13 000 x g pendant 20 min et transférer les supernatants dans des tubes frais.
  4. En même temps, préparez des solutions de 120 mM d'acides acétiques, propioniques, butyriques, isobutyriques, valeriques et isovaleric. Ensuite, ajouter 1 ml de chaque acide préparé à 1,2 ml de 25 % (w/v) d'acide métaphosphorique et utiliser comme cocktails standard.
  5. Filtrer les échantillons à l'aide d'une membrane de 0,22 M.
  6. Détecter les concentrations de SCFA à l'aide d'une chromatographie gazeuse de haute performance selon les protocoles précédemment décrits11,17.
    REMARQUE : Une colonne InertCap FFAP (0,25 mM x 30 m x 0,25 M) est utilisée pour la chromatographie gazeuse (GC). Les concentrations de SCFA sont ensuite quantifiées en fonction des zones de pointe en utilisant la méthode standard interne à un seul point dans le logiciel GC Solution.

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Résultats

La production d'EPS mucoid a pu être observée dans les cultures De B. longum sur les plaques PYG après incubation anaérobie pendant 72 h (figure 1A). La centrifugation des égratignures de culture, suivie des précipitations et du séchage de l'éthanol, a donné lieu à la collecte d'EPS semblables à la cellulose (figure 1B). L'EPS séché et l'amidon soluble ont ensuite été utilisés comme sources de carbone pour les cultures de fermentation. T...

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Discussion

Des progrès significatifs ont été réalisés vers la compréhension de la composition et des activités du microbiote intestinal humain au cours de la dernière décennie. À la suite de ces études, le concept holobiont a émergé, qui représente les interactions entre les hôtes et les communautés microbiennes associées, comme entre les humains et leur microbiote intestinal19,20. En outre, les humains sont même maintenant considérés comme des super-org...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas de conflits d'intérêts. Les chiffres ont été cités dans Yin et al. 11.

Remerciements

Cette étude a été financée par la National Nature Science Foundation of China (no 31741109), la Hunan Natural Science Foundation (no 2018JJJ300) et le programme de construction de la discipline caractéristique appliquée à l'Université des sciences et de l'ingénierie du Hunan. Nous remercions LetPub (www.letpub.com) pour son aide linguistique lors de la préparation de ce manuscrit.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm membrane filtersMilliporeSLGP033RBUse to filter samples
0.4-mm SieveThermo Fischer308080-99-1Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal)SolarbioX1010Use to prepare color plate
AceticSigma-Aldrich71251Standard sample for SCFA
AgarSolarbioYZ-1012214The component of medium
Anaerobic chamberElectrotek AW 400SGBacteria culture and fermentation
AutoclaveSANYOMLS-3750Use to autoclave
Bacto soytoneSigma-Aldrich70178The component of medium
Baking ovenShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240AUse to heat and bake
Beef ExtractSolarbioG8270The component of medium
Bifidobacterium longum ReuterATCCATCC® 51870™Bacteria
Bile SaltsSolarbioYZ-1071304The component of medium
ButyricSigma-Aldrich19215Standard sample for SCFA
CaCl2SolarbioC7250Salt solution of medium
Capillary columnSHIMADZU-GLInertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm)Used to SCFA detection
Casein PeptoneSigma-Aldrich39396The component of medium
CentrifugeThermo ScientificSorvall ST 8Use for centrifugation
CoSO4.7H2OSolarbioC7490The component of medium
CuSO4.5H2OSolarbio203165The component of medium
Cysteine-HClSolarbioL1550The component of medium
EthanolSigma-AldrichE7023Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2OSolarbioYZ-111614The component of medium
Formic AcidSigma-Aldrich399388Used to TLC
Gas chromatographyShimadzu CorporationGC-2010 PlusUsed to SCFA detection
Glass beakerFisher ScientificFB10050Used for slurry preparation
GlucoseSolarbioG8760The component of medium
HaeminSolarbioH8130The component of medium
HClSigma-Aldrich30721Basic solution used to adjust the pH of the buffers
IsobutyricSigma-Aldrich46935-UStandard sample for SCFA
Isovaleric AcidsSigma-Aldrich129542Standard sample for SCFA
K2HPO4SolarbioD9880Salt solution of medium
KClSolarbioP9921The component of medium
KH2PO4SolarbioP7392Salt solution of medium
LiCl.3H2OSolarbioC8380Use to prepare color plate
Meat ExtractSigma-Aldrich-Aldrich70164The component of medium
Metaphosphoric AcidSigma-AldrichB7350Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2OSolarbioM8160The component of medium
MgSO4.7H2OSolarbioM8300Salt solution of medium
MISEQIlluminaMiSeq 300PE systemDNA sequencing
MnSO4.H20Sigma-AldrichM8179Salt solution of medium
MupirocinSolarbioYZ-1448901Antibiotic
NaClSolarbioYZ-100376Salt solution of medium
NaHCO3Sigma-Aldrich792519Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000NanoDrop TechnologiesND-2000Determine DNA concentrations
NaOHSigma-Aldrich30620Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanolChemSpider71-36-3Used to TLC
NiCl2Solarbio746460The component of medium
OrcinolSigma-Aldrich447420Used to prepare orcinol reagents
PropionicSigma-Aldrich94425Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini KitQIAGEN51504Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powderSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A610100-0001Used to prepare the lipid suspension
ResazurinSolarbioR8150Anaerobic Equipment
Speed Vacuum ConcentratorLABCONCOCentriVapUse to prepare EPSs
StarchSolarbioYZ-140602Use to the carbon source
Sulfuric AcidSigma-Aldrich150692Used to prepare orcinol reagents
T100 PCRBIO-RAD1861096PCR amplification
TLC aluminium sheetsMerckMillipore116835Used to TLC
Trypticase PeptoneSigma-AldrichZ699209The component of medium
TryptoneSigma-AldrichT7293The component of medium
Tween 80SolarbioT8360Salt solution of medium
ValericSigma-Aldrich75054Standard sample for SCFA
Vitamin K1Sigma-AldrichV3501The component of medium
Vortex oscillatorScientific IndustriesVortex.Genie2Use to vortexing
Yeast ExtractSigma-AldrichY1625The component of medium
ZnSO4.7H2OSigma-AldrichZ0251The component of medium

Références

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