使用荧光宏镜检查,通过"完整小鼠头骨"进行脑脊液传输的 Vivo 成像

摘要

颅内光学成像允许通过完整的头骨在活小鼠皮层中对脑脊液进行宽场成像。

摘要

啮齿动物的脑脊液(CSF)流动主要使用示踪剂的活体定量进行研究。双光子显微镜和磁共振成像(MRI)等技术在体内实现了CSF流量的定量,但分别受到成像体积减少和空间分辨率低的限制。最近的研究发现,CSF通过围绕啮齿动物皮层的皮层和穿透动脉周围的血管空间网络进入脑血管瘤。CSF的这种血管外进入是淋巴系统的主要驱动力,这是一种与清除有毒代谢溶质(例如淀粉样蛋白-β)有关的途径。在这里,我们演示了一种新的宏观成像技术,它允许通过活小鼠的完整头骨对荧光CSF示踪剂进行实时、中观成像。这种微创方法有助于多种实验设计,并支持对CSF动力学进行单次或重复测试。宏镜具有高空间和时间分辨率,其较大的龙门和工作距离允许在行为设备上执行任务时进行成像。这种成像方法已通过从该技术获得的双光子成像和荧光测量与外源荧光和无线电标记示踪剂的定量密切相关。在此协议中,我们描述了如何使用颅内宏观成像来评估活小鼠的淋巴迁移,为更昂贵的成像模式提供了一种可获取的替代方法。

引言

脑脊液(CSF)沐浴大脑和脊髓,并参与维持平衡,提供营养,调节颅内压力1。在亚阿拉奇诺伊空间的 CSF 通过周围皮动脉的周围血管空间 ( PVS ) 网络进入大脑 , 然后沿着穿透性^{动脉 2}向动。一旦进入脑膜,CSF与间质流体(ISF)交换,携带有害的代谢物,如淀粉样蛋白-β(A+)和tau蛋白聚集于大脑,通过低电阻白质道和渗透空间2,3.这种途径依赖于星体水孢素-4(AQP4)通道,因此被称为胶质淋巴(淋巴)系统4。神经桩的废物最终通过颅神经附近的淋巴血管和脑向宫颈淋巴^结5清除从CSF-ISF。这个系统的失败与多种神经疾病有关,如阿尔茨海默氏病6、7、创伤性脑损伤3、缺血和出血性^中风8。

CSF运输可以通过注入示踪剂到蓄水池(CM)9,10和淋巴研究,在过去主要使用双光子显微镜4,11,12, ¹³、磁共振成像(MRI)14、15、16、17、前体成像3、6、11、¹⁸以评估示踪动力学。双光子显微镜是一种合适的方法,用于在PVS和parenchyma中对CSF示踪剂进行详细成像,由于其空间分辨率高,但是,它有一个狭窄的视野,需要侵入性颅窗口或颅骨变薄。外生成像,结合免疫组织化学,可实现从单个细胞到整个^大脑19的多层次分析。然而,观察验尸组织所需的灌注固定过程在CSF流动方向上产生深刻变化,使PVS崩溃,显著改变示踪^剂12的分布和位置。最后,虽然MRI可以跟踪整个鼠和人脑的CSF流,但它缺乏血管外流动的空间和时间分辨率。

一项新技术,即颅内宏观成像,通过在活小鼠的整个背皮层中实现血管外脑CSF传输的广域成像,解决了其中一些局限性。这种类型的成像是使用多波段滤波器立方体、可调LED光源和高效CMOS^摄像机10的荧光宏镜完成的。这些设置能够解决PVS高达1-2毫米以下的头骨表面,并可以检测荧光团高达5-6毫米以下的皮质表面,同时保持头骨完全^完整10。能够快速调整激发波长的多波段滤波器和 LED 能够使用多个荧光团,使 CSF 在同一实验中具有不同分子量和化学特性的示踪剂。

这个过程需要一个简单的,微创手术,以暴露头骨和放置一个轻量级的头板,以稳定头部在成像过程中。追踪器可以交付到CM,而无需钻入头骨或穿透皮质组织与移液器或管9,20。与传统的端点可视化相比,CM 管和头板在数天到数周内保持稳定,便于进行更复杂的实验设计。该协议描述了在急性或慢性荧光CSF示踪剂注射到麻醉/睡眠或清醒小鼠的CM中后,如何利用颅内宏观成像来研究淋巴系统功能。

研究方案

所有实验均获得罗切斯特大学动物资源委员会(UCAR,第2011-023号议定书)的批准,并根据NIH《实验室动物护理和使用指南》进行。

1. 准备蓄水池、头板和头架

1. 手术前对所有手术器械和头板进行消毒。
   注:荧光示踪剂通过蓄水池直接输送到CSF。有关本程序的详细说明,请参阅 Xavier 等人⁹。
2. 简单地说,使用针驱动器,将 30G x 12.7 mm(1/2 英寸)针头的尖端打碎,将针头的钝端插入聚乙烯 10 (PE10) 管的一端(长约 45 厘米)。确保只有斜面伸出 PE10 管的边界。
3. 断开另一根 30G 针头的 1/4,并将剩余针头的钝端放入 PE10 管的另一端,塑料 Luer 锁仍然连接。
4. 向 100 μL 玻璃注射器填充无菌、人工 CSF (aCSF: 126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH₂PO₄, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl_2,10 mM 葡萄糖, 和 26 mM NaHCO₃)
5. 将注射器连接到管线末端,然后用 ACSF 填充,直到其到达倾斜针的尖端。重要的是,注射器回填有CSF,而不是空气,因为空气柱更容易产生可变的输注量。
6. 对于慢性实验,请保留充满 CSF 的行并跳过步骤 1.7。
7. 对于急性实验,将注射器放在输液泵上,并排出大约 5 mm 的空气,以防止混合。之后,提取实验所需的示踪剂总量(由于死区损失,建议额外增加 20%)。
   注:PE10 管应足够长,以便气泡在装载示踪剂时不会进入玻璃注射器的塑料袖口。对于典型的实验,该协议使用10μL的牛血清白蛋白与Alexa Fluor 647(BSA-647)结合在ACSF中稀释0.5%。
8. 确认头板适合头盖,并且其尺寸适合正在使用的鼠标。解剖学标记,以确保这是:窗口的顶部边框与眼间线对齐,后边界落在玫瑰峰。
   注:不锈钢头板可以消毒和重复使用。大多数氰丙烯酸酯混合物都可以用丙酮溶液去除。

2. 外科手术

1. 称重和麻醉小鼠(例如氯胺酮/西他津;100毫克/千克氯胺酮,10毫克/千克木兰辛;即p.)。
2. 一旦鼠标不再对脚趾挤压做出反应,用无菌水润湿颈部和头部,并使用剪子进行修剪。刮毛后,再次用酒精拭子擦拭区域,以去除任何残留的头发。
   注:在修剪前润湿毛皮可显著减少切口后成像窗口中的头发量。
3. 将鼠标放在温度控制垫顶部的立体定向框架中,并在鼠标眼睛上涂上石油眼膏,以确保它们不会干燥。
4. 用氯西丁拭子清洁暴露的皮肤。2分钟后,用酒精擦拭去除氯西丁。最后,应用碘溶液,可以留在干燥。
5. 将皮下痛感(0.25%布皮瓦卡因HCl)注射到颅骨和颈部顶部。
6. 从覆盖胸腔顶的颈部部分开始,在上覆的皮肤上进行中线切割,然后继续旋转地向轨道间线方向。横向倾斜到边界,其中时间肌肉插入头骨。去除紫红色切口的所有皮肤,以暴露正面和前额骨骼。
   注意:逆轨主脸位于眼睛的上部,后面部静脉的大分支位于皮纳的玫瑰色。在进行切口以腾出这些结构时要小心。如果发生这种情况,通过使用无菌棉签保持止血,停止出血,并持续几分钟。
7. 用无菌盐水灌溉头骨,用棉签清洁表面,使其没有碎屑和毛发,因为这些会干扰图像质量。头骨透明度最好保持,保持围膜和上覆筋膜完好无损。
   注:如果这些结构被意外移除,头骨可能会随着时间的推移变得干燥和不透明。在急性实验中,用ACSF重新润湿或使用石蜡油和甘油的混合物来减少头骨反射^率21。
8. 继续插入蓄水池麦格纳管 - 手术细节的这个程序,请参阅Xavier等人9。
9. 插入 CM 管后,将牙科水泥与氰丙烯酸酯胶水混合在边界周围的头板的通风侧,并将其放在头骨上,以便头板的前边界与鼻骨的后尖端和 po斯特里尔边框与间骨的前一面对齐,确保下垂缝合线(中线)相对于窗口居中和直线(图1B)。
10. 使用几滴胶水加速器固定头板的位置。用水泥混合物填补任何剩余的缝隙,用加速器固化。
    注意:确保氰丙烯酸酯不会与小鼠的眼睛接触或阻塞成像窗口。
11. 将 CM 管紧粘到头板上,以确保在运输过程中或鼠标唤醒时,这些管管不会脱落。
12. 对于急性实验,请跳到步骤 2.16。
13. 对于慢性实验,在暴露的头骨上涂上一层薄薄的透明干燥氰化胶,小心不要产生气泡,因为这些气泡会干扰成像。胶水为头骨提供保护,不会干扰成像。确保胶水覆盖暴露的头骨一直到皮肤在切口边界。
14. 使用夹板夹持装有 CSF 的 PE10 管,管距 CM 2-3 厘米,并使用高温翘尖切割管。分离后,将熔化的 PE10 油管压平以密封管。
    注意:确保在密封管条之前不要松开夹具,并确认管内没有泄漏,以防止 CSF 瘘管。
15. 给卡洛芬(每24小时5毫克/千克,3天;即p.或s.c.),将小鼠送回温度控制的单一安置笼,使其在成像前至少恢复24小时。不要让鼠标无人看管,直到它恢复足够的意识,以保持胸腔回位。完好的颅窗在几周内保持稳定。
    注:慢性实验可以在这里暂停。
    注意:一些术后并发症是:头颅性脑瘤/亚囊性造影瘤、CSF瘘管病和感染。
16. 对于急性实验,使用头板将鼠标放入头架,使头骨处于固定位置。确保检查麻醉水平,并将加热垫放在鼠标下方。鼠标现在可以带到宏镜。
    注意:小心地将鼠标与推车上的输注泵一起运输。如果CM罐体脱落,将导致颅内压力下降,任何CSF泄漏将改变实验结果。

3. 准备鼠标进行成像

注: 协议因成像实验将在麻醉(从步骤 3.1 开始)还是唤醒(从步骤 3.2 开始)鼠标上执行而不同。

1. 麻醉小鼠
   1. 将头支架放在宏镜的舞台上,确保从注射器泵到 CM 管管的管路没有扭结,并且不会绷紧,因为这可能会影响示踪剂输注。
   2. 观察粘膜的呼吸速率和粉红色着色,表示良好的氧合。如有必要,注射盐水皮下,以确保水化水平。检查,以确保动物是充分麻醉和重新剂量,如果需要。
   3. 打开微距摄像头和 LED 并启动实时模式。
   4. 确认成像场的放大倍率,以便可以清楚地显示场顶部的鼻腔缝合线和底部的羔羊缝合线,使下垂缝合线平行并居中于图像的中间(图1C)。到位后,用胶带将头支架固定到宏观示波器阶段。
   5. 将宏镜聚焦在暴露的头骨上。尽管宏镜具有相对较大的景深,但小鼠头骨的曲率仅允许特定区域处于焦点。当焦平面位于冠状骨的后侧到冠状缝合线时,可获得最佳结果。
      注:这是中脑动脉(MCA)的位置,其中大多数CSF流入发生(图1D,E)10。
2. 醒着的老鼠
   1. 在成像之前,让动物从头板手术中恢复至少24小时。建议延长恢复期(5-7 天)。在此期间,在恢复期间,将鼠标头部固定在约束管的舞台上,每天0.5-1小时。
      注:习惯性允许小鼠无需麻醉即可连接到头部支架,并在实际实验中减少压力和焦虑。如果这不可行,并且麻醉不干扰实验,可以使用吸入麻醉剂的诱导剂量(例如,在1-2 L/min O₂流速下异二醇2%),以快速将小鼠连接到头部阶段。
   2. 将鼠标固定在头支架和约束管中后,按照步骤 3.1.1-3.1.5 操作。

4. 荧光CSF示踪剂的注入

1. 急性 CM 可分
   1. 由于示踪剂在步骤 1.6 中放入蓄水池之前已装入油管,因此将输注泵设置为所需的速率和体积。常用的输注模式为5-10 μL,1-2 μL/min,但这些参数可以根据特定的实验或动物的大小和年龄进行调整。
2. 慢性 CM 可分
   1. 在开始成像会话之前,请按照步骤 1.2-1.7 进行急性实验,为输注管提供示踪剂做好准备。
   2. 一旦生产线准备好,使用止流夹切割慢性CM管的密封端。从步骤 4.2.1 中准备的管中取针,然后轻轻地将其插入管中。松开夹子并使用注射器泵,以所需的输注速率(例如 2 μL/min)推进 CSF 示踪剂,直到示踪剂到达 CM 中的植入针头。
      注意:如果连接管部时针刺穿,则拆下针头,切割穿孔段并重复此步骤。PE10 管中的任何撕裂都会导致泄漏并影响实验结果。

5. 设置映像会话

1. 根据注入的荧光示踪剂,确定每个通道的激发波长和暴露时间。选择可视化示踪器所需的最短曝光时间,以最大化延时成像的时间分辨率。这个暴露时间将用于所有后续实验,旨在比较不同动物之间的CSF传输。
   注: 一个提示是使用 CM 行中的示踪器来调整曝光时间。尽管这是一个有用的第一种方法,但应随着时间的推移对其进行优化。
2. 选择实验的持续时间和获取图像的时间间隔。实验通常持续30-60分钟,这取决于感兴趣的淋巴迁移阶段。帧速率为 1 帧/分钟和更快,对于大多数实验来说就足够了。
3. 设置文件名和保存目录。
4. 如果除了同时采集其他变量(如心电图、动脉血压、电生理学)外,还将收集成像,则可以将宏镜和泵编程为使用数据采集软件触发。在移动到下一步之前,请检查宏镜上的触发功能是否正确。

6. 颅内光学成像实验

1. 同时启动示踪液输注和成像。
2. 定期检查 CM 管和 PE10 管是否有任何泄漏迹象。如果 CM 上有任何示踪剂泄漏,则必须排除此实验的结果。
   注:如果示踪剂开始在小脑中积聚,并且不传播 MCA 的淋巴通路,则 CM 管状可能已注入小脑。不应包括此数据。
3. 对于急性实验,在实验完成后,从显微镜中取出小鼠,并检查它仍然充分麻醉。迅速斩首小鼠和收获脑组织。浸入式固定大脑在4%的甲醛(PFA)过夜在4°C。
   1. 对于慢性实验,一旦成像完成,从管中取下 CM 管线,用无菌 ACSF 冲洗,然后用高温烧结尖端重新密封 CM 管。将鼠标从头架上取下,并将其返回到笼子。重复此过程,直到不需要进一步成像,然后按照步骤 6.3 操作。

7. 数据分析

注:基于Matlab的分析,如CSF前跟踪,可以从这些成像数据集10、22中的跟踪器前端提取大量定量数据。然而,这些文件类型也可以很容易地导入和分析在开源图像分析软件,如^斐济23。

1. 使用生物格式导入工具将图像堆栈导入斐济。此函数将保留文件元数据,包括时间和像素分辨率。将映像堆栈另存为 .tiff 文件。
2. 使用多边形选择工具在头骨周围或感兴趣区域手动绘制感兴趣区域 (ROI)。例如,在图 1G中,在创伤性脑损伤后,针对益边半球和反向半球分别绘制了 ROI。确保将ROI添加到 ROI管理器中(分析>工具>ROI管理器)并保存它。
   注: CSF 传输可通过两种主要方式进行量化:1) 一段时间内的平均荧光强度,或 2) 注入面积,以 ROI 或总面积 (mm²⁾的百分比表示,在应用阈值后。后一种方法 (图 1H) 将在后续步骤中介绍.
3. 设置帧上具有最大荧光的阈值 (选择图像 > 调整>阈值...)自动阈值方法(如Otsu)通常擅长检测 CSF 示踪器。应用阈值。
4. 在继续之前,请确保在"分析>设置测量"中,选择"面积"和"面积分数"选项。然后在ROI 管理器中,选择"更多>多度量"。
5. 使用输出中的 ROI面积值将%区域值转换为 mm^2。 %Area值使用 CSF 示踪器反映背皮表面的百分比。
6. 绘制 CSF 示踪剂在 mm²中作为时间的函数。

结果

CSF的流入在表显荧光宏观镜上成像(图1A),它允许在鼠皮层中对CSF示踪传输进行中显成像。整个头骨头板允许可视化的鼻骨,正面和前部骨骼在中心,和骨骼的间骨节的玫瑰部分(图1B)。在成像过程中,鼻腔、下垂、冠状和羔羊丝缝合线很容易识别(图1C)。一旦CSF示踪剂开始注入CM(图1D),示踪荧光首先出现在基底蓄水?...

讨论

我们描述了使用市售荧光宏镜和示踪剂在活小鼠中执行颅内CSF成像的详细方案。这种技术是简单和微创的,但定量的。体内成像与敏感方法(如无线电标记示踪剂的液体闪烁计数)(包括 CM 交付后 3^个H-dextran 和¹⁴C-inulin)以及外部活晕节定量^{10相关, 18}.用双光子显微镜验证表明,在宏观镜下皮质血管上看到的CSF示踪剂主要位于MCA及其^?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Bupivacaine HCl			University of Rochester Vivarium
100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81020
A-M Systems Dental Cement Powder	Fisher Scientific	NC9991371
Carprofen			University of Rochester Vivarium
Chlorhexidine	Prevantics	B10800
CMOS Camera	Hammamatsu	ORCA Flash 4.0
Head Plate	University of Rochester	No catalog #	Custom made at the machine shop at the University of Rochester
High-Temperature Cautery	Bovie Medical Corporation	AA01
Insta-set Accelerator	Bob Smith Industries	BSI-151
Isoflurane - Fluriso	Vet One	502017	University of Rochester Vivarium
Ketamine			Strong Memorial Hospital Pharmacy
Krazy Glue	Elmer's Products, Inc	No catalog #, see link in comments	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Micropore Surgical tape	Fisher Scientific	19-027-761
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	P6148
PE10 - Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous	Braintree Scientific	PE10 100 FT
Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe	Harvard Apparatus	70-4501
PURALUBE VET OINTMENT	Dechra
Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks	Fisher Scientific	22-029-553
Research Macro Zoom Microscope	Olympus	MVX10
Simple Head Holder Plate (for mice)	Narishige International USA Inc	MAG-1
Single-use Needles, BD Medical	VWR	BD305106
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	22-363-750
Tunable LED	PRIOR Lumen 1600-LED
Xylazine			University of Rochester Vivarium