In vivo Imaging do transporte de fluido cefalorraquidiano através do crânio do rato intacto usando fluorescência macroscopia

Resumo

A imagem latente ótica de Transcranial permite a imagem latente do largo-campo do transporte do líquido cerebrospinal no córtice de ratos vivos através de um crânio intacto.

Resumo

O fluxo de líquido cefalorraquidiano (LCR) em roedores tem sido largamente estudado com quantificação ex vivo de Traçadores. As técnicas tais como a microscopia do dois-fotão e a imagem latente de ressonância magnética (MRI) permitiram in vivo a quantificação do fluxo do CSF mas são limitadas por volumes reduzidos da imagem latente e pela baixa definição espacial, respectivamente. O trabalho recente constatou que o LCR entra no parênquima cerebral através de uma rede de espaços perivasculares em torno das artérias piais e penetrantes do córtex do roedor. Esta entrada perivascular do CSF é um excitador preliminar do sistema glymphatic, um caminho implicado no afastamento de solutos metabólicos tóxicos (por exemplo, amyloid-β). Aqui, nós ilustramos uma técnica macroscópica nova da imagem latente que permita o tempo real, imagem latente mesoscópicos de traçadores fluorescentes do CSF através do crânio intacto de ratos vivos. Este método minimamente invasivo facilita uma infinidade de experimentos experimentais e permite o teste único ou repetido da dinâmica do LCR. Os macroscópios têm alta resolução espacial e temporal e seu grande pórtico e distância de trabalho permitem a criação de imagens durante a execução de tarefas em dispositivos comportamentais. Esta aproximação da imagem latente foi validada usando a imagem latente do dois-fotão e as medidas da fluorescência obtidas desta técnica correlacionam fortemente com a fluorescência ex vivo e a quantificação de Tracers rádio-etiquetados. Neste protocolo, nós descrevemos como a imagem latente macroscópica Transcranial pode ser usada para avaliar o transporte glymphatic em ratos vivos, oferecendo uma alternativa acessível às modalidades mais caras da imagem latente.

Introdução

O líquido cefalorraquidiano (LCR) Bane o cérebro e a medula espinhal e está envolvido na manutenção da homeostase, fornecendo nutrientes e regulando a pressão intracraniana¹. O CSF no espaço subarachnoid entra no cérebro através de uma rede de espaços perivasculares (PVS) que cercam artérias pial corticais e flui então para baixo ao longo das arteríolas penetrantes². Uma vez no parênquima, as trocas de LCR com fluido intersticial (ISF), transportando metabólitos nocivos como amiloide-β (aβ) e proteínas tau agregam fora do cérebro através de intervalos de matéria branca de baixa resistência e espaços perivenosos^2,3 . Este caminho é dependente de astroglial Aquaporin-4 (AQP4) canais e, portanto, tem sido denominado o glial-linfático (glymphatic) sistema⁴. Os produtos waste do neurópilo são cancelados finalmente do CSF-ISF através dos vasos linfáticos perto dos nervos cranianos e nas meninges para fora para os nós de linfa cervicais⁵. A falha deste sistema foi implicada em diversas doenças neurológicas tais como a doença de Alzheimer^6,7, ferimento de cérebro traumático³, e curso isquêmico e hemorrágico⁸.

O transporte do CSF pode ser visualizado pela infusão de traçadores na cisterna magna (cm)^9,10 e os estudos glicmfáticos no passado utilizaram principalmente a microscopia de dois fótons^{4,11,12, 12, 13}, ressonância magnética (RM)^14,15,16,17e ex vivo Imaging^{3,6,11, 18} para avaliar a cinética do traçador. A microscopia do dois-fotão é um método apropriado para a imagem latente detalhada de traçadores do CSF nos PVSs e o parênquima devido a sua definição espacial elevada, entretanto, tem um campo de visão estreito e exige uma janela craniana invasora ou um afinamento do crânio. A imagem latente ex vivo, em combinação com Immunohistochemistry, permite análises multinível que variam das únicas pilhas até o cérebro inteiro¹⁹. No entanto, o processo de fixação da perfusão que é necessário para observar o tecido pós-morte produz profundas mudanças na direção do fluxo do LCR e colapsa o PVS, alterando significativamente a distribuição e a localização dos traçadores¹². Finalmente, quando MRI puder controlar o fluxo do CSF durante todo o cérebro murino e humano inteiro, falta a definição espacial e temporal do fluxo perivascular.

Uma técnica nova, imagem latente macroscópica transcraniana, resolve algumas destas limitações permitindo a imagem latente do largo-campo do transporte perivascular do CSF no córtice dorsal inteiro de ratos vivos. Este tipo de imagem é feito com um Macroscópio epifluorescente usando um cubo de filtro multibanda, fonte de luz LED sintonável, e câmera CMOS de alta eficiência¹⁰. Estes set-ups são capazes de resolver PVSs até 1-2 mm abaixo da superfície do crânio e pode detectar fluoróforos até 5-6 mm abaixo da superfície cortical, deixando o crânio totalmente intacto¹⁰. Os filtros e os diodos emissores de luz Multiband que podem rapidamente ajustar o comprimento de onda da excitação permitem o uso de fluoróforos múltiplos permitindo que o CSF seja etiquetado com os traçadores de pesos moleculars e de propriedades químicas diferentes na mesma experiência.

Este procedimento requer uma cirurgia simples, minimamente invasiva para expor o crânio e colocar uma placa de cabeça de peso leve para estabilizar a cabeça durante a sessão de imagem. Os traçadores podem ser entregues no cm sem perfurar no crânio ou penetrar o tecido cortical com pipetas ou cânulas^9,20. Ambas as cânulas CM e placas de cabeça permanecem estáveis por vários dias a semanas e facilitam projetos experimentais mais complexos em comparação com a visualização clássica do ponto final. Este protocolo descreve como a imagem latente macroscópica Transcranial é usada para estudar a função glymphatic do sistema que segue a injeção aguda ou crônica do Tracer fluorescente do CSF no CM de ratos anestesiados/dormindo ou acordados.

Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê universitário de recursos animais (UCAR, protocolo n º 2011-023) da Universidade de Rochester e realizados de acordo com o guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.

1. preparando a cânula da cisterna magna, a placa principal, e o suporte principal

1. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e placas de cabeça antes da cirurgia.
   Nota: os traçadores fluorescentes são entregados diretamente no CSF através de um cannulation do Magna do cisterna. Para instruções detalhadas sobre este procedimento, por favor consulte Xavier et al⁹.
2. Momentaneamente, usando um excitador da agulha, quebre a ponta de uma agulha de 30G x 12,7 milímetro (1/2 polegadas), 3/4 da maneira para baixo, e coloc a extremidade sem corte da agulha em uma extremidade da tubulação do polietileno 10 (PE10) (aproximadamente 45 cm de comprimento). Certifique-se de que somente o chanfro está salientes fora da borda da tubulação PE10.
3. Quebre 1/4 da extremidade chanfrada de uma outra agulha 30G e coloc a extremidade sem corte da agulha restante na outra extremidade da tubulação PE10, com o luer-fechamento plástico ainda Unido.
4. Encha uma seringa de vidro de 100 μL com o CSF estéril, artificial (aCSF: 126 milímetros NaCl, 2,5 milímetros KCl, 1,25 milímetros NaH₂po₄, 2 milímetros MgSO₄, 2 milímetro CAcl₂, 10 milímetros de glicose, e 26 milímetros NaHCO₃).
5. Prenda a seringa até ao fim da linha e encha-a com aCSF até atingir a ponta da agulha chanfrada. É importante que a seringa é preenchida com aCSF e não ar, como uma coluna de ar é mais propensos a volumes de infusão variável.
6. Para experimentos crônicos, deixe a linha preenchida com aCSF e pule a etapa 1,7.
7. Para experimentos agudos, coloque a seringa em uma bomba de infusão e retire aproximadamente 5 mm de ar, o que impedirá a mistura. Em seguida, retire o volume total de traçador (s) que é desejado para o experimento (20% extra é recomendado devido a perdas de espaço morto).
   Nota: a tubagem PE10 deve ser suficientemente longa para que a bolha de ar não introduza o manguito plástico da seringa de vidro ao carregar o traçador. Para um experimento típico, o protocolo utiliza 10 μL de albumina sérica bovina conjugada para Alexa fluor 647 (BSA-647) diluída em aCSF a 0,5%.
8. Confirme que a placa de cabeça cabe no suporte da cabeça e que é o tamanho certo para o mouse que está sendo usado. Os marcadores anatômicos para assegurar isto são: a beira superior da janela alinha com a linha interocular e a beira do posterior cai rostral à crista occipital.
   Nota: as placas de cabeça de aço inoxidável podem ser esterilizadas e reutilizadas. A maioria das misturas de cianoacrilato pode ser removida com uma solução de acetona.

2. procedimento cirúrgico

1. Pesar e anestesiizar o rato (por exemplo, cetamina/xilazina; 100 mg/kg de cetamina, 10 mg/kg de xilazina; i.p.).
2. Uma vez que o rato já não responde a uma pitada do dedo do pé, umedecer a garganta e a cabeça com água estéril e raspar usando tosquiadeiras. Uma vez que a área é raspada, limpe a área com um cotonete de álcool novamente para remover qualquer cabelo residual.
   Nota: umedecendo a pele antes que o grampeamento reduza dramàtica a quantidade de cabelo na janela da imagem latente após a incisão.
3. Coloc o rato em um frame stereotactic sobre uma almofada temperatura-controlada e aplique a pomada oftálmica do petróleo aos olhos do rato para assegurar-se de que não seque para fora.
4. Limpe a pele exposta com um cotonete de clorexidina. Após 2 min, retire a clorexidina com uma limpeza de álcool. Finalmente, aplique uma solução de iodo que pode ser deixada para secar.
5. Injetar analgesia subcutânea (0,25% bupivacaína HCl) para o topo do crânio e do pescoço.
6. Começando pela parte do pescoço que cobre a crista occipital, faça um corte da linha média na pele sobrejacente e continue rostralmente em direção à linha interorbital. Incise lateralmente para a fronteira onde o músculo temporal insere no crânio. Remova toda a pele da incisão fusiforme para expor os ossos frontais e parietal.
   Cuidado: a cavidade retroorbital encontra-se caudal aos olhos e as grandes filiais da mentira facial da veia do posterior rostral ao Pinna. Tenha cuidado ao fazer a incisão para poupar essas estruturas. Se isso ocorrer, pare de sangrar Mantendo a hemostasia com um cotonete estéril por vários minutos e continue.
7. Irrigar o crânio com soro fisiológico estéril e limpar a superfície usando cotonetes de algodão para que ele está livre de detritos e pêlos, uma vez que estes irão interferir com a qualidade da imagem. A transparência do crânio é melhor preservada deixando o periósteo e a fáscia sobrejacente intacta.
   Nota: se estas estruturas são removidas acidentalmente, o crânio pode tornar-se seco e opaco ao longo do tempo. Re-umedecer com aCSF ou usar uma mistura de óleo de parafina e glicerol para reduzir a reflectância do crânio em experimentos agudos²¹.
8. Proceder à inserção da cânula cisterna magna-para detalhes cirúrgicos deste procedimento, consulte Xavier et al⁹.
9. Depois de inserir a cânula CM, aplique uma mistura de cimento dentário com cola de cianoacrilato no lado ventral da placa de cabeça ao redor da borda e coloque-a no crânio para que a borda anterior da placa principal se alinhe com a ponta posterior do osso nasal e o po a borda do esterior alinha-se com o aspecto anterior do osso interparietal, certificando-se de que a sutura sagital (linha média) é centrada e reta em relação à janela (Figura 1b).
10. Fixar a posição da placa de cabeça usando algumas gotas de acelerador de cola. Encha todas as lacunas restantes com a mistura de cimento e cure-a com acelerador.
    Atenção: Certifique-se de que o cianoacrilato não entra em contacto com os olhos do rato ou bloqueie a janela de imagem.
11. Cole a cânula CM na placa de cabeça para garantir que estas não fiquem desanexadas durante o transporte ou quando o rato acordar.
12. Para experimentos agudos, avance para o passo 2,16.
13. Para experimentos crônicos, aplique uma fina camada de cola de cianoacrilato de secagem clara ao crânio exposto, tendo cuidado para não criar bolhas, pois elas interferirão na imagem. A colagem fornece a proteção para o crânio e não interferirá com a imagem latente. Certifique-se de que a cola cobre o crânio exposto todo o caminho para a pele na borda da incisão.
14. Use uma braçadeira do hemostat para prender a tubulação aCSF-enchida de PE10 2-3 cm do CM e para cortar a linha com uma ponta de cauterização de alta temperatura. Uma vez que é separado, aplainam a tubulação PE10 derretida para selar a cânula.
    PRECAUÇÃO: Certifique-se de que não liberta o grampo até que a cânula tenha sido selada e confirme que não existem fugas na tubagem para evitar uma fístula LIQUÓRICA.
15. Administrar carprofeno (5 mg/kg a cada 24 h durante 3 dias; i.p. ou s.c.) e devolver o rato a uma gaiola controlada por temperatura, única e permitir-lhe recuperar durante pelo menos 24 h antes da imagem. Não deixe o rato desacompanhado até que recupere a consciência suficiente para manter o recumbency esternal. As janelas cranianas intactas permanecem estáveis por várias semanas.
    Nota: o experimento crônico pode ser pausado aqui.
    Cuidado: algumas complicações postoperative são: cephalohematoma/hematomas subgaleal, fístula do CSF, e infecção.
16. Para experimentos agudos, coloque o mouse no suporte da cabeça usando a placa de cabeça para que o crânio esteja em uma posição fixa. Certifique-se de verificar o nível de anestesia e colocar uma almofada de aquecimento o mouse. O rato está agora pronto para ser levado para o Macroscópio.
    Atenção: transportar cuidadosamente o rato juntamente com a bomba de perfusão num carrinho. Se o canulação do cm se tornar desalojado, causará uma gota na pressão intracranial e todos os escapes do CSF alterarão os resultados experimentais.

3. preparando o mouse para a imagem

Observação: o protocolo varia dependendo se o experimento de imagem será executado em um mouse anestesiado (iniciar no passo 3,1) ou acordado (iniciar no passo 3,2).

1. Ratos anestesiados
   1. Coloque o suporte da cabeça no palco do Macroscópio, certificando-se de que não há dobras na linha da bomba da seringa para a cânula CM e que não é tenso, uma vez que isso pode afetar a infusão de traçador.
   2. Observar a frequência respiratória e coloração rosa das membranas mucosas, indicando boa oxigenação. Injetar soro fisiológico por via subcutânea para garantir o nível de hidratação, se necessário. Verifique se o animal está suficientemente anestesiado e redose, se necessário.
   3. Ligue a câmara de Macroscópio e o LED e inicie o modo LIVE.
   4. Confirme a ampliação do campo de imagem para que a sutura nasofrontal na parte superior do campo e a sutura lambdóide na parte inferior possam ser claramente visualizadas, com a sutura sagital paralela e centrada no meio da imagem (Figura 1C). Uma vez no lugar, prenda o suporte principal ao estágio do Macroscópio com fita.
   5. Concentre o Macroscópio no crânio exposto. Apesar dos macroscópios terem uma profundidade de campo relativamente grande, a curvatura do crânio do mouse só permite que uma área específica esteja em foco. Os melhores resultados são obtidos quando o plano focal está localizado nos lados laterais dos ossos parietal posteriores às suturas coronais.
      Nota: esta é a localização das artérias cerebrais médias (MCA), onde ocorre a maior parte do fluxo de LCR (Figura 1D, E)¹⁰.
2. Camundongos acordados
   1. Antes da sessão da imagem latente, deixe os animais recuperar pelo menos 24 h da cirurgia da placa principal. Períodos de recuperação mais longos (5-7 dias) também são recomendados. Durante este tempo, treinar o mouse para ser cabeça fixada no palco no tubo de retenção para 0.5-1 h por dia para a duração do período de recuperação.
      Nota: habituação permite que o mouse para ser anexado ao suporte da cabeça sem anestesia e reduz o stress e ansiedade durante o experimento real. Se isso não for viável e a anestesia não interferir com o experimento, uma dose de indução de um anestésico inalatório (por exemplo, isoflurano 2% a 1-2 L/min O₂ vazão) pode ser usada para anexar rapidamente o mouse ao estágio principal.
   2. Uma vez que o rato é fixado ao suporte principal e no tubo de retenção, siga os passos 3.1.1-3.1.5.

4. infusão de traçadores fluorescentes do CSF

1. Cannulation agudo do CM
   1. Uma vez que o traçador já foi carregado na cânula antes de ser colocado na cisterna magna na etapa 1,6, defina a bomba de infusão para a taxa desejada e volume. Os paradigmas da infusão usados rotineiramente são 5-10 μL em 1-2 μL/min, mas estes parâmetros podem ser ajustados dependendo do experimento particular, ou do tamanho e da idade do animal.
2. Cannulation crônico do CM
   1. Antes de iniciar a sessão de imagem, siga as etapas 1.2-1.7 para experimentos agudos para preparar a linha de infusão para entregar os traçadores.
   2. Uma vez que a linha é preparada, usando uma braçadeira do hemostat cortou a extremidade selada da cânula crônica do CM. Retire a agulha da linha preparada no passo 4.2.1 e insira-a suavemente na cânula. Solte o grampo e usando a bomba da seringa, avance o traçador CSF na taxa de infusão desejada (por exemplo, 2 μL/min) para o experimento até que o traçador atinja a agulha implantada no CM.
      Atenção: se a agulha perfurar através da tubagem ao ligar a linha, retire a agulha, corte o segmento perfurado e repita este passo. Qualquer rasgo na tubulação PE10 causará um vazamento e afetará os resultados do experimento.

5. Configurando a sessão de imagem

1. Baseado no Tracer fluorescente que está sendo infundido, determine o comprimento de onda da excitação e o tempo da exposição para cada canaleta. Escolha o tempo de exposição o mais curto necessário para visualizar o Tracer a fim maximizar a definição temporal da imagem latente do lapso de tempo. Este tempo de exposição será utilizado para todos os experimentos subsequentes com o objetivo de comparar o transporte do LCR entre diferentes animais.
   Nota: uma dica é usar o traçador na linha CM para ajustar o tempo de exposição. Embora esta seja uma primeira abordagem útil, isso deve ser otimizado ao longo do tempo.
2. Escolha a duração do experimento e os intervalos nos quais as imagens serão adquiridas. Experimentos duram normalmente entre 30-60 min, dependendo de qual fase do transporte glicmfático é de interesse. Taxas de quadros de 1 frame/min e mais rápido são suficientes para a maioria dos experimentos.
3. Defina o nome do arquivo e o diretório de salvamento.
4. Se a imagem será coletada além da aquisição simultânea de outras variáveis (por exemplo, eletrocardiograma, pressão arterial, eletrofisiologia), o Macroscópio e a bomba podem ser programados para serem acionados com o software de aquisição de dados. Verifique se a função de disparo no Macroscópio está correta antes de passar para a próxima etapa.

6. experimento de imagem óptica transcraniana

1. Inicie a infusão do traçador e a imagem ao mesmo tempo.
2. Verific rotineiramente a cânula do CM e a tubulação PE10 para todos os sinais de um escape. Se houver qualquer vazamento de traçador no CM, os resultados deste experimento devem ser excluídos.
   Nota: se o traçador começar a acumular-se no cerebelo e não percorrer a via glicmfática da MCA, é provável que a cânula CM tenha sido injetada no cerebelo. Esses dados não devem ser incluídos.
3. Para experimentos agudos, após a conclusão do experimento, retire o mouse do microscópio e verifique se ele ainda está adequadamente anestesiado. Rapidamente decapitar o mouse e colher o tecido cerebral. Imersão-fixar o cérebro em 4% paraformaldeído (PFA) durante a noite a 4 ° c.
   1. Para experimentos crônicos, uma vez que a imagem é concluída, retire a linha CM da cânula, lave com aCSF estéril e reseal a cânula CM com uma ponta de cauterização de alta temperatura. Retire o mouse do suporte da cabeça e devolvê-lo à sua gaiola. Repita esse processo até que outras imagens não sejam necessárias e siga a etapa 6,3.

7. análise de dados

Observação: as análises baseadas em MATLAB, como o rastreamento frontal do CSF, podem extrair grandes quantidades de dados quantitativos das frentes de traçador nesses conjuntos de dados de imagens^10,22. No entanto, esses tipos de arquivos também podem ser facilmente importados e analisados em software de análise de imagem de código aberto como Fiji²³.

1. Importe as pilhas de imagens para Fiji usando a ferramenta de importação de bio-formats. Essa função preservará os metadados de arquivo que inclui a resolução de tempo e pixel. Salve a pilha de imagens como um arquivo. TIFF.
2. Desenhe manualmente uma região de interesse (ROI) ao redor do crânio ou da área de interesse usando a ferramenta de seleção de polígono. Por exemplo, na Figura 1G um ROI foi desenhado separadamente para o hemisfério ipsilateral e contralateral após uma lesão cerebral traumática. Certifique-se de adicionar o ROI no Gerenciador de ROI (Analyze > Tools > ROI Manager) e salvá-lo.
   Nota: o transporte do LCR pode ser quantificado de duas formas principais: 1) intensidade média de fluorescência ao longo do tempo ou 2) área de influxo expressa em percentagem do ROI ou área total (mm²) após ter aplicado um limiar. O último método (Figura 1h) será descrito nas próximas etapas.
3. Defina o limiar no quadro com fluorescência máxima (Selecione Image ≫ ajustar ≫ Threshold...). Os métodos automatizados do limiar tais como Otsu são normalmente bons em detectar o Tracer do CSF. Aplique o limiar.
4. Antes de ir para a frente, certifique-se de que em analisar ≫ definir medições, a área de opções e a fração de área são selecionadas. Em seguida, no Gerenciadorde ROI , selecione mais > multimedida.
5. Converta o valor de área% em mm² usando o valor de área do ROI do output. Os valores da área% refletem a porcentagem da superfície cortical dorsal com o traçador do LCR.
6. Plotar o influxo do traçador CSF em mm² em função do tempo.

Resultados

O afluxo do CSF é imaged em um Macroscópio epifluorescente (Figura 1a), que permita a imagem latente mesoscópicos do transporte do Tracer do CSF no córtice murino. A placa da cabeça do inteiro-crânio permite o visualização dos ossos nasais rostral, dos ossos frontais e parietal no centro, e da parcela rostral do osso interparietal caudalmente (Figura 1b). Durante a imagem, as suturas nasofrontal, sagital, coronal e lambdóide podem ser prontamente identi...

Discussão

Nós descrevemos um protocolo detalhado para executar a imagem latente Transcranial do CSF em ratos vivos usando macroscópios e traçadores fluorescentes comercialmente-disponíveis. Esta técnica é simples e minimamente invasiva, mas quantitativa. A imagem latente in vivo correlaciona bem com os métodos sensíveis tais como a contagem líquida do cintilação de traçadores rádio-etiquetados que incluem ³H-Dextran e ¹⁴C-Inulin após a entrega do cm, e com a quantificação ex vivo da seção co...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Bupivacaine HCl			University of Rochester Vivarium
100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81020
A-M Systems Dental Cement Powder	Fisher Scientific	NC9991371
Carprofen			University of Rochester Vivarium
Chlorhexidine	Prevantics	B10800
CMOS Camera	Hammamatsu	ORCA Flash 4.0
Head Plate	University of Rochester	No catalog #	Custom made at the machine shop at the University of Rochester
High-Temperature Cautery	Bovie Medical Corporation	AA01
Insta-set Accelerator	Bob Smith Industries	BSI-151
Isoflurane - Fluriso	Vet One	502017	University of Rochester Vivarium
Ketamine			Strong Memorial Hospital Pharmacy
Krazy Glue	Elmer's Products, Inc	No catalog #, see link in comments	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Micropore Surgical tape	Fisher Scientific	19-027-761
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	P6148
PE10 - Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous	Braintree Scientific	PE10 100 FT
Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe	Harvard Apparatus	70-4501
PURALUBE VET OINTMENT	Dechra
Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks	Fisher Scientific	22-029-553
Research Macro Zoom Microscope	Olympus	MVX10
Simple Head Holder Plate (for mice)	Narishige International USA Inc	MAG-1
Single-use Needles, BD Medical	VWR	BD305106
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	22-363-750
Tunable LED	PRIOR Lumen 1600-LED
Xylazine			University of Rochester Vivarium