İçinde vivo beyin omurilik akışkan taşınması floresan Makroskopisi kullanarak bozulmamış fare kafatası aracılığıyla görüntüleme

Özet

Transkraniyal optik görüntüleme, canlı fareler korteks içinde sağlam bir kafatası ile beyin omurilik sıvı taşımacılığı geniş alan görüntüleme sağlar.

Özet

Kemirgenlerde beyin omurilik sıvısı (CSF) akışı büyük ölçüde izleyiciler ex vivo ölçülme kullanılarak incelenmiştir. İki foton mikroskopisi ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi teknikler, CSF akışının in vivo ölçümlemesini sağladı, ancak sırasıyla azaltılmış görüntüleme hacimleri ve düşük uzamsal çözünürlük ile sınırlıdır. Son çalışmalar, CSF 'nin, kemirgen korteksinin pial ve penetran arterlerini çevreleyen perivasküler alanların ağ üzerinden beyin parankimesi girdiğini buldu. Bu perivasküler CSF girişi, glikmiyatik sistemin primer bir sürücüsüdür, toksik metabolik solakların (örn. amiloid-β) temizlenmesinden oluşan bir yol. Burada, floresan CSF izleyicilerini canlı farelerin bozulmamış kafatası ile gerçek zamanlı, mezoskopik görüntüleme sağlayan yeni bir makroskopik görüntüleme tekniği göstermektedir. Bu minimal invazif yöntem, çok sayıda deneysel tasarımı kolaylaştırır ve CSF dinamiklerinin tek veya tekrarlanan testlerini sağlar. Makroskoplar yüksek uzamsal ve temporal çözünürlüğe sahiptir ve büyük Portal ve çalışma mesafesi davranışsal cihazlarda görev yaparken görüntüleme için izin verir. Bu görüntüleme yaklaşımı, bu teknikten elde edilen iki foton görüntüleme ve floresan ölçümleri ile güçlü bir şekilde ex vivo floresans ve radyo etiketli izleyicileri ölçmek ile ilişkilendirilir. Bu protokolde, canlı farelerde glymphatic taşımacılığı değerlendirmek için Transkraniyal makroskopik görüntülemenin nasıl kullanılabilen olduğunu tarif ediyoruz, daha pahalı görüntüleme yöntemleri için erişilebilir bir alternatif sunuyor.

Giriş

Beyin omurilik sıvısı (CSF) beyinleri ve omuriliği yıkanır ve homeostaz bakımını, besin temini ve intrakranial basıncı düzenleyen¹. Subaraknoid uzayda CSF perivasküler boşluklar bir ağ ile beyin girer (PVS) kortikal pial arterlerin çevreleyen ve sonra nüfuz arteriyoller boyunca aşağı akar². Bir kez parankimat, interstisyel sıvı ile CSF değişimleri (ISF), düşük direnç beyaz madde yolları ve perivenöz alanlar ile beynin dışında amiloid β (Aβ) ve Tau protein agrega gibi zararlı metabolitleri taşıyan^2,3 . Bu yol astroglial Aquaporin-4 (AQP4) kanallarına bağlıdır ve bu nedenle glial-lenfatik (glymphatic) sistemi⁴olarak adlandırılır. Nörofobik atık ürünleri sonunda kraniyal sinirlerin yakınındaki lenfatik damarlardan ve servikal lenf nodlarına doğru meninglerin üzerinden CSF-ıSF ' d a k i temizlenir⁵. Bu sistemin başarısızlığı, Alzheimer hastalığı⁶,⁷, travmatik beyin hasarı³, iskemik ve hemorajik inme⁸gibi çeşitli nörolojik hastalıklarda karışmıştır.

CSF taşımacılığı, (cm)^9,10 ve geçmişte glymphatic çalışmalar özellikle iki foton mikroskopisi^4,11,12kullanılmış olan Cisterna içinde izleyicileri infaklama tarafından görselleştirilebilir ¹³, manyetik rezonans görüntüleme (MRG)^14,15,16,17, ve ex vivo görüntüleme^{3,6,11, 18} . Tracer kinetiği değerlendirmek için. İki foton mikroskobu, PVSs 'deki CSF izleyicileri ve yüksek uzamsal çözünürlüğe bağlı olarak parankimat hakkında ayrıntılı görüntüleme için uygun bir yöntemdir, ancak dar bir bakış alanı vardır ve invaziv bir kafatası penceresi veya kafatası inceltme gerektirir. Ex vivo görüntüleme, immünhistokimya ile birlikte, tek hücrelerden tüm beyin¹⁹kadar çok düzeyli analizler sağlar. Ancak, post-mortem doku gözlemlemek için gerekli perfüzyon-fiksasyon süreci CSF akış yönünde derin değişiklikler üretir ve PVS daraltır, önemli ölçüde dağılımı ve izleyicinin konumunu değiştiren¹². Son olarak, MRI tüm murine ve insan beyni boyunca CSF akışını izleyebilirken, perivasküler akışın uzamsal ve temporal çözünürlüğüne sahip değildir.

Yeni bir teknik, Transkraniyal makroskopik görüntüleme, canlı farelerin tüm dorsal korteks perivasküler CSF taşıma geniş alan görüntüleme sağlayarak bu sınırlamalar bazı çözer. Bu tür görüntüleme, Multiband filtre küpü, ayarlanabilir LED ışık kaynağı ve yüksek verimli CMOS Kamera¹⁰kullanarak bir epifloresan makrokapsam ile yapılır. Bu set-up 1-2 kadar PVSs çözmek edebiliyoruz kafatası yüzeyinin altında mm ve kortikal yüzeyin 5-6 mm kadar fluorophores tespit edebilir kafatası tamamen bozulmamış bırakarak¹⁰. Çok bantlı filtreler ve hızlı bir şekilde ayarlanabilir LED 'Ler, CSF 'nin aynı denemede farklı moleküler ağırlıklar ve kimyasal özelliklerin izleyicileri ile etiketlenmesine olanak tanıyan birden fazla fluorophorenin kullanımını sağlar.

Bu prosedür, kafatası ortaya çıkarmak için basit ve minimal invazif bir cerrahi gerektirir ve görüntüleme oturumu sırasında başını stabilize etmek için hafif bir baş plaka yerleştirin. İzleyiciler, kafatası delme veya pipetler veya kanüller ile kortikal doku penetran olmadan cm içine teslim edilebilir^9,20. Hem CM kanüller hem de baş plakaları birkaç gün boyunca istikrarlı kalır ve klasik son nokta görselleştirmesine kıyasla daha karmaşık Deneysel tasarımlar kolaylaştırır. Bu protokol, floresan CSF izleyicilerin akut veya kronik enjeksiyonunu takiben anestezik/uyku veya uyanık farelerin CM 'ye doğru, glikmiyatik sistem fonksiyonunu incelemek için Transkraniyal makroskopik görüntülemenin nasıl kullanıldığını açıklar.

Protokol

Tüm deneyler, Rochester Üniversitesi 'nde hayvan kaynakları (UCAR, protokol No. 2011-023) üniversite Komitesi tarafından onaylandı ve Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NıH Kılavuzu 'na göre gerçekleştirilir.

1. sarnka Magna kanül, baş plaka ve baş tutucu hazırlanması

1. Ameliyattan önce tüm cerrahi aletleri ve kafa plakalarını sterilize edin.
   Not: floresan izleyiciler doğrudan CSF içine bir sarnısı Magna kanülasyon yoluyla teslim edilir. Bu yordamla ilgili ayrıntılı talimatlar için lütfen Xavier ve Al⁹' a bakın.
2. Kısaca, bir iğne sürücüsü kullanarak, bir 30G x 12,7 mm (1/2 inç) iğne, aşağı yol 3/4 ucu kırmak ve polietilen 10 (PE10) boru (yaklaşık 45 cm uzunluğunda) bir ucuna iğne künt ucunu yerleştirin. Sadece eğim PE10 boru kenarlığının dışarı çıkıntılı emin olun.
3. Break off 1/4 başka bir 30G iğne eğimli ucunu ve PE10 tüp diğer ucuna kalan iğne künt ucunu yerleştirin, plastik Luer-Lock hala bağlı.
4. 100 μL cam şırıngayı steril, suni CSF (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂Po₄, 2 mm MgSO₄, 2 mM CAcl₂, 10 mm glikoz ve 26 mm NaHCO₃) ile doldurun.
5. Şırıngayı çizginin sonuna takın ve eğimli iğne ucuna ulaşıncaya kadar aCSF ile doldurun. Bir hava sütunu değişken infüzyon hacimlere daha eğilimli olduğu için şırınga, hava değil, aCSF ile geri doldurulur önemlidir.
6. Kronik deneyler için, hattı aCSF ile dolu bırakın ve adım 1,7 atlayın.
7. Akut deneyler için, şırınga bir infüzyon pompası üzerine yerleştirin ve yaklaşık 5 mm hava çekme, hangi karıştırma önleyecek. Daha sonra, deneme için istenen toplam izleyici hacmini (ölü alan kayıpları nedeniyle% 20 ekstra tavsiye edilir) geri çekin.
   Not: PE10 boru yeterince uzun olmalıdır böylece hava balonu Tracer yüklerken cam şırınga plastik manşet girmez. Tipik bir deney için, protokol Alexa Fluor 647 (BSA-647) ile% 0,5 ' de acsf seyreltilmiş 10 μL Sığır serum albümin kullanır.
8. Baş plakasının baş tutucuya uyduğunu ve kullanılan fare için doğru boyutta olduğunu onaylayın. Anatomik belirteçler bu sağlamak için: pencerenin üst sınır interoküler hattı ile hizalar ve posterior sınır oksipital arması rostral düşüyor.
   Not: Paslanmaz çelik kafa plakaları sterilize edilmiş ve yeniden kullanılabilir. Çoğu siyanoakrilat karışımı, bir aseton çözeltisi ile çıkarılabilir.

2. cerrahi prosedür

1. Tartmak ve fare anestezize (örneğin ketamin/xylazine; 100 mg/kg ketamin, 10 mg/kg xylazine; ı.g).
2. Fare artık bir ayak çimdikine yanıt verdikten sonra, boyun ve kafa steril su ile nemlendirin ve Clippers kullanarak tıraş. Bir kez alan traş, herhangi bir kalıntı saç kaldırmak için tekrar bir alkol çubukla ile alanı silin.
   Not: kırpmadan önce kürk nemlendirme, kesi sonrasında görüntüleme penceresindeki saç miktarını önemli ölçüde azaltır.
3. Fare, sıcaklık kontrollü bir Pad üzerine bir stereotaktik çerçevede yerleştirin ve onlar kuruması sağlamak için fare gözlerine petrol oftalmik merhem uygulayın.
4. Bir klorheksidin Swab ile maruz cilt temizleyin. 2 dakika sonra, bir alkol silme ile klorhekidin çıkarın. Son olarak, kurumaya bırakılabilen iyot çözeltisi uygulayın.
5. Kafatası ve boyun üstüne subkutan analjezi (0,25% Bupivacaine HCl) enjekte.
6. Boynun oksipital arması kapsayan kısmından başlayarak, aşırı deri içinde bir orta çizgi kesim yapmak ve Interorbital hat doğru rostrally devam. Geçici kas kafatasına ekler sınırına yanal incise. Hem frontal hem de parietal kemikleri ortaya çıkarmak için fusiform kesi tüm cilt çıkarın.
   Dikkat: arkasındaki sinüs gözleri ve posterior yüz ven büyük dalları Pinna için rostral göz kaudal yatıyor. Bu yapıları yedek kesi yaparken dikkatli olun. Bu durumda, birkaç dakika boyunca steril bir pamuklu çubukla hemostaz koruyarak kanamayı durdurun ve devam edin.
7. Steril tuz ile kafatası irrigate ve bu görüntü kalitesi ile müdahale edecektir çünkü enkaz ve saç ücretsiz böylece yüzey pamuk bezlerden kullanarak temizleyin. Kafatası saydamlığı en iyi periost ve aşırı fasya sağlam bırakarak korunur.
   Not: Bu yapılar yanlışlıkla kaldırılırsa, kafatası zaman içinde kuru ve opak olabilir. ACSF ile yeniden nemlendirin veya akut deneylerde kafatası yansımasını azaltmak için parafin yağı ve gliserol karışımı kullanın²¹.
8. Bu prosedürün cerrahi detayları için Cisterna Magna kanül eklemeye devam edin, Xavier ve Al⁹' a bakın.
9. CM kanül taktıktan sonra, sınır etrafında baş plaka ventral tarafına siyanoacrylate tutkal ile diş çimento karışımı uygulayın ve böylece kafa plakasının anterior sınır burun kemik ve Po posterior ucu ile hizalar kafatası üzerine yerleştirin sterior sınır, interparietal kemik anterior yönü ile hizalanır, sagittal sütür (orta çizgi) pencere göre ortalanmış ve düz emin olmak (Şekil 1B).
10. Tutkal Hızlandırıcı birkaç damla kullanarak baş plaka konumunu düzeltin. Çimento karışımı ile kalan boşlukları doldurun ve Hızlandırıcı ile tedavi.
    DIKKAT: siyanoakrilatenin fare gözleri ile temas etmediğini veya görüntüleme penceresini engellemesini sağlayın.
11. Bu taşıma sırasında veya fare uyanırken ayrılmış hale gelmez emin olmak için baş plaka için CM kanül tutkal.
12. Akut deneyler için adım 2,16 ' e geçin.
13. Kronik deneyler için, açık kafatasına ince bir tabakalı siyanoakrilat tutkal uygulayın, bu görüntüleme müdahale edecek gibi kabarcıklar oluşturmak için dikkatli olmak. Tutkal kafatası için koruma sağlar ve görüntüleme ile müdahale etmez. Tutkal maruz kafatası kesi sınırında cilt için tüm yol kapsar emin olun.
14. Acsf dolu PE10 tüpünü cm 'den 2-3 cm 'ye tutmak için hemostat kelepçe kullanın ve yüksek sıcaklıklı koter ucu ile çizgiyi keser. Bir kez ayrılır, kanül mühür erimiş PE10 boru Düzleştir.
    DIKKAT: kanül mühürleninceye kadar kelepçeyi serbest bırakmayın ve bir bos fistül önlemek için boru içinde hiçbir sızıntı olduğunu teyit emin olun.
15. Karprofen Yönet (her 24 saat 3 gün boyunca 5 mg/kg; ı.y veya s.c.) ve fareyi sıcaklık kontrollü, tek Konaklı bir kafeye döndürmeniz ve görüntülemenin en az 24 saat önce kurtarmasına izin vermenizi sağlar. Sternal recumbency korumak için yeterli bilinç geri gelene kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın. Bozulmamış kraniyal pencereler birkaç hafta boyunca istikrarlı kalır.
    Not: kronik deney burada duraklatılabilir.
    DIKKAT: bazı postoperatif komplikasyonlar şunlardır: sefohematom/Subgaleal hematomas, bos fistül, ve enfeksiyon.
16. Akut deneyler için, kafatasının sabit bir pozisyonda olması için fareyi baş plakasını kullanarak baş tutucuya yerleştirin. Anestezi seviyesini kontrol etmek ve fare altında bir Isıtma Pad yerleştirmek için emin olun. Fare artık makrokapsama götürülmeye hazırdır.
    DIKKAT: fareyi dikkatle bir sepetteki infüzyon pompası ile birlikte taşıma. CM kanülasyon kesilirse, İntrakraniyal basınçta bir damla neden olur ve herhangi bir CSF sızıntısı deneysel sonuçları değiştirecek.

3. fareyi görüntüleme için hazırlama

Not: protokol, görüntüleme denemesinde bir anestezize (adım 3,1 ' de başlangıç) veya uyanık (Step 3,2) faresinde gerçekleştirilecek olup olmadığına bağlı olarak değişir.

1. Anestezize fareler
   1. Baş tutucuyu makrokapsamın aşamasına yerleştirin, şırınga pompasından CM kanuluna kadar herhangi bir bükülme olmadığından ve bu izleyici infüzyonu etkileyebileceği için gergin olmadığından emin olun.
   2. Solunum hızı ve mukoza zarlarının pembe renklenme gözlemlemek, iyi oksijenasyon gösteren. Gerekirse hidrasyon seviyesini güvenli hale getirmek için tuz subkutan enjekte edilir. Hayvan yeterli anestezize ve yeniden doz gerekirse emin olmak için kontrol edin.
   3. Makrokapsam kamerayı ve LED 'i açın ve LıVE moduna başlayın.
   4. Görüntüleme alanının büyümesini onaylamak için alanın üst kısmındaki nazofrontal sütür ve altta bulunan lambdoid sütür açıkça görüntülenebilir, sagittal sütür paralel ve görüntünün ortasına ortalanır (Şekil 1C). Yerine bir kez, bant ile makrokapsam aşamasında baş tutucu güvenli.
   5. Makrokapsama maruz kalan kafatasına odaklan. Nispeten büyük bir alan derinliğine sahip makroskoplara rağmen, fare kafatasının eğriliği sadece belirli bir alanın odaklanmasını sağlar. En iyi sonuçlar, odak uçağı, koronal sütürler posterior parietal kemiklerin lateral taraflarında bulunduğunda elde edilir.
      Not: Bu, çoğu CSF girişi oluştuğu orta serebral arterlerin (MCA) konumdur (Şekil 1D, E)¹⁰.
2. Uyanık fareler
   1. Görüntüleme seansından önce hayvanların baş plaka cerrahisinde en az 24 saat iyileşmesi için izin verin. Daha uzun kurtarma süreleri (5-7 gün) de önerilir. Bu süre boyunca, kurtarma dönemi süresince günde 0,5-1 h için koruma tüpünde sahnede sabit kafa olmak için fareyi eğitmek.
      Not: habituation fare anestezi olmadan baş tutucuya iliştirilmesi ve gerçek deney sırasında stres ve anksiyete azaltır sağlar. Bu uygulanabilir değilse ve anestezi denemeye müdahale etmez, bir indüksiyon dozu inhale anestezik (örneğin, Isoflurane 2% at 1-2 L/min O₂ debi) hızlı bir şekilde baş aşamasına fareyi eklemek için kullanılabilir.
   2. Fare baş tutucuya sabitlendikten sonra ve koruma tüpünün içinde olan Steps 3.1.1-3.1.5.

4. floresan CSF izleyiciler infüzyon

1. Akut CM kanülasyon
   1. Adım 1,6 içinde Sarnıcı Magna yerleştirilmeden önce izleyici zaten kanül yüklendi beri, istenen oran ve hacim için infüzyon pompası ayarlayın. Rutin olarak kullanılan infüzyon paradigmaları 1-2 μL/dak 'da 5-10 μL 'dir, ancak bu parametreler belirli denemeye veya hayvanın boyutuna ve yaşına bağlı olarak ayarlanabilir.
2. Kronik CM kanülasyon
   1. Görüntüleme oturumuna başlamadan önce, infüzyon hattını izleyicileri teslim etmek için hazırlamak üzere akut deneyler için 1.2-1.7 adımlarına uyun.
   2. Hat hazırlandıktan sonra, hemostat kelepçe kullanarak kronik CM kanülün mühürlü ucunu kesti. Adım 4.2.1 ' de hazırlanan çizginden iğne alın ve yavaşça kanül içine yerleştirin. Kelepçeyi serbest bırakın ve şırınga pompasını kullanarak, izleme elemanı CM 'de implante edilen iğneye ulaşana kadar, deney için istenen infüzyon oranıyla (örn. 2 μL/dak) CSF izleyici 'yi ilerlet.
      DIKKAT: Eğer iğne, hattı bağlarken boru üzerinden Sapırsa, iğneyi çıkarın, deldi segmenti kesip bu adımı tekrarlayın. PE10 tüpteki herhangi bir gözyaşı bir sızıntı neden olur ve deney sonuçlarını etkiler.

5. Imaging Session kurulumu

1. İnfaşlık edilen floresan İzleyicine dayanarak, her kanal için uyarma dalga boyu ve pozlama süresini belirleyin. Zaman atlamalı görüntüleme temporal çözünürlüğünü maksimize etmek için izleyici görselleştirmek için gereken en kısa pozlama süresini seçin. Bu pozlama süresi, farklı hayvanlar arasında CSF taşımacılığı karşılaştırmak amaçlayan tüm sonraki deneyler için kullanılacaktır.
   Not: bir ipucu pozlama süresini ayarlamak için CM satırında izleyici kullanmaktır. Bu yararlı bir ilk yaklaşım olsa da, bu zaman içinde optimize edilmelidir.
2. Denemenin süresini ve görüntülerin elde edilecek aralıklarını seçin. Deney normal olarak son 30-60 arasında en az hangi faz glymphatic taşıma ilgi olduğunu bağlı olarak. 1 kare/dak ve daha hızlı kare hızları çoğu deney için yeterlidir.
3. Dosya adını ve kaydetme dizinini ayarlayın.
4. Diğer değişkenlerin eşzamanlı olarak edinilmesi (örn. Elektrokardiyogram, arter kan basıncı, Elektrofizyoloji) yanı sıra görüntüleme toplanacak ise, makrokapsam ve pompa veri edinme yazılımı ile tetiklenecek şekilde programlanabilmektedir. Bir sonraki adıma geçmeden önce makrokapsamdaki tetikleyici fonksiyonunun doğru olup olmadığını kontrol edin.

6. Transkraniyal optik görüntüleme deneyi

1. İzleyici infüzyon ve görüntüleme aynı anda başlatın.
2. Herhangi bir sızıntı belirtisi için CM kanülünü ve PE10 tüpünü rutin olarak kontrol edin. CM 'de herhangi bir izleyici sızıntısı varsa, bu denemenin sonuçları hariç tutulmalıdır.
   Not: Tracer serebellum birikmeye başlar ve MCA glymphatic yol seyahat etmez, bu CM kanül beyine enjekte edilmiştir muhtemeldir. Bu veriler eklenmemelidir.
3. Akut deneyler için, denemenin tamamlandıktan sonra, fareyi mikroskop 'dan çıkarın ve hala yeterli anestezinin olduğunu kontrol edin. Hızlı bir şekilde fareyi dökür ve beyin dokusunu hasat edin. 4 °c ' de bir gecede% 4 civarında formaldehite (PFA) içinde beyni onarın.
   1. Kronik deneyler için, görüntüleme tamamlandıktan sonra, cm çizgisini kanüden çıkarın, steril acsf ile yıkayın ve cm kanülünü yüksek sıcaklıklı koter ucu ile yeniden mühürleyin. Fare baş standı çıkarın ve kafesine geri dönün. Daha fazla görüntüleme gerekli değildir ve sonra adım 6,3 takip kadar bu işlemi yineleyin.

7. veri analizi

Not: CSF ön izleme gibi MATLAB tabanlı analizler, bu görüntüleme veri kümeleri^10,22' de Tracer cephede büyük miktarlarda nicel veri ayıklayabilir. Ancak, bu dosya türleri de kolayca ithal ve Fiji²³gibi açık kaynak görüntü analiz yazılımı analiz edilebilir.

1. Bio-formatları içe aktarma aracını kullanarak resim yığınlarını Fiji 'ye aktarın. Bu işlev, zaman ve piksel çözünürlüğünü içeren dosya meta verilerini korur. Görüntü yığını bir. tiff dosyası olarak kaydedin.
2. Çokgen seçim aracını kullanarak kafatası veya ilgi alanı etrafında bir ilgi bölgesi (YG) el ile çizin. Örneğin, Şekil 1G 'de, travmalı bir beyin yaralanması sonrasında ipsilateral ve kontralateral Yarımküre için ayrı bir YG çekildi. YG 'yi YG yöneticisine (Analiz > Araçları > YG Manager) eklediğinizden emin olun ve kaydedin.
   Not: CSF taşıma iki ana şekilde nicelik olabilir: 1) bir eşik uygulanmadan sonra YG veya Toplam alan (mm²) yüzdesi olarak ifade edilen zaman veya 2) aküle alanı ortalama floresan yoğunluğu. İkinci Yöntem (Şekil 1s) bir sonraki adımda açıklanmıştır.
3. Eşik seviyesini maksimum floresan ile ayarlayın (görüntü ≫ Adjust ≫ Threshold...). Otsu gibi otomatik eşik yöntemleri normalde CSF Tracer tespit iyi. Eşik uygulayın.
4. İleriye gitmeden önce, çözümleme ≫ ayarlama ölçümlerinde Seçenekler alanı ve alan kesiri seçili olduğundan emin olun. Sonra YG Yöneticisi'nde, daha fazla > Çoklu ölçüseçin.
5. % Alan değerini, çıktıda YG 'nin alan değerini kullanarak mm² olarak dönüştürün. % Alan değerleri, dorsal kortikal yüzeyin yüzde 'ini CSF Tracer ile yansıtır.
6. Zaman fonksiyonu olarak mm² ' de CSF Tracer akını arsa.

Sonuçlar

CSF akım bir epifloresan makrokapsam üzerinde görüntülenmiş (Şekil 1a), murine korteks içinde CSF Tracer taşıma mezoskopik görüntüleme için izin verir. Tüm kafatası kafa plakası, rostral burun kemiklerinin, hem ön hem de parietal kemiklerinin merkezinde ve interparietal kemiğin rostral kısmının (Şekil 1B) görselleştirilmesine izin verir. Görüntüleme sırasında, nasofrontal, sagittal, koronal ve lambdoid sütürler kolayca tespit edil...

Tartışmalar

Ticari olarak mevcut floresan makroskopları ve izleyiciler kullanarak canlı farelerde Transkraniyal CSF görüntüleme yapmak için ayrıntılı bir protokol tarif ettik. Bu teknik basit ve minimal-invaziv, henüz nicel. In vivo görüntüleme, CM tesliminden sonra ³H-dextran ve ¹⁴C-inulin ve ex vivo koronal kesit ölçümü¹⁰' da dahil olmak üzere radyo etiketli izleyicileri sıvı scintbrilasyon sayımı gibi hassas yöntemlerle de ilişkilendirir^.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Bupivacaine HCl			University of Rochester Vivarium
100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81020
A-M Systems Dental Cement Powder	Fisher Scientific	NC9991371
Carprofen			University of Rochester Vivarium
Chlorhexidine	Prevantics	B10800
CMOS Camera	Hammamatsu	ORCA Flash 4.0
Head Plate	University of Rochester	No catalog #	Custom made at the machine shop at the University of Rochester
High-Temperature Cautery	Bovie Medical Corporation	AA01
Insta-set Accelerator	Bob Smith Industries	BSI-151
Isoflurane - Fluriso	Vet One	502017	University of Rochester Vivarium
Ketamine			Strong Memorial Hospital Pharmacy
Krazy Glue	Elmer's Products, Inc	No catalog #, see link in comments	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Micropore Surgical tape	Fisher Scientific	19-027-761
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	P6148
PE10 - Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous	Braintree Scientific	PE10 100 FT
Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe	Harvard Apparatus	70-4501
PURALUBE VET OINTMENT	Dechra
Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks	Fisher Scientific	22-029-553
Research Macro Zoom Microscope	Olympus	MVX10
Simple Head Holder Plate (for mice)	Narishige International USA Inc	MAG-1
Single-use Needles, BD Medical	VWR	BD305106
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	22-363-750
Tunable LED	PRIOR Lumen 1600-LED
Xylazine			University of Rochester Vivarium