In Vivo Imaging von Cerebrospinalfluid Transport durch den intakten Mausschädel mittels Fluoreszenz-Makroskopie

Zusammenfassung

Die transkranielle optische Bildgebung ermöglicht eine Großfeld-Bildgebung des Zerebrospinalflüssigkeitstransports im Kortex lebender Mäuse durch einen intakten Schädel.

Zusammenfassung

Der Fluss von Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) bei Nagetieren wurde weitgehend mit Hilfe der Ex-vivo-Quantifizierung von Tracern untersucht. Techniken wie die Zweiphotonenmikroskopie und die Magnetresonanztomographie (MRT) haben die In-vivo-Quantifizierung des CSF-Flusses ermöglicht, sind aber durch reduzierte Bildgebungsvolumina bzw. geringe räumliche Auflösung begrenzt. Jüngste Arbeiten haben herausgefunden, dass CSF durch ein Netzwerk von perivaskulären Räumen, die die pialen und durchdringenden Arterien des Nagetierkortex umgeben, in das Gehirn parenchym eintritt. Dieser perivaskuläre Eintrag von CSF ist ein Primärtreiber des glymphatischen Systems, ein Weg, der in die Clearance toxischer Stoffwechselsolutes (z. B. Amyloid-B) involviert ist. Hier zeigen wir eine neue makroskopische Bildgebungstechnik, die eine mesoskopische Bildgebung fluoreszierender CSF-Tracer durch den intakten Schädel lebender Mäuse in Echtzeit ermöglicht. Diese minimal-invasive Methode ermöglicht eine Vielzahl experimenteller Konstruktionen und ermöglicht ein- oder wiederholtes Testen der CSF-Dynamik. Makroskope haben eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung und ihre große Portal- und Arbeitsdistanz ermöglicht die Bildgebung bei der Ausführung von Aufgaben auf Verhaltensgeräten. Dieser bildgebende Ansatz wurde anhand von Zwei-Photonen-Bildgebungs- und Fluoreszenzmessungen validiert, die aus dieser Technik gewonnen wurden, und korrelieren stark mit Ex-vivo-Fluoreszenz und Quantifizierung von radiomarkierten Tracern. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie transkranielle makroskopische Bildgebung zur Bewertung des glymphatischen Transports bei lebenden Mäusen verwendet werden kann, was eine zugängliche Alternative zu teureren bildgebenden Verfahren bietet.

Einleitung

Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) badet das Gehirn und Rückenmark und ist an der Aufrechterhaltung der Homöostase beteiligt, Die Versorgung mit Nährstoffen, und Regulierung des intrakraniellen Drucks¹. CSF im subarachnoiden Raum gelangt durch ein Netzwerk perivaskulärer Räume (PVS) um kortikale piale Arterien in das Gehirn und fließt dann entlang eindringender Arterioles². Einmal im Parenchym, CSF-Austausch mit interstitiellen Flüssigkeit (ISF), tragen schädliche Metaboliten wie Amyloid-A (A) und Tau-Protein-Aggregate aus dem Gehirn durch niedrigen Widerstand weiße Materie-Trakte und perivenous Räume^2,3 . Dieser Weg ist abhängig von astroglialen Aquaporin-4 (AQP4) Kanälen und wurde daher als das glial-lymphatische (glymphatische) System⁴bezeichnet. Abfallprodukte des Neuropils werden schließlich durch Lymphgefäße in der Nähe von Hirnnerven und in den Hirnhäusten in Richtung der zervikalen Lymphknoten⁵von der CSF-ISF befreit. Das Versagen dieses Systems wurde in mehrere neurologische Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit^6,7, traumatische Hirnverletzung³, und ischämischen und hämorrhagischen Schlaganfall⁸verwickelt.

DER CSF-Transport kann durch Infundieren von Tracern indie Zisternenmagna (CM) 9,¹⁰ und glymphatische Studien in der Vergangenheit hauptsächlich zweiphotonenmikroskopische^{4,11,12, 13}, Magnetresonanztomographie (MRT)^14,15,16,17und ex vivo Imaging^{3,6,11, 18} zur Auswertung der Tracer-Kinetik. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie ist aufgrund ihrer hohen räumlichen Auflösung ein geeignetes Verfahren zur detaillierten Abbildung von CSF-Spuren in PVS und dem Parenchym, allerdings hat sie ein schmales Sichtfeld und erfordert ein invasives Schädelfenster oder eine Ausdünnung des Schädels. Ex-vivo-Bildgebung in Kombination mit Immunhistochemie ermöglicht mehrstufige Analysen von Einzelzellen bis zum gesamten Gehirn¹⁹. Der Prozess der Perfusionsfixierung, der zur Beobachtung des postmortalen Gewebes erforderlich ist, führt jedoch zu tiefgreifenden Veränderungen in der CSF-Flussrichtung und reduziert die PVS, wodurch die Verteilung und die Position der Tracer erheblich verändert werden¹². Schließlich, während MRT CSF-Fluss im gesamten murine und menschlichen Gehirn verfolgen kann, fehlt es ihm an räumlicher und zeitlicher Auflösung des perivaskulären Flusses.

Eine neue Technik, die transkranielle makroskopische Bildgebung, löst einige dieser Einschränkungen, indem sie eine Großfeld-Bildgebung des perivaskulären CSF-Transports im gesamten dorsalen Kortex lebender Mäuse ermöglicht. Diese Art der Bildgebung erfolgt mit einem epifluoreszierenden Makroskop mit einem Multiband-Filterwürfel, einer abstimmbaren LED-Lichtquelle und einer hocheffizienten CMOS-Kamera¹⁰. Diese Setups sind in der Lage, PVS bis zu 1-2 mm unter der Schädeloberfläche aufzulösen und fluorophore bis zu 5-6 mm unter der kortikalen Oberfläche zu erkennen, während der Schädel vollständig intakt^{bleibt 10}. Multibandfilter und LEDs, die die Anregungswellenlänge schnell optimieren können, ermöglichen die Verwendung mehrerer Fluorophore, sodass CSF im selben Experiment mit Tracern unterschiedlicher Molekulargewichte und chemischer Eigenschaften gekennzeichnet werden kann.

Dieses Verfahren erfordert eine einfache, minimal-invasive Operation, um den Schädel freizulegen und eine leichte Kopfplatte zu platzieren, um den Kopf während der Bildgebungssitzung zu stabilisieren. Tracer können in den CM geliefert werden, ohne in den Schädel zu bohren oder das kortikale Gewebe mit Pipetten oder Kanülen^9,20zu durchdringen. Sowohl CM-Kanülen als auch Kopfplatten bleiben für mehrere Tage bis Wochen stabil und ermöglichen komplexere experimentelle Designs im Vergleich zur klassischen Endpunktvisualisierung. Dieses Protokoll beschreibt, wie transkranielle makroskopische Bildgebung verwendet wird, um die funktionale glymphatische Systemfunktion nach akuter oder chronischer Injektion von fluoreszierendem CSF-Tracer in den CM von anästhesierten/schlafenden oder wachen Mäusen zu untersuchen.

Protokoll

Alle Experimente wurden vom University Committee on Animal Resources (UCAR, Protocol No. 2011-023) an der University of Rochester genehmigt und gemäß dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

1. Vorbereitung der Cisterna magna Kanüle, Kopfplatte und Kopfhalter

1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente und Kopfplatten vor der Operation.
   HINWEIS: Fluoreszierende Tracer werden über eine Cisterna-Magna-Kanulation direkt in CSF geliefert. Ausführliche Anweisungen zu diesem Verfahren finden Sie unter Xavier et al⁹.
2. Kurz mit einem Nadeltreiber brechen Sie die Spitze einer 30G x 12,7 mm (1/2 Zoll) Nadel, 3/4 des Weges nach unten, und legen Sie das stumpfe Ende der Nadel in ein Ende des Polyethylen 10 (PE10) Rohre (ca. 45 cm lang). Stellen Sie sicher, dass nur die Abschrägung aus dem Rand des PE10-Schlauchs herausragt.
3. Brechen Sie 1/4 des abgeschrägten Endes einer weiteren 30G-Nadel ab und legen Sie das stumpfe Ende der restlichen Nadel in das andere Ende des PE10-Schlauches, wobei das Kunststoff-Luer-Schloss noch befestigt ist.
4. Füllen Sie eine 100 L Glasspritze mit sterilem, künstlichem CSF (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 10 mM Glukose und 26 mM NaHCO₃).
5. Befestigen Sie die Spritze am Ende der Linie und füllen Sie sie mit einem CSF, bis sie die Spitze der abgeschrägten Nadel erreicht. Es ist wichtig, dass die Spritze mit einem CSF und nicht mit Luft verfüllt wird, da eine Luftsäule anfälliger für variable Infusionsvolumina ist.
6. Für chronische Experimente, lassen Sie die Linie mit aCSF gefüllt und überspringen Schritt 1.7.
7. Legen Sie bei akuten Experimenten die Spritze auf eine Infusionspumpe und ziehen Sie ca. 5 mm Luft ab, wodurch eine Vermischung verhindert wird. Ziehen Sie anschließend das für das Experiment gewünschte Gesamtvolumen der Tracer(n) zurück (20% extra werden aufgrund von Totraumverlusten empfohlen).
   HINWEIS: Der PE10-Schlauch sollte lang genug sein, damit die Luftblase beim Laden des Tracers nicht in die Kunststoffmanschette der Glasspritze gelangt. Für ein typisches Experiment verwendet das Protokoll 10 L Rinderserumalbumin, konjugiert mit Alexa Fluor 647 (BSA-647), das in aCSF mit 0,5% verdünnt wird.
8. Bestätigen Sie, dass die Kopfplatte in den Kopfhalter passt und dass sie die richtige Größe für die verwendete Maus hat. Anatomische Markierungen, um dies zu gewährleisten sind: der obere Rand des Fensters richtet sich an der interokularen Linie und der hintere Rand fällt rostral auf den okzipitalen Kamm.
   HINWEIS: Kopfplatten aus Edelstahl können sterilisiert und wiederverwendet werden. Die meisten Cyanoacrylat-Mischungen können mit einer Acetonlösung entfernt werden.

2. Chirurgischer Eingriff

1. Wiegen und anästhesieren Sie die Maus (z. B. Ketamin/Xylazin; 100 mg/kg Ketamin, 10 mg/kg Xylazin; i.p.).
2. Sobald die Maus nicht mehr auf eine Zehenprise reagiert, befeuchten Sie den Hals und Kopf mit sterilem Wasser und rasieren Sie sich mit Clippern. Sobald der Bereich rasiert ist, wischen Sie den Bereich mit einem Alkoholtupfer erneut ab, um restliche Haare zu entfernen.
   HINWEIS: Das Befeuchten des Fells vor dem Clipping reduziert die Menge an Haaren im Bildfenster nach dem Schnitt drastisch.
3. Legen Sie die Maus in einen stereotaktischen Rahmen auf einem temperaturgeregelten Pad und tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen der Maus auf, um sicherzustellen, dass sie nicht austrocknen.
4. Reinigen Sie die exponierte Haut mit einem Chlorhexidintupfer. Nach 2 min entfernen Sie das Chlorhexidin mit einem Alkoholwisch. Wenden Sie schließlich eine Jodlösung an, die zum Trocknen gelassen werden kann.
5. Subkutane Analgesie (0,25% Bupivacaine HCl) an der Schädel- und Halsoberseite injizieren.
6. Beginnend auf dem Teil des Halses, der den okzipitalen Kamm bedeckt, machen Sie eine Mittellinie in der darüberliegenden Haut geschnitten und weiter rostral in Richtung der interorbitalen Linie. Schneiden Sie seitlich an die Grenze, wo der zeitliche Muskel in den Schädel einfügt. Entfernen Sie die gesamte Haut des fusiformen Schnittes, um sowohl die frontalen als auch die parietalen Knochen freizulegen.
   VORSICHT: Der retroorbitale Sinus liegt kaudal zu den Augen und große Zweige der hinteren Gesichtsvene liegen rostral zur Pinna. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie den Schnitt machen, um diese Strukturen zu schonen. Wenn dies geschieht, stoppen Sie die Blutung, indem Sie hämostasis mit einem sterilen Wattestäbchen für einige Minuten aufrecht erhalten und fortfahren.
7. Bewässern Sie den Schädel mit steriler Herzhaftlinie und reinigen Sie die Oberfläche mit Wattestäbchen, so dass er frei von Schmutz und Haaren ist, da diese die Bildqualität beeinträchtigen. Schädeltransparenz wird am besten erhalten, indem das Periost und die darüber liegende Faszie intakt bleiben.
   HINWEIS: Wenn diese Strukturen versehentlich entfernt werden, kann der Schädel im Laufe der Zeit trocken und undurchsichtig werden. Mit aCSF refeuchten oder eine Mischung aus Paraffinöl und Glycerin verwenden, um die Schädelreflexion in akuten Experimenten zu reduzieren²¹.
8. Fahren Sie mit dem Einsetzen der Cisterna magna Kanüle fort - für chirurgische Details dieses Verfahrens, siehe Xavier et al⁹.
9. Nach dem Einsetzen der CM-Kanüle, wenden Sie eine Mischung aus Zahnzement mit Cyanoacrylat-Kleber auf die ventrale Seite der Kopfplatte um die Grenze und legen Sie es auf den Schädel, so dass die vordere Grenze der Kopfplatte mit der hinteren Spitze des Nasenknochens und der po Der sterior-Rahmen richtet sich an den vorderen Aspekt des interparietalen Knochens an und stellt sicher, dass die sagittale Naht (Mittellinie) zentriert und gerade relativ zum Fenster ist (Abbildung 1B).
10. Fixieren Sie die Position der Kopfplatte mit ein paar Tropfen Leimbeschleuniger. Füllen Sie die verbleibenden Lücken mit dem Zementgemisch und härten Sie es mit dem Beschleuniger aus.
    VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass das Cyanoacrylat nicht mit den Augen der Maus in Berührung kommt, oder blockieren Sie das Bildfenster.
11. Kleben Sie die CM-Kanüle an die Kopfplatte, um sicherzustellen, dass diese während des Transports oder beim Aufwachen der Maus nicht abgelöst werden.
12. Für akute Experimente fahren Sie mit Schritt 2.16 fort.
13. Für chronische Experimente, wenden Sie eine dünne Schicht von klar trocknenden Cyanoacrylat-Kleber auf den exponierten Schädel, achten Sie darauf, keine Blasen zu schaffen, da diese mit der Bildgebung stören. Der Kleber schützt den Schädel und stört die Bildgebung nicht. Stellen Sie sicher, dass der Kleber den freiliegenden Schädel bis zur Haut am Schnittrand bedeckt.
14. Verwenden Sie eine Hämostatklemme, um den aCSF-gefüllten PE10 Schlauch 2-3 cm vom CM zu halten und schneiden Sie die Linie mit einer Hochtemperatur-Kauter-Spitze. Nach dem Abtrennen den geschmolzenen PE10-Schlauch abflachen, um die Kanüle abzudichten.
    VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass Sie die Klemme erst nach dem Abdichten der Kanüle lösen und bestätigen, dass es keine Lecks in den Schläuchen gibt, um eine CSF-Fistel zu verhindern.
15. Carprofen (5 mg/kg alle 24 h für 3 Tage; i.p. oder s.c.) verabreichen und die Maus in einen temperaturgeregelten, einstöckigen Käfig zurückbringen und sie vor der Bildgebung für mindestens 24 h erholen lassen. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie genügend Bewusstsein zurückgewinnt, um die Brustbesinnung aufrechtzuerhalten. Intakte Schädelfenster bleiben mehrere Wochen stabil.
    HINWEIS: Das chronische Experiment kann hier angehalten werden.
    VORSICHT: Einige postoperative Komplikationen sind: Cephalohematome/subgaleale Hämatome, CSF-Fistel und Infektion.
16. Für akute Experimente, legen Sie die Maus in den Kopfhalter mit der Kopfplatte, so dass der Schädel in einer festen Position ist. Achten Sie darauf, anästhesieniveau zu überprüfen und legen Sie ein Heizkissen unter die Maus. Die Maus kann nun zum Makroskop gebracht werden.
    VORSICHT: Transportieren Sie die Maus vorsichtig zusammen mit der Infusionspumpe auf einem Wagen. Wenn die CM-Kanulation verdrängt wird, wird es zu einem Rückgang des intrakraniellen Drucks führen und alle CSF-Lecks werden die experimentellen Ergebnisse verändern.

3. Vorbereiten der Maus für die Bildgebung

HINWEIS: Das Protokoll hängt davon ab, ob das Bildgebungsexperiment an einer anästhesierten (Start bei Schritt 3.1) oder wach (Start bei Schritt 3.2) Maus durchgeführt wird.

1. Anästhesisierte Mäuse
   1. Stellen Sie den Kopfhalter auf die Bühne des Makroskops, um sicherzustellen, dass sich keine Knicke in der Leitung von der Spritzenpumpe bis zur CM-Kanüle befinden und dass er nicht straff ist, da dies die Tracer-Infusion beeinträchtigen könnte.
   2. Beobachten Sie die Atemfrequenz und die rosa Färbung der Schleimhäute, was auf eine gute Sauerstoffversorgung hinweist. Injizieren Sie bei Bedarf akutan, um den Hydratationsgrad zu sichern. Stellen Sie sicher, dass das Tier ausreichend beästhebt ist und bei Bedarf erneut dosiert wird.
   3. Schalten Sie die Makroskopkamera und LED ein und starten Sie den LIVE-Modus.
   4. Bestätigen Sie die Vergrößerung des Bildgebungsfeldes, so dass die nasofrontale Naht an der Spitze des Feldes und die Lambdoid-Naht an der Unterseite deutlich visualisiert werden kann, wobei die sagittale Naht parallel und zentriert zur Mitte des Bildes ist (Abbildung 1C). Sobald Sie an Ort und Stelle sind, sichern Sie den Kopfhalter mit Klebeband an der Makroskop-Bühne.
   5. Konzentrieren Sie das Makroskop auf den freiliegenden Schädel. Obwohl Makroskope eine relativ große Schärfentiefe haben, erlaubt die Krümmung des Schädels der Maus nur, dass ein bestimmter Bereich im Fokus steht. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn sich die Brennebene an den Seiten der parietalen Knochen hinter den koronalen Nähten befindet.
      HINWEIS: Dies ist die Position der mittleren Hirnarterien (MCA), wo die meisten CSF-Zufluss auftritt (Abbildung 1D,E)¹⁰.
2. Awake Mäuse
   1. Lassen Sie die Tiere vor der Bildgebung mindestens 24 Stunden von der Kopfplattenoperation erholen. Längere Erholungszeiten (5-7 Tage) werden ebenfalls empfohlen. Trainieren Sie während dieser Zeit die Maus, um für die Dauer der Erholungsphase 0,5-1 h pro Tag auf der Bühne im Rückhalterohr fixiert zu werden.
      HINWEIS: Die Habituation ermöglicht es, die Maus ohne Anästhesie am Kopfhalter zu befestigung und reduziert Stress und Angst während des eigentlichen Experiments. Wenn dies nicht möglich ist und die Anästhesie das Experiment nicht beeinträchtigt, kann eine Induktionsdosis eines inhalierten Anästhetikums (z. B. Isofluran 2% bei 1-2 L/min_O2 Durchfluss) verwendet werden, um die Maus schnell an der Kopfstufe zu befestigen.
   2. Sobald die Maus am Kopfhalter und im Rückhalterohr befestigt ist, folgen Sie den Schritten 3.1.1-3.1.5.

4. Infusion fluoreszierender CSF-Tracer

1. Akute CM-Kanulation
   1. Da der Tracer bereits vor dem Einstecken in die Zisterne magna in Schritt 1.6 in die Kanüle geladen wurde, stellen Sie die Infusionspumpe auf die gewünschte Geschwindigkeit und Lautstärke ein. Die routinemäßig verwendeten Infusionsparadigmen sind 5-10 l bei 1-2 l/min, aber diese Parameter können je nach Experiment oder Größe und Alter des Tieres angepasst werden.
2. Chronische CM-Kanulation
   1. Bevor Sie mit der Bildgebungbeginnen beginnen, folgen Sie den Schritten 1.2-1.7 für akute Experimente, um die Infusionslinie vorzubereiten, um die Tracer zu liefern.
   2. Sobald die Linie vorbereitet ist, schneiden Sie mit einer Hämostatklemme das versiegelte Ende der chronischen CM-Kanüle. Nehmen Sie die Nadel aus der in Schritt 4.2.1 vorbereiteten Linie und legen Sie sie vorsichtig in die Kanüle ein. Lösen Sie die Klemme und verwenden Sie die Spritzenpumpe, bringen Sie den CSF-Tracer mit der gewünschten Infusionsrate (z.B. 2 l/min) für das Experiment vor, bis der Tracer die implantierte Nadel im CM erreicht.
      VORSICHT: Wenn die Nadel beim Anschluss der Linie durch die Schläuche durchdringt, entfernen Sie die Nadel, schneiden Sie das durchbohrte Segment und wiederholen Sie diesen Schritt. Jeder Riss in den PE10-Schläuchen verursacht ein Leck und wirkt sich auf die Ergebnisse des Experiments aus.

5. Einrichten der Imaging-Sitzung

1. Bestimmen Sie anhand des infundierten fluoreszierenden Tracers die Anregungswellenlänge und die Belichtungszeit für jeden Kanal. Wählen Sie die kürzeste Belichtungszeit, die erforderlich ist, um den Tracer zu visualisieren, um die zeitliche Auflösung der Zeitraffer-Bildgebung zu maximieren. Diese Expositionszeit wird für alle nachfolgenden Experimente verwendet, die darauf abzielen, den CSF-Transport zwischen verschiedenen Tieren zu vergleichen.
   HINWEIS: Eine Spitze ist die Verwendung des Tracers in der CM-Linie, um die Belichtungszeit anzupassen. Obwohl dies ein nützlicher erster Ansatz ist, sollte dies im Laufe der Zeit optimiert werden.
2. Wählen Sie die Dauer des Experiments und die Intervalle aus, in denen die Bilder erfasst werden sollen. Experimente dauern in der Regel zwischen 30-60 min, je nachdem, welche Phase des glymphatischen Transports von Interesse ist. Bildraten von 1 Frame/min und schneller sind für die meisten Experimente ausreichend.
3. Legen Sie den Dateinamen und das Speicherverzeichnis fest.
4. Wird die Bildgebung zusätzlich zur gleichzeitigen Erfassung anderer Variablen (z.B. Elektrokardiogramm, arterieller Blutdruck, Elektrophysiologie) gesammelt, können Makroskop und Pumpe so programmiert werden, dass sie mit der Datenerfassungssoftware ausgelöst werden. Überprüfen Sie, ob die auslösende Funktion auf dem Makroscope korrekt ist, bevor Sie zum nächsten Schritt wechseln.

6. Transkranielles optisches Bildgebungsexperiment

1. Starten Sie die Tracer-Infusion und die Bildgebung gleichzeitig.
2. Überprüfen Sie routinemäßig die CM-Kanüle und die PE10-Schläuche auf Anzeichen eines Lecks. Wenn tracer am CM austritt, müssen die Ergebnisse dieses Experiments ausgeschlossen werden.
   HINWEIS: Wenn Tracer beginnt, sich im Kleinhirn anzusammeln und nicht den glymphatischen Weg des MCA zu bewegen, ist es wahrscheinlich, dass die CM-Kanüle in das Kleinhirn injiziert wurde. Diese Daten sollten nicht berücksichtigt werden.
3. Für akute Experimente, nach Abschluss des Experiments, entfernen Sie die Maus aus dem Mikroskop und überprüfen Sie, ob es noch ausreichend betäuisiert ist. Enthaupten Sie schnell die Maus und ernten Sie das Hirngewebe. Das Gehirn über Nacht bei 4 °C in 4% Paraformaldehyd (PFA) fixieren.
   1. Für chronische Experimente, sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, entfernen Sie die CM-Linie aus der Kanüle, spülen Sie mit sterilem aCSF und versiegeln Sie die CM-Kanüle mit einer Hochtemperatur-Kauteryspitze. Entfernen Sie die Maus aus dem Kopfständer und geben Sie sie in ihren Käfig zurück. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis keine weitere Bildgebung erforderlich ist, und folgen Sie dann Schritt 6.3.

7. Datenanalyse

HINWEIS: Matlab-basierte Analysen, wie z. B. CSF-Front-Tracking, können große Mengen quantitativer Daten aus den Tracerfronten in diesen Bildgebungs-Datasets^{extrahieren 10,22}. Diese Dateitypen können jedoch auch einfach importiert und in Open-Source-Bildanalysesoftware wie Fidschi²³analysiert werden.

1. Importieren Sie die Bildstapel mit dem Importtool Bio-Formats nach Fidschi. Diese Funktion behält die Dateimetadaten bei, die die Zeit- und Pixelauflösung enthalten. Speichern Sie den Bildstapel als .tiff-Datei.
2. Zeichnen Sie manuell einen Bereich von Interesse (ROI) um den Schädel oder den Interessenbereich mit dem Polygonauswahlwerkzeug. In Abbildung 1G wurde beispielsweise ein ROI für die ipsilaterale und für die kontralaterale Hemisphäre nach einer traumatischen Hirnverletzung separat gezeichnet. Stellen Sie sicher, dass Sie den ROI in den ROI Manager (Analyze>Tools>ROI Manager) hinzufügen und speichern.
   ANMERKUNG: Der CSF-Transport kann auf zwei Arten quantifiziert werden: 1) mittlere Fluoreszenzintensität im Zeitverlauf oder 2) Zustromfläche, ausgedrückt als Prozentsatz des ROI oder der Gesamtfläche (mm²), nachdem ein Schwellenwert angewendet wurde. Die letztgenannte Methode (Abbildung 1H) wird in den nächsten Schritten beschrieben.
3. Legen Sie den Schwellenwert für den Rahmen mit maximaler Fluoreszenz fest (Bild auswählen>Anpassen>Schwellenwert...). Automatisierte Schwellenwertmethoden wie Otsu sind normalerweise gut bei der Erkennung von CSF-Tracer. Wenden Sie den Schwellenwert an.
4. Stellen Sie vor der Zukunft sicher, dass in Analysieren>Messungen festlegen die Optionen Bereich und Flächenfraktion ausgewählt sind. Wählen Sie dann im ROI-Manager Mehr>Multi-Messungaus.
5. Konvertieren Sie den Wert %Area in mm² mit dem Flächenwert des ROI aus der Ausgabe. Die Werte %Area spiegeln den Prozentsatz der dorsalen kortikalen Oberfläche mit CSF-Tracer wider.
6. Plotten SIE den CSF-Tracer-Zufluss in mm² als Funktion der Zeit.

Ergebnisse

Der CSF-Zustrom wird auf einem epifluoreszierenden Makroskop (Abbildung 1A) abgebildet, das eine mesoskopische Abbildung des CSF-Tracer-Transports im murinen Kortex ermöglicht. Die Ganzschädelkopfplatte ermöglicht die Visualisierung der rostralen Nasenknochen, sowohl der frontalen als auch der parietalen Knochen in der Mitte, und des rostralen Teils des interparietalen Knochens kauarisch (Abbildung 1B). Während der Bildgebung können die nasofrontalen, sagit...

Diskussion

Wir haben ein detailliertes Protokoll für die Durchführung transkranieller CSF-Bildgebung bei lebenden Mäusen mit kommerziell erhältlichen fluoreszierenden Makroskopen und Tracern beschrieben. Diese Technik ist einfach und minimal-invasiv, aber quantitativ. Die In-vivo-Bildgebung korreliert gut mit empfindlichen Methoden wie der Flüssigszintillationszählung von radiomarkierten Tracern, einschließlich ³H-Dextran und ¹⁴C-Inulin nach CM-Verabreichung, und mit ex vivo koronaler Schnittquantifizie...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Bupivacaine HCl			University of Rochester Vivarium
100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81020
A-M Systems Dental Cement Powder	Fisher Scientific	NC9991371
Carprofen			University of Rochester Vivarium
Chlorhexidine	Prevantics	B10800
CMOS Camera	Hammamatsu	ORCA Flash 4.0
Head Plate	University of Rochester	No catalog #	Custom made at the machine shop at the University of Rochester
High-Temperature Cautery	Bovie Medical Corporation	AA01
Insta-set Accelerator	Bob Smith Industries	BSI-151
Isoflurane - Fluriso	Vet One	502017	University of Rochester Vivarium
Ketamine			Strong Memorial Hospital Pharmacy
Krazy Glue	Elmer's Products, Inc	No catalog #, see link in comments	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Micropore Surgical tape	Fisher Scientific	19-027-761
Paraformaldehyde	Sigma-aldrich	P6148
PE10 - Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous	Braintree Scientific	PE10 100 FT
Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe	Harvard Apparatus	70-4501
PURALUBE VET OINTMENT	Dechra
Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks	Fisher Scientific	22-029-553
Research Macro Zoom Microscope	Olympus	MVX10
Simple Head Holder Plate (for mice)	Narishige International USA Inc	MAG-1
Single-use Needles, BD Medical	VWR	BD305106
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	22-363-750
Tunable LED	PRIOR Lumen 1600-LED
Xylazine			University of Rochester Vivarium