用于评估小鼠生殖道自发性的方法和用于数据分析的基于 MATLAB 的 Uterus 运动跟踪算法

摘要

子宫收缩对女性的福祉很重要。然而，病理性增加的收缩能力可能导致肌张力障碍，特别是在年轻女性。在这里，我们描述了一个简单的前体制剂，允许快速评估平滑肌肉松弛剂的疗效，可用于治疗肌张力障碍。

摘要

失调，或痛苦的抽筋，是最常见的症状与男性在女性，其严重性可以阻碍妇女的日常生活。在这里，我们提出了一个简单和廉价的方法，这将有助于测试新的药物减少子宫收缩。该方法利用整个小鼠生殖道的独特能力，在含有含氧Krebs缓冲液的培养皿中保持前体时表现出自发性活力。这种自发运动类似于人类子宫的波浪状肌膜活动，称为子宫内膜波。为了证明该方法的有效性，我们使用了一种著名的子宫松弛药物，肾上腺素。我们证明，在这个培养皿模型中，1 μM肾上腺素可以快速和可逆地抑制整个小鼠生殖道的自发性。使用普通智能手机或精密数码相机可以轻松记录子宫运动的变化。我们开发了一种基于 MATLAB 的算法，允许运动跟踪通过测量子宫角运动速率来量化自发的子宫运动变化。这种前体方法的一个主要优点是生殖道在整个实验过程中保持不变，保留了所有内在的宫内细胞相互作用。这种方法的主要局限性是，高达10-20%的子宫可能表现出自发性运动。到目前为止，这是第一个定量的除外方法，用于评估培养皿模型中的自发子宫运动。

引言

作为主要的女性器官，子宫对生殖至关重要，对胎儿的滋养^{至关重要。}子宫由三层组成:围膜、肌膜和子宫内膜。子宫是子宫的主要收缩层，在胎儿分娩中起着关键作用。子宫内膜是子宫腔内层，是胚胎植入所必需的。在育龄非怀孕女性中，子宫内膜层在月经周期开始时每月脱落。肌膜通过维持从^子宫1清除坏死子宫内膜组织所需的自发肌膜收缩，帮助这个脱落过程。

不幸的是，增加肌膜收缩性可能导致负面的副作用，如月经失调，或月经痉挛疼痛。这一点在年轻女性和无义女性2中尤为见义勇为。然而，月畸症是不同的每个妇女，并取决于其肌膜收缩的强度;更强的收缩通常与严重痉挛^{的感觉3。}子宫收缩性可以用子宫超声可视化，通常被认为是子宫内膜波。在经子宫内膜脱脂的子宫内，月经4期间前列腺素的增强释放被认为有助于增加肌膜超收缩能力，导致子宫肌肉缺血和缺氧，从而增加疼痛³.

严重的月经失调会妨碍一些妇女的日常活动，3%至33%的妇女有非常剧烈的疼痛，这可能导致妇女卧床1至3天，每个月经周期5。不分年龄、国籍、^{经济地位，}发育迟症是育龄妇女妇科发病的主要原因。在5^岁妇女中，月食症的发病率估计很高，而且变化很大，从45%到93%不等。 与肌痛有关的疼痛对女性的日常生活有影响，并可能导致青少年学习成绩差、睡眠质量降低、日常活动受限和情绪变化5。

许多患有严重肌痛的妇女使用非处方药来缓解疼痛。这种非处方药含有环氧酶（COX）抑制剂，可防止前列腺^素6的形成。然而，COX抑制剂与不良心血管事件有关，约18%的患有心内病的妇女对这些^抑制剂7没有反应。因此，需要新的药物来减少月经痉挛。由于子宫过度收缩有助于肌张力障碍的发病机制，一个可能的策略可能是使用子宫松弛剂。

在自然发生的自发性宫外波样收缩模型中，量化潜在松弛药物的影响是有益的。然而，到目前为止，还没有有效的外体方法测试肌肉松弛药物在完整的子宫。目前，等轴测张力测量用于评估松弛药物效果。在此类测量期间，子宫肌肉条在组织浴中的预负荷下保持恒定长度，而子宫肌肉收缩的力在存在或不存在松弛药物的情况下，在催产素刺激之前和之后被记录。虽然这种方法非常有用，但它需要昂贵的设备。此外，等轴测收缩与自然发生在完整子宫中的自发肌膜波状收缩不相像。无独有偶，当整个生殖道（卵巢、输卵管、子宫和阴道）保持在缓冲溶液中时，啮齿动物的子宫肌膜波可以形象化为子宫角运动。在这里，我们提出了一个前体方法，用于监测放置在含有含氧克雷布斯缓冲液的培养皿中的完整小鼠子宫的自发性。我们还介绍了利用 MATLAB 运动跟踪器的运动量化算法。这种新方法提供了一种简单和更便宜的替代方法，以测试自然存在的补救措施和合成化合物的松弛潜力。

研究方案

印第安纳大学医学院（印第安纳波利斯，IN）机构动物护理和使用委员会批准了所有动物程序。该研究使用了2-5个月大的F2-129S-C57BL/6性成熟雌性小鼠。

警告:在使用动物和生物危险材料时，应佩戴实验室外套、面罩和手套，确保安全。

1. 解决方案准备

1. 准备克雷布斯缓冲液，其中包含:130 mM NaCl， 5 mM KCl， 2mM CaCl 2， 1.2m NaH₂PO₄， 0.56 mM MgCl_2，25 mM NaHCO_3，和 5 mM 葡萄糖， pH 7.4.用含有 5% CO₂和 95% O₂的压缩气体混合物连续给 Krebs 缓冲液进行氧制，同时使用循环水浴将缓冲温度保持在 37°C。
2. 准备Dulbeco的磷酸盐缓冲盐（DPBS），其中包含:2.68 mM KCl，1.47 mM KH₂PO_4，136.89 mM NaCl， 和 8.1mM Na₂HPO₄， pH 7.4.

2. 动物准备

1. 使用吸入胶质对小鼠进行麻醉（3%）用废气清理。通过评估戒断反射，确保充足的麻醉。捏住后脚趾，确认没有引起任何运动，表明反射反应的丧失。在深度麻醉后，通过斩首使动物安乐死。
   注:肌胶质可能导致平滑肌肉扩张。因此，在开始活体实验之前，应在克雷布斯缓冲液中广泛清洗和孵育至少15-30分钟。当肌胶与皮肤接触时，可能导致刺激和不适，因此请小心操作。
2. 将尸体放在一艘用纸巾衬里的大称重船上。
   注:怀孕的雌性实验室人员不应参与肌胶的实验，因为它可以减少胎儿体重，减少胎儿骨骼增白，增加自然流产^{的风险8，9。}_CO2吸入可作为小鼠安乐死的替代物。

3. 确定最小循环阶段

1. 用小钳子，抬起，进入阴道，并缓慢地将含有10μL DPBS 的微移液器尖端插入阴道。
   1. 确保微移液器尖端以 10 - 30° 的角度插入骨器，以避免刺穿阴道壁。插入后，液体在尖端仍可见。如果液体不可见，尖端插入阴道太远，阴道的副颈椎区域可能已被穿孔。
   2. 用微移液器的尖端轻轻拉下阴道骨质肌肉，让空气从阴道流出。
2. 用 10 μL DPBS 上下移液 2-3 次，缓慢冲洗阴道腔，并将绘制的细胞悬浮液放在玻璃幻灯片上。
3. 使用倒置相位对比显微镜通过细胞学分析确定最经济周期阶段。该过程如其他部分10、11所述完成。在进行细胞学分析之前，确保细胞悬浮液不会变干。如有必要，可用新鲜的 DPBS 稀释悬架。

4. 小鼠生殖道分科

1. 将鼠标排列在上摆位置，并展开其四肢以暴露腹腔位。
2. 用70%乙醇喷雾润湿和消毒腹腔。
3. 使用钳子，小心地抬起位于优越的皮肤。对下腹部区域的横向进行小横向切口，至上肢以暴露腹膜（图1A）。在此过程中，将形成外部活门。随着小切口的不断制造，活门的大小会增大。
4. 小心地穿过围肠，露出胃肠道 （图1B）。需要注意的是，子宫角通常可以直接位于围肠下，因此小心切口，不要接触角，因为这会影响子宫运动。
5. 使用钳子，去除覆盖胃肠道的筋膜和脂肪组织。从腹腔中取出以下胃肠道段:十二指肠、麻黄体、、上升和横结肠（图 1C ）。
6. 要定位生殖器官，首先识别膀胱（图1C，"4"），由于安乐死后空隙，膀胱可能出现消减。阴道将正好在膀胱下面。
7. 在阴骨（胆度到膀胱）的汇合处定位阴囊。
8. 使用剪刀，通过体间纤维素组织小心地在其侧侧进行切口，从而去除阴唇，以获得阴道提取的途径并提供途径（图1D）。
9. 穿过和下部的阴膜。
10. 使用钳子，抬起阴道，慢慢切除直肠。
11. 识别两个子宫角，分叉，罗斯到阴道。在每个喇叭末端找到一个卷曲的输卵管和卵巢，这可能隐藏在剩余的胃肠道段下。使用小型解剖剪刀去除任何连接和支撑腹腔内角、输卵管和卵巢的韧带。
12. 从腹腔中取出生殖道，包括阴道、子宫、输卵管和卵巢。
13. 将孤立的生殖道（图1E）转移到一个100毫米培养皿中，里面装满了10mL的DPBS。不要压缩子宫角，以免损坏子宫。
14. 使用钳子和手术剪刀去除子宫角和阴道周围的任何结缔和脂肪组织，以及阴区任何可能妨碍图像质量的毛皮。去除宽韧带，使子宫角活动。
15. 用新鲜的DPBS清洗分离的生殖道两次，并将其转移到一个35毫米的培养皿中，里面装满了3mL的含氧克雷布斯溶液。

5. 组织成像

1. 将含有生殖道的培养皿置于含氧克雷布斯缓冲液的黑表面上。将盘子保持在室温下。
   注:可以使用红外加热垫将组织保持在37°C。
2. 允许15-30分钟开始自发收缩。使用任何类型的数字视频设备，从轴向平面记录 10 分钟的自发子宫运动。
3. 将制剂转移到含有含氧克雷布斯缓冲液的培养皿中，并辅以测试化合物。使用任何类型的数字视频设备，从轴向平面记录大约 10 分钟的自发子宫运动。
4. 用10mL的DPBS洗净整个生殖道，用10mL的DPBS评估治疗的可逆性。
5. 将制剂转移到带有新鲜含氧克雷布斯缓冲液的培养皿中。使用任何类型的数字视频设备，从轴向平面记录大约 10 分钟的自发子宫运动。
6. 将制剂转移到另一个35毫米培养皿中，里面装满了含氧Krebs缓冲液，并辅以车辆作为测试化合物，以确保自发子宫运动没有机械引起的变化。这是一个重要的控制。
7. 将视频素材传输到计算机硬盘驱动器。

6. 数据分析

1. 使用包含控制、处理和洗涤剧集的原始视频素材中的任何视频编辑软件制作剪辑。
2. 使用 MATLAB 软件和提供的脚本（请参阅在线补充材料）量化自发子宫运动。
   注:必须安装 MATLAB 的计算机视觉工具箱加载项，脚本才能完全正常运行。
   1. 打开 MATLAB 脚本，转到"编辑器"选项卡，然后单击"运行"。
   2. 选择第一个视频文件，然后单击"打开"。
   3. 在弹出对话框中输入视频文件的标签，然后单击"确定"。
   4. 输入计算喇叭移动速率所需的时间间隔（+ 欧氏距离/μs）。
   5. 使用鼠标光标在视频的第一帧上选择两个点。弹出窗口将要求确认所选点应用于跟踪。单击"开始"以启动将在弹出窗口中显示的实时跟踪过程。或者，单击"重新选择点"以重新选择两个点。
   6. 监视弹出窗口上的跟踪过程的准确性。
   7. 在新的弹出窗口中观察速率与时间散点图和距离与时间散点图。通过选择"文件 |在同一窗口中保存 As 以记录数据。
   8. 在 MATLAB 脚本所在的同一目录中查找名为PointTrackerData的文件夹，该文件夹由 MATLAB 自动创建。在两个单独的工作表选项卡中标识名为label_数据的数据，其中包含从视频收集的数据点。
      注:任何替代运动跟踪软件都可用于量化自发性子宫运动。
3. 使用适当的软件（例如 Excel 或 SigmaPlot 13）执行统计分析。

结果

图1显示了本协议中描述的在整个生殖道隔离过程中拍摄的代表性图像。为了避免用毛皮污染缓冲液，这会降低视频质量，我们用70%的乙醇滋润了小鼠身体。协议解剖部分的主要基准是查找膀胱。子宫和阴道将位于低于膀胱。

为了测试这个方案，我们用肾上腺素治疗了整个生殖道。肾上腺素是众所周知的，导致子宫平滑肌肉放松。这种激素在肾上腺髓素?...

讨论

在这里，我们描述了一种评估整个啮齿动物生殖道的自发收缩性的方法，包括卵巢、输卵管、子宫角和阴道。我们用类似的方法来证明苯肾上腺素对自发性子宫^运动13的松弛作用，然而，在过去，我们无法对数据进行定量分析。在这项工作中，我们开发了一种利用MATLAB运动跟踪模块进行定量运动数据分析的算法。这是一个有用的技术，用于测试新的药物，调节子宫收缩性，无论?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642
Dulbecco's PBS	Fisher Sceintific	17-512Q
Ethanol 200 PROOF	Decon Laboratories	2701
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
MgCl2  · 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	07-893-2374
Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps	Fisher Sceintific	13-812-42
Curved Hardened Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissection High-performance Modular Stereomicroscope	Leica	MZ6
Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system	Leica	DFC425 C
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources	Fisher Sceintific	12-562-21
Weigh Boat	Fisher Sceintific	WB30304
Convertors Astound Standard Surgical Gown	Cardinal Health	9515	Small, Medium or Large
Gloves	McKesson Corporation	20-1080	Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves
Petri Dish	Corning Falcon	351029	100 mm
Petri Dish	Corning Falcon	353001	35 mm
95% O2- 5% CO2 gas mixture	Praxair	MM OXCD5-K
Ear-loop Masks	Valumax International	5430E-PP
DSLR 24.2 MP Camera	Canon	EOS Rebel T6i
MATLAB	MathWorks	N/A	version 2019 or later