Método ex vivo para avaliar a motilidade espontânea do trato reprodutivo do mouse e um algoritmo de rastreamento de movimento do útero baseado em MATLAB para análise de dados

Resumo

As contrações uterinas são importantes para o bem-estar das fêmeas. No entanto, a contratilidade patologicamente aumentada pode resultar em dismenorreia, especialmente em fêmeas mais jovens. Aqui, nós descrevemos uma preparação ex vivo simples permitindo a avaliação rápida da eficácia de afrouxamento do músculo liso que podem ser usados tratando o dysmenorrhea.

Resumo

A dismenorreia, ou cãibras dolorosas, é o sintoma mais comum associado à menstruação em fêmeas e sua gravidade pode dificultar a vida cotidiana das mulheres. Aqui, apresentamos um método fácil e barato que seria instrumental para testar novas drogas diminuindo a contratilidade uterina. Este método utiliza a habilidade original do intervalo reprodutivo do rato inteiro para expor a motilidade espontânea quando mantido ex vivo em um prato de Petri que contem o amortecedor oxigenado de Krebs. Esta motilidade espontânea assemelha-se à atividade myometrial onda-como do útero humano, referido como ondas endometrial. Para demonstrar a eficácia do método, empregamos um bem conhecido medicamento relaxante uterino, epinefrina. Nós demonstramos que a motilidade espontânea do intervalo reprodutivo do rato inteiro pode ser rapidamente e reversivelmente inibida pela epinefrina de 1 μM neste modelo do prato de Petri. Documentar as mudanças da motilidade uterina pode ser facilmente feito usando um telefone inteligente comum ou uma câmera digital sofisticada. Nós desenvolvemos um algoritmo MATLAB-baseado permitindo o seguimento do movimento para quantificar mudanças uterine espontâneas da motilidade medindo a taxa de movimentos uterine do chifre. Uma grande vantagem dessa abordagem ex vivo é que o trato reprodutivo permanece intacto durante todo o experimento, preservando todas as interações celulares intrauterinas intrínsecas. A principal limitação dessa abordagem é que até 10-20% dos úteros podem não apresentar motilidade espontânea. Até o momento, este é o primeiro método quantitativo ex vivo para avaliar a motilidade uterina espontânea em um modelo de prato de Petri.

Introdução

Como um órgão fêmea principal, o útero é crucial para a reprodução e essencial para a nutrição do feto¹. O útero consiste em três camadas: o perimetrium, o miométrio e o endométrio. O miométrio é a camada contrátil principal do útero e joga um papel chave na entrega do feto. O endométrio é a camada mais interna que reveste a cavidade uterina e é essencial para a implantação do embrião. Em fêmeas não gestantes em idade reprodutiva, a camada endometrial é vertida mensalmente no início do ciclo menstrual. O miométrio auxilia neste processo de derramamento, mantendo as contrações miometrial espontâneas necessárias para limpar o tecido endometrial necrótico do útero¹.

Infelizmente, aumento da contratilidade miometrial pode resultar em efeitos colaterais negativos, tais como dismenorreia, ou cãibras menstruais dolorosas. Isto é especialmente observado em fêmeas jovens e mulheres nulíparas². No entanto, a dismenorreia é diferente para cada mulher e depende da força de suas contrações miometrial; as contrações mais fortes são frequentemente associadas com a sensação de cãibras severas³. A contratilidade miometrial pode ser visualizada usando ultrassonografia uterina e muitas vezes é reconhecida como ondas endometriais. A liberação aumentada das prostaglandinas durante a menstruação⁴ em um útero que submete-se a descamação endometrial é acreditada para contribuir ao hypercontractility myometrial aumentado, tendo por resultado a isquemia e o hipóxia do músculo uterine e aumentado assim dor³.

Dismenorreia severa pode dificultar a atividade do dia-a-dia de algumas mulheres e 3 a 33% das mulheres têm dor muito severa, o que poderia causar uma mulher a ser acamados por 1 a 3 dias cada ciclo menstrual⁵. A dismenorreia é a principal causa de morbidade ginecológica em mulheres em idade reprodutiva, independentemente da idade, nacionalidade e status econômico⁵. A prevalência estimada de dismenorreia é alta e variável, variando de 45% a 93% em mulheres em idade reprodutiva⁵.  A dor associada à dismenorreia tem efeito no cotidiano das mulheres e pode resultar em mau desempenho acadêmico em adolescentes, menor qualidade de sono, restrição de atividades diárias e alterações de humor⁵.

Muitas mulheres que experimentam dismenorreia grave recorrer a medicamentos over-the-counter para aliviar a sua dor. Tais medicamentos de balcão contêm inibidores da ciclooxigenase (COX) que impedem a formação de prostaglandinas⁶. No entanto, os inibidores da COX estão associados a eventos cardiovasculares adversos, e cerca de 18% das mulheres com dismenorreia não respondem a esses inibidores⁷. Portanto, há uma necessidade de novos medicamentos para reduzir as cólicas menstruais. Desde que sobre o contratilidade do útero contribui à patogénese do dysmenorrhea, uma estratégia possível pode ser o uso de relaxants uterine.

É benéfico quantificar os efeitos de drogas relaxantes potenciais em um modelo de ocorrência natural myometrial espontâneo-como contrações de onda. Entretanto, assim distante, nenhum método ex vivo eficiente para testar drogas músculo-relaxando no útero intacto foi descrito. Atualmente, medições de tensão isométrica são usadas para avaliar os efeitos de drogas relaxantes. Durante tais medidas, uma tira do músculo uterine é mantida em um comprimento constante a pré-carga em um banho do tecido quando a força de contrações do músculo uterine for gravada antes e depois da estimulação do ocitocina na presença ou na ausência de uma droga relaxante. Embora esta aproximação seja muito útil, exige o equipamento caro. Além disso, as contrações isométricas não se assemelham às contrações myometrial espontâneas da onda-como que ocorrem naturalmente no útero intacto. Excepcionalmente, as ondas myometrial uterine nos roedores podem ser visualizadas como a motilidade uterine do chifre quando o intervalo reprodutivo inteiro (ovários, oviducts, útero, e vagina) é mantido em uma solução do amortecedor. Aqui, nós apresentamos um método ex vivo para monitorar a motilidade espontânea do útero intacto do rato coloc em um prato de Petri que contem o amortecedor oxigenado de Krebs. Também descrevemos um algoritmo de quantificação da motilidade utilizando o rastreador de movimento MATLAB. Esta nova abordagem fornece uma alternativa fácil e menos dispendiosa para testar o potencial relaxante de remédios que ocorrem naturalmente e compostos sintéticos.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina da Universidade de Indiana (Indianapolis, IN). 2-5 mês-velho F2-129S-C57BL/6 ratos fêmeas sexualmente maduros foram utilizados no estudo.

Atenção: Assegure a segurança desgastando um revestimento, uma máscara, e umas luvas do laboratório ao trabalhar com animais e materiais bioperigosos.

1. preparação da solução

1. Prepare o tampão Krebs, que contém: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1,2 mm NaH₂po₄, 0,56 mM MgCl₂, 25 mm NaHCO₃e 5 mm glicose, pH 7,4. Oxigenar continuamente o tampão Krebs com uma mistura de gases compridos contendo 5% CO₂ e 95% o₂ , mantendo a temperatura tampão a 37 ° c usando um banho de água circulante.
2. Prepare a solução salina tamponada por fosfato de Dulbecco (DPBS), que contém: 2,68 mm kcl, 1,47 mm KH₂po₄, 136,89 mm NaCl e 8,1 mm na₂HPO₄, pH 7,4.

2. preparação animal

1. Anestesiando camundongos usando inalação de isoflurano (3%) com a eliminação de gases residuais. Assegure a anestesia adequada avaliando reflexos da retirada. Aperte o dedo traseiro para afirmar que não há movimentos são eliciados, indicando a perda de respostas reflexas. Após a anestesia profunda é alcançada, eutanizar o animal por decapitação.
   Nota: Isoflurano pode causar dilatação do músculo liso. Portanto, a preparação do trato reprodutivo deve ser extensivamente lavada e incubada no tampão Krebs por pelo menos 15-30 min antes de iniciar os experimentos ex vivo. O isoflurano pode causar irritação e desconforto quando está em contacto com a pele, por isso proceda com precaução.
2. Coloc o corpo em um grande barco do pesar alinhado com uma toalha de papel.
   Nota: O pessoal de laboratório feminino grávida não deve estar envolvido em experimentos com isoflurano, pois pode diminuir o peso fetal, diminuir a ossificação esquelética fetal e aumentar o risco de aborto espontâneo^8,9. A inalação de CO₂ pode ser usada como um substituto para eutanizar camundongos.

3. determinação da fase de ciclo estral

1. Com fórceps pequeno, levante o clitóris para ganhar o acesso ao óstio vaginal e insira lentamente uma ponta da micropipeta que contem 10 μL de dpbs no vagina.
   1. Assegure-se de que a ponta da micropipeta seja inserida através do óstio em um ângulo de 10-30 ° para evitar perfurar a parede vaginal. O líquido ainda deve ser visível na ponta após a inserção. Se o líquido não é visível, a ponta foi inserida demasiado distante no vagina, e a área paracervicais do vagina pôde ter sido perfurada.
   2. Puxe levemente para baixo nos músculos do óstio vaginal com a ponta da micropipeta para permitir que o ar saia da vagina.
2. Lave lentamente a cavidade vaginal pipetando para cima e para baixo 2-3 vezes com 10 μL de DPBS e coloque a suspensão de células desenhadas numa lâmina de vidro.
3. Use um microscópio de contraste de fase invertida para determinar o estágio de ciclo estral através da análise citológica. O procedimento é feito conforme descrito em outros^10,11. Assegure-se de que a suspensão celular não seque antes que a análise citológica possa ser realizada. A suspensão pode ser diluída com DPBS fresco, se necessário.

4. Ddissecção do trato reprodutivo do rato

1. Arranje o rato em uma posição supina e espalhe suas extremidades para expor a região abdominopelvic.
2. Spray com 70% de etanol para umedecer e desinfectar a área abdominopélvica.
3. Usando fórceps, levante cuidadosamente a pele localizada superior ao clitóris. Fazer pequenas incisões transversais nos aspectos laterais da área abdominal inferior, até as extremidades superiores para expor o peritônio (Figura 1a). Durante este processo, uma aleta externa formarão. Porque as incisões pequenas são feitas continuamente, a aleta aumentará no tamanho.
4. Corte cuidadosamente o peritônio para expor o trato gastrointestinal (Figura 1B). É importante notar que os chifres uterinos podem muitas vezes ser localizado diretamente o peritônio, para fazer incisões cautelosamente e não tocar os chifres, pois isso pode afetar a motilidade uterina.
5. Usando fórceps, retire a fáscia e tecido adiposo cobrindo o trato gastrointestinal. Remover os seguintes segmentos do trato gastrointestinal da cavidade abdominal: o duodeno, jejuno, íleo, cálio, cólon ascendente e transverso (Figura 1C).
6. Para localizar os órgãos reprodutivos, primeiro identifique a bexiga urinária (Figura 1C, "4"), que pode ter uma aparência deflacionada devido à micção após a eutanásia. A vagina estará bem embaixo da bexiga urinária.
7. Localize a sínfise púbica na confluência dos ossos púbica (caudally à bexiga).
8. Usando tesouras, retire a sínfise púbica, fazendo incisões cuidadosamente em seus lados laterais através do tecido fibrocartilaginoso interpúbica para obter acesso e fornecer uma rota para a extração da vagina (Figura 1D).
9. Corte através do períneo localizado entre o ânus e a parte inferior da vulva.
10. Usando fórceps, levante a vagina e retire lentamente o reto.
11. Identifique dois chifres uterinos que se bifurcam em um garfo, rostralmente para a vagina. Localize um oviduto e um ovário complicado no fim de cada chifre, que pode ser escondido os segmentos restantes do aparelho gastrointestinal. Use tesouras de dissecação pequenas para remover todos os ligamentos que conectam e suportam os chifres, os oviducts, e os ovários dentro da cavidade abdominal.
12. Retire o trato reprodutivo, que inclui a vagina, útero, ovidutos e ovários, a partir da cavidade abdominal.
13. Transferir o trato reprodutivo isolado (Figura 1E) para um prato de Petri de 100 mm preenchido com 10 ml de dpbs. Não comprima os chifres uterinos para evitar danificar o miometrium.
14. Use fórceps e tesoura cirúrgica para remover qualquer tecido conjuntivo e adiposo em torno dos chifres uterinos e vagina, bem como qualquer pele na região Púnica que poderia dificultar a qualidade da imagem. Retire o ligamento largo para permitir a motilidade dos chifres uterinos.
15. Lave o trato reprodutivo isolado com o DPBS fresco duas vezes e transfira-o para um prato de Petri de 35 mm preenchido com 3 mL de solução de Krebs oxigenada.

5. imagem latente do tecido

1. Coloque a placa de Petri contendo o trato reprodutivo no tampão de Krebs oxigenado em uma superfície preta. Mantenha o prato à temperatura ambiente.
   Nota: É possível usar uma almofada de aquecimento infravermelha para manter o tecido em 37 ° c.
2. Aguarde 15-30 min para que as contrações espontâneas comecem. Grave a motilidade uterina espontânea por 10 min de um plano axial usando qualquer tipo de equipamento de vídeo digital.
3. Transfira a preparação para uma placa de Petri contendo o tampão de Krebs oxigenado suplementado com um composto de teste. Grave a motilidade uterina espontânea por cerca de 10 min de um plano axial usando qualquer tipo de equipamento de vídeo digital.
4. Lave todo o trato reprodutivo em 100 mm prato de Petri com 10 mL de DPBS para avaliar a reversibilidade do tratamento.
5. Transfira a preparação para uma placa de Petri com o tampão Krebs recém-oxigenado. Grave a motilidade uterina espontânea por cerca de 10 min de um plano axial usando qualquer tipo de equipamento de vídeo digital.
6. Transfira a preparação para outro prato de Petri de 35 mm preenchido com tampão de Krebs oxigenado suplementado com o veículo para o composto de teste para garantir que não haja alterações induzidas mecanicamente na motilidade uterina espontânea. Este é um controle importante.
7. Transfira a gravação de vídeo para um disco rígido do computador.

6. análise de dados

1. Faça clipes usando qualquer software de edição de vídeo da filmagem original contendo o controle, tratamento e episódios de lavagem.
2. Use o software MATLAB e o script fornecido (consulte o material complementar on-line) para quantificar a motilidade uterina espontânea.
   Nota: O complemento Computer Vision Toolbox para MATLAB deve ser instalado para que o script seja totalmente funcional.
   1. Abra o script MATLAB, vá para a guia Editor e clique em executar.
   2. Selecione o primeiro arquivo de vídeo e clique em abrir.
   3. Insira um rótulo para o arquivo de vídeo na caixa de diálogo pop-up e clique em OK.
   4. Insira o (s) intervalo (es) de tempo necessário para calcular a taxa de movimento do chifre (distância Δ euclidiana/ΔS).
   5. Use o cursor do mouse para selecionar dois pontos no primeiro quadro do vídeo. Uma janela pop-up pedirá para confirmar que os pontos selecionados devem ser usados para o rastreamento. Clique em Iniciar para iniciar o processo de rastreamento em tempo real que será exibido na janela pop-up. Como alternativa, clique em selecionar pontos para selecionar novamente os dois pontos.
   6. Monitore a precisão do processo de rastreamento na janela pop-up.
   7. Observe um gráfico de dispersão de taxa versus tempo e distância versus gráfico de dispersão de tempo em uma nova janela pop-up. Salve as duas figuras selecionando arquivo | Salvar como na mesma janela para documentar os dados.
   8. Localize uma pasta denominada Pointtrackerdata, criada automaticamente pelo MATLAB, no mesmo diretório onde o script MATLAB está localizado. Identifique um arquivo do Excel denominado label_Data contendo pontos de dados coletados do vídeo em duas guias de planilha separadas.
      Nota: qualquer software de rastreamento de movimento alternativo pode ser usado para quantificar a motilidade espontânea do útero.
3. Use um software apropriado (por exemplo, Excel ou SigmaPlot 13) para realizar a análise estatística.

Resultados

A Figura 1 mostra imagens representativas tiradas durante todo o procedimento de isolamento do trato reprodutivo descrito neste protocolo. Para evitar contaminar o tampão com pêlo, o que diminuiria a qualidade do vídeo, umedecido o corpo do mouse com 70% de etanol. A principal referência para a seção de dissecção do protocolo é encontrar a bexiga urinária. O útero ea vagina será localizado inferior à bexiga urinária.

Para testar o protocolo, tratamos...

Discussão

Aqui, descrevemos um método para avaliar a contratilidade espontânea de todo o trato reprodutivo de roedores, que inclui os ovários, ovidutos, chifres uterinos e a vagina. Utilizou-se um método semelhante para demonstrar o efeito relaxante da fenilefrina na motilidade uterina espontânea¹³, porém, no passado não pudemos fornecer análise quantitativa dos dados. Neste trabalho, desenvolvemos um algoritmo para análise quantitativa de dados de motilidade utilizando o módulo de rastreamento de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642
Dulbecco's PBS	Fisher Sceintific	17-512Q
Ethanol 200 PROOF	Decon Laboratories	2701
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
MgCl2  · 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	07-893-2374
Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps	Fisher Sceintific	13-812-42
Curved Hardened Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissection High-performance Modular Stereomicroscope	Leica	MZ6
Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system	Leica	DFC425 C
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources	Fisher Sceintific	12-562-21
Weigh Boat	Fisher Sceintific	WB30304
Convertors Astound Standard Surgical Gown	Cardinal Health	9515	Small, Medium or Large
Gloves	McKesson Corporation	20-1080	Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves
Petri Dish	Corning Falcon	351029	100 mm
Petri Dish	Corning Falcon	353001	35 mm
95% O2- 5% CO2 gas mixture	Praxair	MM OXCD5-K
Ear-loop Masks	Valumax International	5430E-PP
DSLR 24.2 MP Camera	Canon	EOS Rebel T6i
MATLAB	MathWorks	N/A	version 2019 or later