שיטה Vivo Ex להערכת בדרכי הרבייה של העכבר לתנועתיות ספונטנית מעקב הרחם MATLAB מבוסס על התנועה אלגוריתם לניתוח נתונים

Summary

התכווצויות הרחם חשובים לרווחתם של הנקבות. עם זאת, באופן פתולוגי הגדילה הפתולוגית עלולה לגרום לדיסנוריאה, במיוחד לנשים צעירות. כאן, אנו מתארים הכנה vivo ex פשוטה המאפשרת הערכה מהירה של היעילות של מרפה שרירים חלקה שניתן להשתמש בהם לטיפול בדינוריאה.

Abstract

דימננוריאה, או התכווצויות כואבות, הוא הסימפטום השכיח ביותר הקשורים מיעוט בנקבות וחומרת שלה יכול להפריע חיי היומיום של נשים. כאן, אנו מציגים שיטה קלה וזולה שתהיה אינסטרומנטלית לבדיקת תרופות חדשות היורדת מתגובת הרחם. שיטה זו מנצלת את היכולת הייחודית של מערכת הרבייה של העכבר כולו כדי להפגין תנועתיות ספונטנית כאשר מתוחזק לשעבר vivo בצלחת פטרי המכילה מאגר קרבס מחמצן. התנועתיות הספונטנית הזאת דומה לפעילות הניסיונית של הרחם האנושי, המכונה גלי רירית-רחם. כדי להדגים את יעילות השיטה, העסקנו סם להרפיית רחם מוכר, אפינפרין. אנו מדגימים כי התנועתיות הספונטנית של מערכת הרבייה של העכבר כולו יכולה להיות מהירה והפיך מעכבות על ידי 1 μM אדרנלין במודל זה פטרי צלחת. תיעוד שינויי תנועתיות הרחם ניתן לבצע בקלות באמצעות טלפון חכם רגיל או מצלמה דיגיטלית מתוחכמת. פיתחנו אלגוריתם מבוסס MATLAB המאפשר מעקב תנועה לכמת שינויי תנועתיות הרחם ספונטנית על ידי מדידת שיעור של תנועות קרן הרחם. היתרון העיקרי של גישה זו vivo ex היא כי מערכת הרבייה נשאר שלם לאורך כל הניסוי כולו, שמירה על כל אינטראקציה הסלולר הפנימית בתוך רחמי. המגבלה העיקרית של הגישה הזאת היא כי עד 10-20% של שטרן עלול להפגין תנועתיות ספונטנית. עד כה, זוהי השיטה הvivo לשעבר הכמותית הראשונה להערכת תנועתיות הרחם הספונטנית במודל צלחת פטרי.

Introduction

כאיבר הנשי העיקרי, הרחם הוא חיוני לרבייה וחיוני להזנה של העובר¹. הרחם מורכב משלוש שכבות: הפריטרינום, myometrium ו רירית. Myometrium הוא שכבת הקונקטילה הגדולה של הרחם וממלא תפקיד מפתח במסירה העובר. רירית הרחם היא השכבה הפנימית ביותר בטנה חלל רחמי והוא חיוני עבור השתלת העובר. בנשים שאינן בהריון של גיל הרבייה, שכבת רירית הרחם היא לשפוך חודשי בתחילת מחזור המחזור. Myometrium מסייע בתהליך זה לשפוך על ידי שמירה על התכווצויות myomeמשפטו ספונטנית הדרושים לניקוי רקמת רירית הרחם נמק מהרחם¹.

למרבה הצער, הגדילה הגוברת של משפט העצמי עלולה לגרום לתופעות לוואי שליליות כגון דינוריאה, או כאבי וסת כואבים. הדבר נראה במיוחד אצל נשים צעירות וביטול נשים מפרנות². עם זאת, הדברת שונה עבור כל אישה תלוי בחוזק של הצירים myometrial שלהם; התכווצויות חזק יותר משויכים לעתים קרובות עם התחושה של התכווצויות חמורות³. שימוש באולטרסאונד של הרחם יכול להיות מזוהה בדרך כלל כגלים של רירית הרחם. שחרור משופר של פרוסטגלנדינים במהלך הווסת⁴ ברחם שעברו sl, רירית הרחם הוא האמין לתרום להגדלת מבחן היתר משפט, וכתוצאה מכך איסכמיה ו היפוקסיה של שריר הרחם וכך גדל . כאב³

חוסר מעשה חמור יכול לעכב את הפעילות היום יומית של נשים מסוימות ו 3 כדי 33% של נשים יש כאב חמור מאוד, אשר יכול לגרום לאישה להיות מרותק למיטה עבור 1 עד 3 ימים כל מחזור הווסת⁵. דימננוריאה היא הגורם המוביל לתחלואה גינקולוגית בנשים בגיל הרבייה, ללא קשר לגיל, ללאום ולמעמד הכלכלי⁵. השכיחות המשוערת של חוסר הדברת הוא גבוה ומשתנה, החל מ 45% עד 93% אצל נשים בגיל הרבייה⁵.  דימננוריאה-כאבים משויכים יש השפעה על חיי היומיום של נשים עלול לגרום לביצועים אקדמיים עניים אצל מתבגרים, איכות נמוכה יותר של שינה, הגבלה של פעילויות יומיומיות, ואת מצב הרוח משתנה⁵.

הרבה נשים שחווים האתר מהווה מקום לטיפול בתרופות מנוגדות לדלפק כדי להקל על כאבם. תרופות כאלה מעל לדלפק מכילות מעכבי ציקלוחמצן (קוקס) אשר מונעים היווצרות של פרוסטגלנדינים⁶. עם זאת, מעכבי קוקס קשורים לאירועים וכלי דם לוואי, ועל כ -18% מהנשים עם הדידון אינם מגיבים למעכבי האלה⁷. לכן, יש צורך בתרופות חדשות כדי להפחית את התכווצויות הווסת. כיוון שמעל הרחם תורם לפתוגנזה של הדינוריאה, אסטרטגיה אפשרית אחת יכולה להיות השימוש בהרפיית הרחם.

מועיל לכמת את ההשפעות של תרופות מרפה פוטנציאלי במודל של באופן טבעי המתרחשים הצירים myometrial שפט ספונטנית כמו גל. עם זאת, עד כה, לא יעיל vivo שיטה לשעבר לבדיקת תרופות מרגיעות שרירים ברחם שלמים תוארה. כיום, מדידות מתח איזומטרי משמשות כדי להעריך את ההשפעות של תרופות להרפדלות. במהלך מדידות כאלה, רצועת שריר הרחם נשמרת באורך קבוע תחת מראש באמבט רקמה בעוד הכוח של התכווצויות שריר הרחם נרשם לפני ואחרי גירוי אוקסיטוצין בנוכחות או העדר של סם מרפה. למרות שגישה זו מועילה מאוד, היא דורשת ציוד יקר. יתר על כן, התכווצויות איזומטרי לא דומה הצירים הספונטאני הספונטנית כמו גל שמתרחשים באופן טבעי ברחם שלם. באופן ייחודי, גלי הרחם myometrial שפט במכרסמים יכול להיות מדומה כמו קרן הרחם לתנועתיות כאשר מערכת הרבייה כולה (שחלות, ההטלה, הרחם, והנרתיק) נשמרת בפתרון מאגר. כאן, אנו מציגים שיטה vivo ex לניטור התנועתיות הספונטנית של רחם העכבר ללא שינוי הממוקם בצלחת פטרי המכילה מאגר קרבס מחמצן. כמו כן, אנו מתארים אלגוריתם כימות תנועתיות ניצול מעקב MATLAB תנועה. גישה זו מספקת חלופה קלה וזולה פחות לבדיקת הפוטנציאל ההרפייתי של תרופות ותרכובות סינתטיות טבעיות.

Protocol

כל ההליכים עם בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת אינדיאנה (אינדיאנפוליס, IN). 2-5 חודשים-129S-C57BL/6 עכברים בוגרים מינית שימשו במחקר.

זהירות: להבטיח בטיחות על ידי לבישת חלוק מעבדה, מסכה, וכפפות כאשר עובדים עם בעלי חיים וחומרים ביו-מסוכנים.

1. הכנה לפתרון

1. הכינו את מאגר Krebs, אשר מכיל: 130 מ"מ היאl, 5 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl₂, 1.2 mm נה₂PO₄, 0.56 mm Mgcl₂, 25 מ"מ נחקו₃, ו 5 מ"מ גלוקוז, pH 7.4. ברציפות חמצן מאגר Krebs עם תערובת של גזים דחוסים המכילים 5% CO₂ ו 95% O₂ תוך שמירה על טמפרטורת החוצץ ב 37 ° צ' באמצעות אמבטיה מים במחזור.
2. הכנת מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS), אשר מכיל: 2.68 Mm kcl, 1.47 mm KH₂PO₄, 136.89 mm הנאקל, ו 8.1 mM Na₂hpo₄, pH 7.4.

2. הכנה לבעלי חיים

1. שאיפת עכברים (3%) עם ניקוי הגז בפסולת. להבטיח הרדמה נאותה על ידי הערכת רפלקסים נסיגה. לצבוט את הבוהן האחורי כדי לאשר שום תנועות לא מעורר, המציין אובדן תגובות רפלקס. לאחר שההרדמה העמוקה מושגת, המתת את החיה על ידי עריפת ראשו.
   הערה: איזואופלוראן עלול לגרום. להתרחבות שרירים חלקה לכן, הכנת מערכת הרבייה צריך להיות שטף בהרחבה מודבטים במאגר Krebs לפחות 15-30 דקות לפני תחילת ניסויים vivo ex. איזואופלוראן עלול לגרום לגירוי ואי נוחות כאשר הוא במגע עם העור, לכן המשיכו בזהירות.
2. מניחים את הגוף על סירת שקילה גדולה מרופדת במגבת נייר.
   הערה: אנשי המעבדה לנשים בהריון לא צריך להיות מעורב בניסויים עם isofלאנה כי זה יכול להקטין את משקל העובר, להקטין את להתקשות השלד העוברי, ולהגדיל את הסיכון של הפלה ספונטנית^{8, 9}. שאיפת CO₂ ניתן להשתמש כתחליף עכברים המתת חסד.

3. קביעת שלב המחזור האסטתי

1. עם מלקחיים קטנים, להרים את הדגדגן כדי לקבל גישה ostium הנרתיק לאט להוסיף טיפ מיקרופיפטה המכיל 10 μL של DPBS לתוך הנרתיק.
   1. ודא שתיאור המיקרופיפטה מוכנס דרך האוסטינום בזווית של 10-30 °, כדי להימנע מלחדור את קיר הנרתיק. הנוזל עדיין צריך להיות גלוי בטיפ לאחר הכניסה. אם הנוזל אינו נראה לעין, הטיפ הוכנס רחוק מדי לתוך הנרתיק, והאזור הפאראפראני של הנרתיק עשוי להיות מחורר.
   2. משוך בקלילות על השרירים הוואסטסיים הנרתיק עם קצה המיקרופיפטה כדי לאפשר לאוויר לצאת מהנרתיק.
2. לאט לשטוף את חלל הנרתיק על ידי ליטוף למעלה ולמטה 2-3 פעמים עם 10 μL של DPBS ולמקם את ההשעיה התא צייר על שקופית זכוכית.
3. השתמש במיקרוסקופ בניגוד לשלב ההפוך כדי לקבוע את שלב המחזור האסטרולוגי באמצעות ניתוח ציטוג'יק. ההליך מתבצע כמתואר במקום אחר^10,11. ודא שההשעיה של התא אינה יבשה לפני שניתן לבצע ניתוח ציטולוגי. ההשעיה עשויה להיות מדולל עם DPBS טרי, במידת הצורך.

4. העכבר בדרכי הרבייה ניתוח

1. לסדר את העכבר במצב פרקדן ולפזר את הגפיים שלו כדי לחשוף את האזור הבטן האטימות.
2. רסס עם 70% אתנול כדי להרטיב ולחטא את אזור הבטן האופטית.
3. באמצעות מלקחיים, להרים בזהירות את העור ממוקם מעולה לדגדגן. הפוך חתכים רוחבי קטנים על ההיבטים הצדדיים של אזור הבטן התחתונה, עד לגפיים העליונות כדי לחשוף את הצפק (איור 1א). במהלך תהליך זה, יופיע כנף חיצוני. כמו חתכים קטנים נעשים ללא הרף, הכנף יגדל בגודל.
4. חותכים בזהירות דרך צפק לחשוף את מערכת העיכול (איור 1B). חשוב לציין כי הקרניים הרחם ניתן לעתים קרובות להיות ממוקם ישירות מתחת צפק, כך לעשות חתכים בזהירות לא לגעת קרניים כמו זה יכול להשפיע על תנועתיות הרחם.
5. באמצעות מלקחיים, להסיר את fascia ואת רקמת השומן המכסה את מערכת העיכול. להסיר את הקטעים הבאים בדרכי העיכול מן חלל הבטן: התריסריון, jejunum, ileum, cecum, בסדר עולה ורוחבי המעי הגס (איור 1ג).
6. כדי לאתר את איברי הרבייה, תחילה לזהות את שלפוחית השתן (איור 1C, "4"), אשר עשוי להיות מראה מנוכה בשל הבוצמה לאחר המתת חסד. . הנרתיק יהיה ממש מתחת לשלפוחית השתן
7. אתר את סימטרי הערווה במפגש של עצמות הערווה (הרטבה אל שלפוחית השתן).
8. באמצעות מספריים, להסיר את סימטרי הערווה על ידי בזהירות לעשות חתכים על הצדדים לרוחב שלה דרך רקמת העור הבין הערווה כדי לקבל גישה ולספק מסלול להפקת וגינה (איור 1ד).
9. חותכים את הנקבים הנמצאים בין פי הטבעת לחלק התחתון של הפות.
10. באמצעות מלקחיים, להרים את הנרתיק ולאט לאט בבלו את הרקטום.
11. זיהוי שתי קרניים של רחם שיתקרנה לתוך מזלג, rostrally אל הנרתיק. אתרו צינור ההטלה מפותל ושחלה בסוף כל קרן, אשר עשוי להיות חבוי תחת מקטעי דרכי העיכול הנותרים. השתמש במספריים לניתוח קטן כדי להסיר את כל הרצועות המחברות ותומכות בקרניים, בהטלה ובשחלות בתוך חלל הבטן.
12. הסירו את מערכת הרבייה, הכוללת את הנרתיק, הרחם, ההטלה והשחלות, מחלל הבטן.
13. להעביר את מערכת הרבייה מבודדת (איור 1E) לתוך צלחת פטרי 100 Mm מלא 10 מ ל של dpbs. לא לדחוס את קרני הרחם כדי למנוע נזק myometrium.
14. השתמש מלקחיים ומספריים כירורגיים כדי להסיר כל החיבור והאדיפוז מסביב קרני הרחם והנרתיק, כמו גם כל פרווה באזור הערווה שיכול לעכב את איכות התמונה. הסר את הרצועה הרחבה כדי לאפשר תנועתיות של קרני הרחם.
15. לשטוף את מערכת הרבייה מבודדת עם DPBS טרי פעמיים ולהעביר אותו לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ מלא 3 מ ל של פתרון קרבס מחמצן.

5. רקמת הדמיה

1. מניחים את צלחת פטרי המכילה את מערכת הרבייה במאגר קרבס מחמצן על משטח שחור. שמרו על המנה בטמפרטורת החדר.
   הערה: ניתן להשתמש במשטח מחמם אינפרא אדום כדי לשמור על הרקמה ב 37 ° c.
2. אפשר 15-30 מינימום עבור התכווצויות ספונטניות להתחיל. הקלטת תנועתיות רחם ספונטנית במשך 10 דקות ממישור צירית באמצעות כל סוג של ציוד וידאו דיגיטלי.
3. העברת ההכנה לצלחת פטרי המכילה את מאגר קרבס החמצון בתוספת מתחם ניסוי. הקלטת תנועתיות רחם ספונטנית במשך כ -10 דקות ממישור צירית באמצעות כל סוג של ציוד וידאו דיגיטלי.
4. רוחצים את כל מערכת הרבייה בצלחת פטרי 100 מ"מ עם 10 מ ל של DPBS כדי להעריך את התהודה של הטיפול.
5. העבר את ההכנה לצלחת פטרי עם מאגר קרבס טרי. הקלטת תנועתיות רחם ספונטנית במשך כ -10 דקות ממישור צירית באמצעות כל סוג של ציוד וידאו דיגיטלי.
6. להעביר את ההכנה 35 מילימטר אחר צלחת פטרי מלא מאגר קרבס מחמצן בתוספת עם הרכב למתחם הבדיקה כדי להבטיח כי אין שינויים מכנית המושרה בתנועתיות הרחם הספונטנית. . זה שליטה חשובה
7. העבר את סרטון הווידאו לכונן קשיח של מחשב.

6. ניתוח נתונים

1. ליצור קליפים באמצעות כל תוכנה לעריכת וידאו מתוך קטעי וידאו המקורי המכיל את השליטה, טיפול, ולשטוף פרקים.
2. השתמש בתוכנת MATLAB ובקובץ ה-script שסופק (ראה מקוון חומר משלים) כדי לכמת תנועתיות רחם ספונטנית.
   הערה: ההרחבה של ארגז הכלים לראיית מחשב עבור MATLAB חייבת להיות מותקנת כדי שקובץ ה-script יהיה פונקציונלי לחלוטין.
   1. פתח את קובץ ה-script MATLAB, עבור אל הכרטיסיה עורך ולחץ על הפעל.
   2. בחרו בקובץ הווידאו הראשון ולחצו על ' פתח'.
   3. הזינו תווית לקובץ הווידאו בתיבת הדו הנפתחת ולחצו על הלחצן ' אשר'.
   4. הזן את מרווחי הזמן הדרושים לחישוב קצב תנועת הקרן (מרחק Δ אוקלידית/Δs).
   5. השתמש בסמן העכבר כדי לבחור שתי נקודות על המסגרת הראשונה של הווידאו. חלון מוקפץ יבקש לאשר שהנקודות הנבחרות ישמשו למעקב. לחץ על התחל כדי ליזום את תהליך מעקב הזמן האמיתי שיוצג בחלון המוקפץ. לחלופין, לחץ על בחירה חוזרת של נקודות כדי לבחור משוב את שתי הנקודות.
   6. נטר את הדיוק של תהליך המעקב בחלון המוקפץ.
   7. שים לב לעומת פיזור הזמן של התוויה ומרחק לעומת פיזור זמן בחלון מוקפץ חדש. שמור את שתי הדמויות על ידי בחירת קובץ | שמירה בשם באותו חלון כדי לתעד את הנתונים.
   8. חפש תיקיה בשם ' הפוינטארירנתונים', שנוצרה באופן אוטומטי על-ידי MATLAB, באותה ספריה שבה ממוקם קובץ ה-SCRIPT של MATLAB. זהה קובץ Excel בשם label_Data המכיל נקודות נתונים שנאספו מהווידאו בשתי כרטיסיות גליון עבודה נפרדות.
      הערה: ניתן להשתמש בכל תוכנת מעקב אחר תנועה חלופית לכמת תנועתיות רחם ספונטנית.
3. השתמש בתוכנה מתאימה (לדוגמה, Excel או SigmaPlot 13) כדי לבצע את הניתוח הסטטיסטי.

תוצאות

איור 1 מראה תמונות מייצגות שצולמו במהלך הליכי הבידוד של דרכי הרבייה המתוארים בפרוטוקול זה. כדי להימנע מזיהום מאגר עם פרווה, אשר יקטין את איכות הווידאו, הלחלח את גוף העכבר עם 70% אתנול. בחינת הסדר העיקרית עבור סעיף הניתוח של הפרוטוקול היא למצוא את שלפוחית השתן. הרחם והנרתיק יה?...

Discussion

כאן, תיארנו שיטה להערכת כמובן ספונטני של כל מערכת הרבייה המכרסמים, הכוללת את השחלות, ההטלה, קרניים הרחם והנרתיק. השתמשנו בשיטה דומה כדי להדגים את השפעת ההרפטית של הphenylephrine על תנועתיות הרחם הספונטנית¹³, עם זאת, בעבר לא יכולנו לספק ניתוח כמותי של הנתונים. בעבודה זו, פיתחנו אלגורית?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642
Dulbecco's PBS	Fisher Sceintific	17-512Q
Ethanol 200 PROOF	Decon Laboratories	2701
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
MgCl2  · 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	07-893-2374
Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps	Fisher Sceintific	13-812-42
Curved Hardened Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissection High-performance Modular Stereomicroscope	Leica	MZ6
Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system	Leica	DFC425 C
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources	Fisher Sceintific	12-562-21
Weigh Boat	Fisher Sceintific	WB30304
Convertors Astound Standard Surgical Gown	Cardinal Health	9515	Small, Medium or Large
Gloves	McKesson Corporation	20-1080	Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves
Petri Dish	Corning Falcon	351029	100 mm
Petri Dish	Corning Falcon	353001	35 mm
95% O2- 5% CO2 gas mixture	Praxair	MM OXCD5-K
Ear-loop Masks	Valumax International	5430E-PP
DSLR 24.2 MP Camera	Canon	EOS Rebel T6i
MATLAB	MathWorks	N/A	version 2019 or later