Metodo Ex Vivo per valutare la motilità spontanea del tratto riproduttivo del mouse e un algoritmo di tracciamento del movimento uterico basato su MATLAB per l'analisi dei dati

Riepilogo

Le contrazioni uterine sono importanti per il benessere delle femmine. Tuttavia, la contrattilità patologicamente aumentata può provocare dismenorrea, specialmente nelle femmine più giovani. Qui, descriviamo una semplice preparazione ex vivo che consente una rapida valutazione dell'efficacia dei rilassanti muscolari lisci che possono essere utilizzati per il trattamento della dismenorrea.

Abstract

La dismenorrea, o crampi dolorosi, è il sintomo più comune associato alle mestruazioni nelle femmine e la sua gravità può ostacolare la vita quotidiana delle donne. Qui, presentiamo un metodo facile ed economico che sarebbe strumentale per testare nuovi farmaci che riducono la contrattilità uterina. Questo metodo utilizza la capacità unica dell'intero tratto riproduttivo del mouse di mostrare motilità spontanea se mantenuto ex vivo in una parabola Petri contenente buffer Krebs ossigenato. Questa motilità spontanea assomiglia all'attività miometria simile all'onda dell'utero umano, indicato come onde endometriali. Per dimostrare l'efficacia del metodo, abbiamo impiegato un noto farmaco rilassante uterino, epinefrina. Dimostriamo che la motilità spontanea dell'intero tratto riproduttivo del topo può essere inibita rapidamente e reversibilmente da 1 epinefrina in questo modello di piatto Petri. Documentare i cambiamenti di motilità uterina può essere facilmente fatto utilizzando un normale smartphone o una sofisticata fotocamera digitale. Abbiamo sviluppato un algoritmo basato su MATLAB che consente al tracciamento del movimento di quantificare i cambiamenti spontanei di motilità uterina misurando la velocità dei movimenti del corno uterino. Uno dei principali vantaggi di questo approccio ex vivo è che il tratto riproduttivo rimane intatto per tutto l'esperimento, preservando tutte le interazioni cellulari intrinseche intrauterine. La limitazione principale di questo approccio è che fino al 10-20% degli uteri non può presentare motilità spontanea. Finora, questo è il primo metodo quantitativo ex vivo per valutare la motilità uterina spontanea in un modello di piatto Petri.

Introduzione

Come un importante organo femminile, l'utero è cruciale per la riproduzione ed essenziale per il nutrimento del feto¹. L'utero è costituito da tre strati: il perimetrio, miometrio ed endometrio. Il miometrio è il principale strato contrattuale dell'utero e svolge un ruolo chiave nella consegna del feto. L'endometrio è lo strato più interno che riveste la cavità uterina ed è essenziale per l'impianto dell'embrione. Nelle femmine non incinte in età riproduttiva, lo strato endometriale viene versato mensilmente all'inizio del ciclo mestruale. Il miometrio aiuta in questo processo di spargimento mantenendo le contrazioni miometriche spontanee necessarie per eliminare il tessuto endometriale necrotico dall'utero¹.

Purtroppo, aumento della contrattilità miometriale può provocare effetti collaterali negativi come dismenorrea, o crampi mestruali dolorosi. Questo è particolarmente visto nelle giovani femmine e nelle donne nullime². Tuttavia, la dismenorrea è diversa per ogni donna e dipende dalla forza delle loro contrazioni miometriche; contrazioni più forti sono spesso associate alla sensazione di gravi crampi³. La contrattilità miometriale può essere visualizzata utilizzando ultrasuoni uterini ed è spesso riconosciuta come onde endometriali. Maggiore rilascio di prostaglandine durante le mestruazioni⁴ in un utero sottoposto a sloughing endometriale è creduto per contribuire ad aumento dell'ipercontrattualità miometria, conseguente ischemia e ipossia del muscolo uterino e quindi aumentato dolore³.

Grave dismenorrea può ostacolare l'attività quotidiana di alcune donne e 3 a 33% delle donne hanno dolore molto grave, che potrebbe causare una donna a letto per 1 a 3 giorni ogni ciclo mestruale⁵. La dismenorrea è la principale causa di morbilità ginecologica nelle donne in età riproduttiva indipendentemente dall'età, dalla nazionalità e dallo status economico⁵. La prevalenza stimata di dismenorrea è alta e variabile, che va dal 45% al 93% nelle donne di età riproduttiva⁵.  Il dolore associato alla dismenorrea ha un effetto sulla vita quotidiana delle donne e può provocare scarse prestazioni accademiche negli adolescenti, minore qualità del sonno, restrizione delle attività quotidiane e cambiamenti di umore⁵.

Molte donne che sperimentano grave dismenorrea ricorrono a farmaci da banco per alleviare il loro dolore. Tali farmaci da banco contengono inibitori cicloossigenasi (COX) che impediscono la formazione di prostaglandine^{6 .} Tuttavia, gli inibitori di COX sono associati a eventi cardiovascolari avversi e circa il 18% delle donne con dismenorrea non risponde a questi inibitori⁷. Pertanto, vi è la necessità di nuovi farmaci per ridurre i crampi mestruali. Poiché oltre la contrattilità dell'utero contribuisce alla patogenesi della dismenorrea, una possibile strategia può essere l'uso di rilassanti uterini.

È utile quantificare gli effetti di potenziali farmaci rilassanti in un modello di contrazioni miometriche miometriche naturali. Tuttavia, finora, non è stato descritto alcun metodo ex vivo efficiente per testare farmaci che rilassano i muscoli nell'utero intatto. Attualmente, le misurazioni della tensione isometrica vengono utilizzate per valutare gli effetti del farmaco rilassante. Durante tali misurazioni, una striscia muscolare uterina viene mantenuta ad una lunghezza costante sotto precarico in un bagno di tessuto mentre la forza delle contrazioni muscolari uterine viene registrata prima e dopo la stimolazione dell'ossitocina in presenza o assenza di un farmaco rilassante. Anche se questo approccio è molto utile, richiede attrezzature costose. Inoltre, le contrazioni isometriche non assomigliano alle contrazioni spontanee simili all'onda del miometrio che si verificano naturalmente nell'utero intatto. In modo univoco, le onde della miometria uterina nei roditori possono essere visualizzate come motilità del corno uterino quando l'intero tratto riproduttivo (ovaie, ovidotti, utero e vagina) viene mantenuto in una soluzione cuscinetto. Qui, presentiamo un metodo ex vivo per monitorare la motilità spontanea dell'utero murino intatto posto in una piastra Petri contenente buffer Krebs ossigenato. Descriviamo anche un algoritmo di quantificazione della motilità che utilizza il motion tracker MATLAB. Questo nuovo approccio fornisce un'alternativa semplice e meno costosa per testare il potenziale rilassante dei rimedi naturali e dei composti sintetici.

Protocollo

Tutte le procedure con animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso la Indiana University School of Medicine (Indianapolis, IN). 2-5 mesi-vecchio F2-129S-C57BL/6 topi femminili sessualmente maturi sono stati utilizzati nello studio.

ATTENZIONE: Garantisci la sicurezza indossando un camice da laboratorio, una maschera e dei guanti quando lavori con animali e materiali biopericolosi.

1. Preparazione della soluzione

1. Preparare il Tamibe Buffer, che contiene: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1,2 mM NaH₂PO₄, 0,56 mM MgCl₂, 25 mM NaHCO₃e 5 mM di glucosio, pH 7.4. Ossigenare continuamente il tamponi Krebs con una miscela di gas compressi contenenti il 5% di CO₂ e 95% O₂ mantenendo la temperatura tampone a 37 gradi utilizzando un bagno d'acqua circolante.
2. Preparare la Salina (DPBS) di Dulbecco, che contiene: 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH₂PO₄, 136,89 mM NaCl e 8,1 mM Na₂HPO₄, pH 7.4.

2. Preparazione degli animali

1. Topi anestesi con inalazione di isoflurane (3%) con lo scavenging del gas di scarico. Garantire un'adeguata anestesia valutando i riflessi di ritiro. Pizzicare la punta posteriore per affermare che non vengono suscitati movimenti, indicando la perdita di risposte riflesse. Dopo aver raggiunto l'anestesia profonda, eutanasia l'animale per decapitazione.
   NOT: Isoflurane può causare dilatazione muscolare liscia. Pertanto, la preparazione del tratto riproduttivo deve essere lavata e incubata in modo estensico nel tampone Krebs per almeno 15-30 min prima di iniziare gli esperimenti ex vivo. Isoflurane può causare irritazione e disagio quando è a contatto con la pelle, quindi procedere con cautela.
2. Posizionare il corpo su una grande barca di pesatura rivestita con un asciugamano di carta.
   NOT: Il personale di laboratorio femminile incinta non dovrebbe essere coinvolto in esperimenti con l'isoflurane perché può diminuire il peso fetale, diminuire l'ossificazione scheletrica fetale e aumentare il rischio di aborto spontaneo^8,9. L'inalazione di CO₂ può essere utilizzata come sostituto dei topi eutanasia.

3. Determinazione della fase del ciclo Estrous

1. Con piccole pinze, sollevare il clitoride per ottenere l'accesso all'ostio vaginale e inserire lentamente una punta di micropipette contenente 10 .L di DPBS nella vagina.
   1. Assicurarsi che la punta della micropipetta sia inserita attraverso l'ostio con un angolo di 10 - 30 per evitare di perforare la parete vaginale. Il liquido dovrebbe essere ancora visibile nella punta dopo l'inserimento. Se il liquido non è visibile, la punta è stata inserita troppo lontano nella vagina e l'area paracervica della vagina potrebbe essere stata perforata.
   2. Tirare leggermente verso il basso i muscoli vaginali ostium con la punta della micropipetta per consentire all'aria di uscire dalla vagina.
2. Sciacquare lentamente la cavità vaginale pipeting su e giù 2-3 volte con 10 -L di DPBS e posizionare la sospensione della cella disegnata su uno scivolo di vetro.
3. Utilizzare un microscopio a contrasto di fase invertito per determinare la fase del ciclo estribuisco attraverso l'analisi citologica. La procedura viene eseguita come descritto altrove^10,11. Assicurarsi che la sospensione cellulare non si asciughi prima di poter eseguire l'analisi citologica. La sospensione può essere diluita con DPBS fresco, se necessario.

4. Tratto riproduttivo del mouse Ddissection

1. Disporre il topo in posizione supina e diffondere le sue estremità per esporre la regione abdominopelvic.
2. Spruzzare con 70% etanolo per inumidire e disinfettare l'area abdominopelvic.
3. Utilizzando pinze, sollevare con attenzione la pelle situata superiore al clitoride. Fare piccole incisioni trasversali sugli aspetti laterali dell'area addominale inferiore, fino agli arti superiori per esporre il peritoneo (Figura 1A). Durante questo processo, si formerà un lembo esterno. Come piccole incisioni sono continuamente fatte, il lembo aumenterà di dimensioni.
4. Tagliare con attenzione il peritoneo per esporre il tratto gastrointestinale (Figura 1B). È importante notare che le corna uterine possono spesso essere localizzate direttamente sotto il peritoneo, quindi fai incisioni con cautela e non toccare le corna in quanto ciò può influenzare la motilità uterina.
5. Utilizzando le pinze, rimuovere la fascia e il tessuto adiposo che copre il tratto gastrointestinale. Rimuovere i seguenti segmenti del tratto gastrointestinale dalla cavità addominale: il duodenum, il jejunum, ileum, il cecum, il colon ascendente e trasversale (Figura 1C).
6. Per individuare gli organi riproduttivi, identificare prima la vescica urinaria (Figura 1C, "4"), che può avere un aspetto sgonfio a causa dell'annullamento dopo l'eutanasia. La vagina sarà proprio sotto la vescica urinaria.
7. Individuare la simfisi pubica alla confluenza delle ossa pubiche (caudally alla vescica).
8. Utilizzando le forbici, rimuovere la simfisi pubica facendo con attenzione incisioni sui suoi lati laterali attraverso il tessuto fibrocartilaginoso interpubico per ottenere l'accesso e fornire un percorso per l'estrazione della vagina (Figura 1D).
9. Tagliare il perineo situato tra l'ano e la parte inferiore della vulva.
10. Usando le pinze, sollevare la vagina e lentamente eccitare il retto.
11. Identificare due corna uterine che biforcano in una forchetta, sontrando verso la vagina. Individuare un ovidotto contorto e ovaio alla fine di ogni corno, che può essere nascosto sotto i restanti segmenti del tratto gastrointestinale. Utilizzare piccole forbici di sedgente per rimuovere eventuali legamenti che si collegano e sostengono le corna, gli ovidotti e le ovaie all'interno della cavità addominale.
12. Rimuovere il tratto riproduttivo, che include la vagina, l'utero, gli ovidotti e le ovaie, dalla cavità addominale.
13. Trasferire il tratto riproduttivo isolato (Figura 1E) in un piatto Petri da 100 mm riempito con 10 mL di DPBS. Non comprimere le corna uterine per evitare di danneggiare il miometrio.
14. Utilizzare pinze e forbici chirurgiche per rimuovere qualsiasi tessuto connettivo e adiposo che circonda le corna uterine e la vagina, nonché qualsiasi pelliccia nella regione pubica che potrebbe ostacolare la qualità dell'immagine. Rimuovere l'ampio legamento per consentire la motilità delle corna uterine.
15. Lavare due volte il tratto riproduttivo isolato con il DPBS fresco e trasferirlo in un piatto Petri da 35 mm riempito con 3 mL di soluzione Krebs ossigenati.

5. Imaging dei tessuti

1. Posizionare la parabola Petri contenente il tratto riproduttivo nel tampone Krebs ossigenato su una superficie nera. Mantenere il piatto a temperatura ambiente.
   NOT: È possibile utilizzare un pad di riscaldamento a infrarossi per mantenere il tessuto a 37 gradi centigradi.
2. Lasciare iniziare 15-30 min per le contrazioni spontanee. Registrare motilità uterina spontanea per 10 min da un aereo assiale utilizzando qualsiasi tipo di apparecchiatura video digitale.
3. Trasferire la preparazione in una piastra Petri contenente il tampone Krebs ossigenato integrato con un composto di prova. Registrare motilità uterina spontanea per circa 10 min da un aereo assiale utilizzando qualsiasi tipo di apparecchiatura video digitale.
4. Lavare l'intero tratto riproduttivo in una piastra Petri da 100 mm con 10 mL di DPBS per valutare la reversibilità del trattamento.
5. Trasferire la preparazione in una piastra Petri con il tamponi Krebs appena ossigenato. Registrare motilità uterina spontanea per circa 10 min da un aereo assiale utilizzando qualsiasi tipo di apparecchiatura video digitale.
6. Trasferire la preparazione in un'altra parabola Petri da 35 mm ripiena di tampone Krebs ossigenato integrato con il veicolo per il composto di prova per garantire che non ci siano cambiamenti indotti meccanicamente nella motilità uterina spontanea. Questo è un controllo importante.
7. Trasferire il filmato video su un disco rigido del computer.

6. Analisi dei dati

1. Crea clip utilizzando qualsiasi software di editing video dal filmato video originale contenente il controllo, il trattamento e gli episodi di lavaggio.
2. Utilizzare il software MATLAB e lo script fornito (vedi materiale supplementare online) per quantificare la motilità uterina spontanea.
   NOT: Per ottenere il funzionamento dello script, è necessario che sia installato il componente aggiuntivo Computer Vision Toolbox per MATLAB.
   1. Aprire lo script MATLAB, passare alla scheda Editor e fare clic su Esegui.
   2. Selezionare il primo file video e fare clic su Apri.
   3. Immettere un'etichetta per il file video nella finestra di dialogo a comparsa e fare clic su OK.
   4. Immettere l'intervallo di tempo necessario per calcolare la velocità di movimento del corno (distanza euclidea/z).
   5. Utilizzare il cursore del mouse per selezionare due punti sul primo fotogramma del video. Una finestra pop-up chiederà di confermare che i punti selezionati devono essere utilizzati per il monitoraggio. Fare clic su Avvia per avviare il processo di monitoraggio in tempo reale che verrà visualizzato nella finestra popup. In alternativa, fate clic su Riseleziona punti per riselezionare i due punti.
   6. Monitorare l'accuratezza del processo di tracciamento nella finestra pop-up.
   7. Osservare un grafico a dispersione temporale e a velocità rispetto a un grafico a dispersione temporale in una nuova finestra popup. Salvare le due figure selezionando File Salva con nome nella stessa finestra per documentare i dati.
   8. Trovare una cartella denominata PointTrackerData, creata automaticamente da MATLAB, nella stessa directory in cui si trova lo script MATLAB. Identificare un file di Excel denominato label_Data contenente i punti dati raccolti dal video in due schede separate del foglio di lavoro.
      NOTA: Qualsiasi software di tracciamento del movimento alternativo può essere utilizzato per quantificare la motilità spontanea dell'utero.
3. Utilizzare un software appropriato (ad esempio, Excel o SigmaPlot 13) per eseguire l'analisi statistica.

Risultati

La figura 1 mostra le immagini rappresentative scattate durante l'intera procedura di isolamento del tratto riproduttivo descritta in questo protocollo. Per evitare di contaminare il buffer con la pelliccia, che diminuirebbe la qualità video, abbiamo inumidito il corpo del topo con il 70% di etanolo. Il principale punto di riferimento per la sezione di dissezione del protocollo è quello di trovare la vescica urinaria. L'utero e la vagina saranno situati inferiori alla vescica urinaria.

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Discussione

Qui, abbiamo descritto un metodo per valutare la contrattilità spontanea dell'intero tratto riproduttivo del roditore, che include le ovaie, gli ovidotti, le corna uterine e la vagina. Abbiamo usato un metodo simile per dimostrare l'effetto rilassante della fenilofina sulla motilità uterina spontanea¹³, tuttavia in passato non siamo stati in grado di fornire un'analisi quantitativa dei dati. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un algoritmo per l'analisi quantitativa dei dati di motilità utiliz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Epinephrine hydrochloride	Sigma-Aldrich	E4642
Dulbecco's PBS	Fisher Sceintific	17-512Q
Ethanol 200 PROOF	Decon Laboratories	2701
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
MgCl2  · 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	07-893-2374
Dissecting Extra-Fine-Pointed Precision Splinter Forceps	Fisher Sceintific	13-812-42
Curved Hardened Fine Iris Scissors	Fine Science Tools	14091-09
Dissection High-performance Modular Stereomicroscope	Leica	MZ6
Digital 5 Megapixel Color Microscope Camera with active cooling system	Leica	DFC425 C
Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Sources	Fisher Sceintific	12-562-21
Weigh Boat	Fisher Sceintific	WB30304
Convertors Astound Standard Surgical Gown	Cardinal Health	9515	Small, Medium or Large
Gloves	McKesson Corporation	20-1080	Small, Medium, or Large; powder-free sterile latex or nitrile surgical gloves
Petri Dish	Corning Falcon	351029	100 mm
Petri Dish	Corning Falcon	353001	35 mm
95% O2- 5% CO2 gas mixture	Praxair	MM OXCD5-K
Ear-loop Masks	Valumax International	5430E-PP
DSLR 24.2 MP Camera	Canon	EOS Rebel T6i
MATLAB	MathWorks	N/A	version 2019 or later