细胞周期特异性测量βH2AX和细胞凋亡后热源毒性应力通过流细胞测定

摘要

该方法结合了DNA双链断裂（DSB）、细胞循环分布和凋亡的定量分析，实现了对DSB诱导和修复以及修复失败后果的细胞周期特定评估。

摘要

提出的方法或稍作修改的版本已经设计，以研究特定的治疗反应和副作用的各种抗癌治疗，用于临床肿瘤学。它能够定量和纵向分析基因毒性应激后DNA损伤反应，如放射治疗和多种抗癌药物引起的。该方法涵盖DNA损伤反应的所有阶段，为诱导和修复DNA双链断裂（DSBs）、细胞周期抑制和在修复失败时细胞凋亡导致细胞死亡提供终点。结合这些测量提供了有关细胞周期依赖治疗效果的信息，从而可以深入研究细胞增殖和应对DNA损伤的机制之间的相互作用。由于许多癌症治疗（包括化疗剂和电离辐射）的作用仅限于或根据特定的细胞周期阶段而产生强烈变化，相关分析依赖于一种可靠和可行的方法来评估治疗效果以细胞周期特定的方式在DNA上。单端点检测不可能实现这一点，而且该方法具有重要优势。该方法不局限于任何特定的细胞系，并已在众多肿瘤和正常组织细胞系中进行了彻底测试。除放射肿瘤学外，在肿瘤学的许多领域，包括环境危险因素评估、药物筛选和肿瘤细胞遗传不稳定性评价，可广泛应用。

引言

肿瘤学的目标是在不损害正常细胞的情况下杀死或使癌细胞灭活。许多疗法要么直接或间接地诱导癌细胞中的基因毒性应激，但也在正常细胞中有些延伸。化疗或靶向药物通常与放射治疗相结合，以提高辐照肿瘤1、2、3、4、5的放射敏感性，从而减少辐射剂量，以尽量减少正常的组织损伤。

电离辐射和其他基因毒性剂会诱发不同类型的DNA损伤，包括基体修饰、链交联和单股或双链断裂。脱氧核糖核酸双链断裂（DSBs）是最严重的DNA病变，其诱导是电离辐射和各种细胞静血药物在放射化疗中细胞杀灭作用的关键。DSB不仅会损害基因组的完整性，而且促进突变6、7的形成。因此，不同的DSB修复途径，以及消除不可修复的细胞（如凋亡）的机制在进化过程中已经形成。整个DNA损伤反应（DDR）由复杂的信号通路网络调节，从DNA损伤识别和细胞周期抑制到允许DNA修复，到程序化细胞死亡或失活的情况下修复失败8。

已开发流式细胞测定法，用于在一次涵盖 DSB 感应和修复的综合测定中，对基因毒性应力后的 DDR 进行调查，以及修复失败的后果。它结合广泛应用的DSB标记βH2AX的测量与细胞周期和凋亡诱导的分析相结合，使用经典的subG1分析和更具体的卡巴塞-3活化评估。

将这些端点组合在一个测定中不仅减少了时间、人工和成本支出，还实现了对DSB感应和修复以及caspase-3活化的细胞周期特定测量。这种分析不可能与独立进行的分析，但它们对于全面了解基因毒性压力后DNA损伤反应具有高度相关性。许多抗癌药物，如细胞静态化合物，针对分裂细胞，其效率在很大程度上取决于细胞周期阶段。不同DSB修复过程的可用性也取决于细胞周期阶段和路径选择，这对修复精度至关重要，进而决定细胞9、10、11的命运。 ¹².此外，对DSB水平的细胞周期特定测量比集中分析更准确，因为DSB水平不仅取决于基因毒性化合物或辐射的剂量，还取决于细胞的DNA含量。

该方法已用于比较不同放射疗法的疗效，以克服胶质细胞^瘤13的抗药性机制，并剖析电离辐射和骨肉瘤14、15中靶向药物的相互作用和非典型畸状类人横纹^癌16。此外，所述方法已被广泛用于分析无线电和化疗对介体干细胞17、18、19、20、21^{的副作用。} 22，23，24，这是修复治疗引起的正常组织损伤，并在再生医学中具有潜在的应用。

研究方案

1. 准备

1. 在任何类型的培养容器中制备 ±1 x 10⁵细胞/样品作为起始材料。
   1. 例如，在将U87胶质细胞细胞暴露于电离辐射后进行时间过程实验:在每个时间点以三联成的T25瓶中辐照亚汇U87细胞。选择早期时间点（辐照后 15 分钟至 8 小时），跟随 DSB 修复动力学（+H2AX 级别）和后期时间点（24 小时至 96 小时），以评估残留 DSB 水平、细胞周期效应和凋亡。
      注:该协议不限于辐照实验或任何特定的细胞系。它已被测试与各种类型，从不同的物种和各种治疗条件的众多细胞系。
2. 准备以下解决方案，包括 10% 的超额体积。
   1. 在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备由4.5%甲醛（PFA）组成的固定溶液样品，每样品2 mL。新鲜准备解决方案。将PBS中的PFA稀释至80°C，在烟机罩下缓慢搅拌。用铝箔盖住烧瓶，防止热损失。让溶液冷却到室温，并调整最终体积。通过折叠的纤维素过滤器，3hw（见材料表）。
      警告:PFA 烟雾是有毒的。在烟机罩下执行此步骤，并妥善处理 PFA 废物。
   2. 在-20°C储存的冰冷的H2 O.储存中，每样品制备3 mL，由70%乙醇组成。
   3. 在PBS中制备由0.5%牛血清白蛋白（BSA）组成的洗涤溶液样品每样本7 mL。
   4. 在PBS中制备100μL，每次样品3%BSA作为抗体稀释剂。
   5. 在PBS中制备100-250μL每个DNA染色溶液样本，由1微克/mL 4'，6-二酰胺-2-苯丙醇（DAPI）组成。
3. 将15 mL管的离心机设置为5分钟，200 x g和 7 °C。让离心机冷却，并将这些设置用于所有离心步骤。

2. 样品收集

1. 如果处理粘附细胞（例如，U87胶质细胞细胞生长在T25烧瓶与5 mLDulbeco的改性Eagle的介质补充10%胎儿牛血清在37°C和5%二氧化碳大气中），继续步骤2.1.1。和2.1.2。对于悬架单元，请直接转到步骤 2.1.2。
   1. 在离心管中收集介质。使用常规细胞培养方法分离细胞，其中可能包括使用胰蛋白酶、乙二胺四乙酸 （EDTA） 或其他细胞分离剂。
      1. 对于U87细胞，预热PBS和胰蛋白酶/EDTA（见材料表）至37°C，用1mL的PBS清洗细胞层，用1mL的胰蛋白酶/EDTA孵育细胞1-2分钟，并通过在烧瓶处敲击支持细胞分离。用介质收集管中的所有洗涤溶液和细胞悬架。
   2. 离心细胞，丢弃培养基，并在1mL的PBS中重新悬浮细胞。
2. 将细胞上下移入几次，以确保单个细胞悬浮液，并将细胞悬浮液转移到具有2 mL固定溶液（4.5%PFA/PBS，3%最终浓度）的管中。
   警告:PFA 烟雾是有毒的。在烟机罩下执行此步骤，并妥善处理 PFA 废物。
3. 在室温下孵育细胞10分钟。
4. 使细胞离心，通过去分物丢弃上清液。
5. 通过敲击管并重新悬浮在 3 mL 的 70% 乙醇中的细胞，松开细胞颗粒。直接执行下一步，或在 4°C 将样品储存数周。

3. 洗涤和染色

1. 使细胞离心，通过去分物丢弃上清液。
2. 通过敲击管来松开细胞颗粒。在3mL的洗涤溶液（0.5%BSA/PBS）中重新悬浮细胞，离心机并丢弃上清液。
3. 用 3 mL 重复洗涤步骤 1x，然后用 1 mL 洗涤溶液重复 1x。在最后一步中，通过移液小心地丢弃上清液。小心不要吸气颗粒。
4. 在100μL/样品中稀释抗体，以抗体稀释剂（3%BSA/PBS）对βH2AX、磷-组蛋白H3（Ser10）和卡帕斯-3（材料表）进行检测。
5. 通过敲击管并重新悬浮步骤 3.4 中制备的 100 μL 抗体溶液中的细胞，松开细胞颗粒。从此步骤开始，将样品保持在黑暗中。
6. 在室温下孵育样品1小时。
7. 使细胞离心，通过移液小心地丢弃上清液。小心不要吸气颗粒。
8. 通过敲击管并重新悬浮在 100-250 μL 的 DNA 染色溶液 （1 μg/mL DAPI/PBS） 中的细胞，松开细胞颗粒。
   1. 如果存在 1-2 x 10⁵个细胞，请使用 100 μL，并增加更高细胞数的体积（±1 x 10⁶细胞为 250 μL）。直接执行下一步，或在4°C的黑暗中储存样品长达2周。
      注:对于某些细胞类型，优化DAPI浓度有助于改善细胞周期阶段的分离。
9. 将样品通过网孔尺寸为 35 μm 的样品管的细胞滤帽进行移位。

4. 测量

1. 将样品放在冰上，启动根据表 1配置的光学设置的流式细胞计（参见材料表），然后按Prime按钮。如果需要，请单独打开紫外线激光器（355 nm 波长），并使用适当的软件将功率设置为 10 mW。
2. 打开获取软件（参见材料表），通过单击浏览器工具栏上的"新建实验"按钮登录并创建新的实验。
3. 使用"检查器"窗口自定义实验的名称，并选择"5 日志十年"进行绘图显示。
4. 单击浏览器工具栏中的"新建样本"按钮，然后通过单击左侧的"+"符号来展开新条目以显示第一个管。 选择相应的图标和类型以重命名标本（例如，细胞类型）和管（示例标识符）。单击第一个管的管指针（左侧的箭头状符号）将其变为绿色（活动）。
5. 在"细胞计"窗口中打开"参数"选项卡，然后根据表 1选择参数。删除所有不必要的参数。
   注:参数名称可能因自定义预设而异（例如，Cy3 而不是 Alexa555）。确保所选内容与表 1中的滤光片和探测器匹配。在此设置中，所有荧光光道是完全独立的，不需要补偿光谱重叠;但是，如果使用其他光学设置，则可能需要这样做。
6. 打开工作表窗口，并根据图 1创建绘图。使用相应的工具栏按钮绘制 2 个点图和 4 个直方图，然后单击轴标签以选择适当的参数（前散射 （FSC-A） 与侧散射 （SSC-A）、DAPI-W 与 DAPI-A 以及 DAPI-A 和每个抗体耦合的直方图荧光。
7. 将控制样本连接到细胞仪，然后按仪器上的"运行"按钮。在软件的"浏览器"窗口中选择第一个管，然后单击"获取数据"仪表板中的"获取数据"按钮。使用仪器上的"低、中"或"高"按钮和微调轮调整样品注入音量。优选在低设置下工作，但尝试获取至少 100 个事件/秒（请参阅获取仪表板）。
8. 使用图 1中的点图作为指南，在检查器窗口的"参数"选项卡中调整 FSC、SSC 和 DAPI 的探测器电压。如果像元填充在线性比例上显得过于分散，则切换到 FSC 和 SSC 参数的对数刻度。
9. 按细胞仪上的待机按钮，继续软件中的工作表设置。
   1. 使用多边形门工具定义 FSC-A 与 SSC-A 图中的单元格填充，使用矩形门工具定义 DAPI-W 图中的单Cells 填充与 DAPI-A 图中的单细胞填充。按Ctrl + G键显示总体层次结构，然后单击默认门名以重命名它们。
   2. 随后右键单击所有直方图并选择"显示人口群"上下文菜单中的单个单元格。
10. 通过随后获取控制和处理样品，优化抗体耦合荧光团的检测器电压，以覆盖整个动态范围。最大化信噪比，避免探测器饱和。确保单细胞总体中的 Alexa488 峰值在对照中或处理过的样本中均未被截断。
11. 按细胞仪上的待机按钮，在软件的工作表窗口中选择执行步骤 4.11.1-4.11.3，以获得样品采集期间治疗效果的粗略估计。
    1. 在总体层次结构中选择单个单元格，并使用矩形门工具定义 DAPI-W 与 DAPI-A 图中的 G1 总体。右键单击 Alexa488 直方图并选择"显示人口群"来自上下文菜单的 G1。
    2. 右键单击 Alexa488 直方图，然后从上下文菜单中选择"创建统计视图"。 右键单击"统计信息视图"并选择"编辑统计信息视图"。转到"统计信息"选项卡，并激活 G1 总体中 Alexa488 信号中位数的复选框（停用所有其他选项）。
    3. 选择总体层次结构中的单Cells，并使用间隔门工具定义 DAPI-A、Alexa555-A（图 1 中的 Cy3-A）中的子G1、M和Casp3+总体（图 1中的 Cy3-A）和Alexa647-A 直方图。
12. 按细胞仪上的"运行"按钮，并使用软件中的采集仪表板测量样品。将停止门设置为所有事件或Cells门（如果存在大量小粒子），并将记录的事件数设置为 10，000。
13. 单击"下一个管"以创建新示例，在"浏览器"窗口中重命名它，单击"获取数据"以开始采集并记录数据以开始录制。
14. 选择文件 |导出 |从菜单栏进行实验，并在对话框中选择目录导出以将数据另存为".fcs"文件。如果启用稍后时间点重新导入实验，可选择将实验另存为附加zip文件。
    注:使用"编辑" 可以轻松地重用现有实验的设置|复制没有数据。

5. 数据评估

1. 将".fcs"文件拖放到流式细胞分析软件的示例浏览器中（参见材料表）。应用如图 2所示的浇注策略。在继续下一个子门之前，请确保门适合所有样本中的相应总体。
   1. 要对所有样本应用更改，请在示例浏览器中选择已更改的门，按Ctrl + C复制它，选择父门，按Ctrl + Shift + E以选择所有样本中的等效节点，然后按Ctrl + V粘贴或覆盖大门。请勿使用组门。
   2. 双击浏览器中的第一个示例以打开 SSC-A vs. FSC-A 图。使用工具栏中的多边形工具定义单元格总体（图2，图 1），从分析中排除碎屑。确保门朝右上角足够宽，以适应与治疗相关的移位，但将边框限制在图的左下角，以可靠地排除细胞。
   3. 双击"单元格"门以打开新的绘图窗口，并通过单击轴标签将轴更改为 DAPI-W（垂直）与 DAPI-A（水平）。使用矩形工具定义单细胞总体（图2，图 2），从分析中排除单元格双精度或块（G1 单元格的双精度值与 G2 和 M 单元格具有相同的 DAPI-A 强度，但 DAPI-W 要高得多值）。
      注:由于DAPI与DNA的平衡结合，不同样本中不同的细胞计数将导致整体DAPI-A信号强度的变化。这不会影响细胞周期分析，但可能需要按样本调整单个单元门样本的右边框，以考虑这些偏移。
   4. 双击 Single Cell门以打开新的绘图窗口并更改轴以显示 DAPI-A 直方图。使用双扇形工具区分具有正常DNA含量（细胞循环总体）的单细胞与DNA退化的凋亡细胞（亚G1总体）。随后，在浏览器中选择新门，然后按Ctrl + R进行相应重命名（图2，图 3）。
   5. 在浏览器中选择"单元格循环"门并选择"工具 |生物学 |细胞周期...从菜单栏打开单元格周期建模工具。在"模型"部分选择 Dean-Jett-Fox 25、26 来估计 G1、S 和 G2/M 相中细胞的频率（图2，图 4）。仅在建模性能不佳时使用约束（最小化模型和数据之间的根均值平方偏差）。
   6. 在 DAPI-W 与 DAPI-A 图中为G1（椭圆工具）、S（多边形工具）和G2 + M（椭圆工具）阶段创建门，以启用细胞周期特异性的 +H2AX 测量 （图 2图 5）。请勿使用基于 DAPI-A 直方图的自动单元循环门控模型工具，因为这可能不准确。
      注:可能需要沿 DAPI-A 轴样本移动门，以考虑上述总体 DAPI 信号强度的变化。只将三个门作为一个组移动，并且不更改单个门的形状以避免偏差。
   7. 使用双扇形工具区分细胞循环总体的Alexa555-A直方图中的磷-组蛋白H3阳性（M）和阴性（M-）细胞（图2，图6）。按住Ctrl并选择门G2 + M和M-。按Ctrl + Shift = A创建G2 （G2+M 和 M-） 门。
   8. 使用双扇形工具区分单细胞总体的Alexa647-A直方图中的caspase-3阳性（Casp3+）和-阴性（Casp3-）细胞（图2，图7）。设置阈值，使未经处理的对照组中Casp3+总体的平均值达到 ±0.8%，以确保高灵敏度并最大限度地减少测定到测定的变化。
   9. 按Ctrl + T打开表编辑器，并根据图3对其进行配置。将示例浏览器的不同总体拖放到表编辑器中，并双击行以更改统计信息、参数和名称设置。通过选择行并按Del，删除单元格循环建模图标的拖放后自动添加的不必要的行。
   10. 在菜单功能区的"输出"部分中选择"文件"格式和目标，然后单击"创建表"将数据导出为".xlsx"文件。
2. 使用表计算软件（参见材料表）根据补充文件 1（FACS_分析_模板_（1）进行进一步的数据分析。
   1. 通过将公式 X' = X = 100 / = （所有细胞周期相）与 X':校正值、X:原始值应用于每个细胞周期阶段，校正不同细胞周期阶段中细胞的频率，使细胞总和达到 100%。
      注:由于细胞周期建模中不准确，因此出现与 100% 之和的偏差，但通常较小（<5%）。
   2. 通过将S相中的值除以1.5和G2和M相2.0，将中位βH2AX强度标准化为不同细胞周期阶段的DNA含量。
   3. 要计算整个细胞群中合并的标准化 ±H2AX 水平，请使用公式 I_A = I_G1 + G1 = I_S + I_G2 = G2 = I_M = M，其中 I_A、I_{G1、IG2、IM}均均归一化中位=H2AX强度，G1、S、G2、M细胞分别在各细胞周期阶段校正细胞频率。
   4. 对于归一化的β2AX水平和亚G1和caspase-3阳性细胞的频率，从每个样本中减去未经处理的对照的平均值。
   5. 计算所有复制样本中每个参数的平均值和标准偏差，并将结果绘制成图表。

结果

人类U87或LN229胶质细胞细胞受到4Gy光子或碳离子电池辐射的照射。使用此处介绍的流式细胞测定方法（图3），在辐照后48小时的不同时间点测量细胞周期特异性βH2AX水平和凋亡。在两种细胞系中，碳离子诱导更高的βH2AX峰值水平，下降速度较慢，在24至48小时时与相同物理剂量的光子辐射相比显著升高（图4A）。这表明，与修复效率较低的光...

讨论

该特色方法易于使用，并提供快速、准确和可重复的DNA损伤响应测量，包括双链断裂（DSB）诱导和修复、细胞周期效应和凋亡细胞死亡。与单个测定相比，这些端点的组合提供了更完整的两性关系图。该方法可广泛应用于放射生物学、治疗和保护领域的综合基因毒性测定，更普遍地应用于肿瘤学（例如，环境风险因素评估、药物筛选和基因评估）肿瘤细胞的不稳定性）。

该?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 µL filter tips	Nerbe plus	07-693-8300
100-1,000 µL pipette	Eppendorf	3123000063
12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size	BD Falcon	352235
15 mL tubes	BD Falcon	352096
200 µL filter tips	Nerbe plus	07-662-8300
20-200 µL pipette	Eppendorf	3123000055
4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C
Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011	BioLegend	613406	Dilute 1:20
Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414	BD Pharmingen	560626	Dilute 1:20
BD FACSClean solution	BD Biosciences	340345	For cytometer cleaning routine after measurement
BD FACSRinse solution	BD Biosciences	340346	For cytometer cleaning routine after measurement
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biochrom	L 182	Dissolve in water to 1x concentration
Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin	Biochrom	FG 0415	Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Ethanol absolute	VWR	20821.330
Excel software	Microsoft
FBS Superior (fetal bovine serum)	Biochrom	S 0615	Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
FlowJo v10 software	LLC	online order
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples
Folded cellulose filters, grade 3hw	NeoLab	11416
LSRII or LSRFortessa cytometer	BD Biosciences
MG132	Calbiochem	474787	optional drug for apoptosis positive control
Multifuge 3SR+	Heraeus
Paraformaldehyde	AppliChem	A3813	Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter.
Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639	Cell Signaling Technology	#3475	Dilute 3:200
PIPETBOY acu 2	Integra Biosciences	155 016
Serological pipettes, 10 mL	Corning	4488
Serological pipettes, 25 mL	Corning	4489
Serological pipettes, 5 mL	Corning	4487
SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand)	Biomol	AG-40T-0002-C020	optional drug for apoptosis positive control
T25 cell culture flasks	Greiner bio-one	690160	Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Trypsin/EDTA	PAN Biotech	P10-025500	Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
U87 MG glioblastoma cells	ATCC	ATCC-HTB-14	Example cell line used in the protocol