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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die vorgestellte Methode kombiniert die quantitative Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Zellzyklusverteilung und Apoptose, um eine zellzyklusspezifische Auswertung der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Folgen eines Reparaturfehlers zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Die vorgestellte Methode oder leicht modifizierte Versionen wurden entwickelt, um spezifische Behandlungsreaktionen und Nebenwirkungen verschiedener Anti-Krebs-Behandlungen zu untersuchen, wie sie in der klinischen Onkologie verwendet werden. Es ermöglicht eine quantitative und Längsschnittanalyse der DNA-Schadensreaktion nach genotoxischem Stress, wie durch Strahlentherapie und eine Vielzahl von Anti-Krebs-Medikamenten induziert. Die Methode deckt alle Stadien der Reaktion auf DNA-Schäden ab und bietet Endpunkte für die Induktion und Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Zellzyklusstillstand und Zelltod durch Apoptose im Falle eines Reparaturfehlers. Die Kombination dieser Messungen liefert Informationen über zellzyklusabhängige Behandlungseffekte und ermöglicht somit eine eingehende Untersuchung des Zusammenspiels zwischen Zellproliferation und Bewältigungsmechanismen gegen DNA-Schäden. Da die Wirkung vieler Krebstherapeutika, einschließlich Chemotherapeutika und ionisierender Strahlung, auf bestimmte Zellzyklusphasen begrenzt ist oder stark variiert, basieren korrelative Analysen auf einer robusten und praktikablen Methode zur Bewertung der Behandlungseffekte. auf die DNA in einer zellzyklusspezifischen Weise. Dies ist bei Single-Endpunkt-Assays und einem wichtigen Vorteil der vorgestellten Methode nicht möglich. Die Methode ist nicht auf eine bestimmte Zelllinie beschränkt und wurde gründlich in einer Vielzahl von Tumor- und normalen Gewebezelllinien getestet. Es kann weithin als umfassender Genotoxizitätstest in vielen Bereichen der Onkologie neben der Radioonkologie angewendet werden, einschließlich der Bewertung von Umweltrisikofaktoren, dem Arzneimittelscreening und der Bewertung genetischer Instabilität in Tumorzellen.

Einleitung

Das Ziel der Onkologie ist es, Krebszellen abzutöten oder zu inaktivieren, ohne normale Zellen zu schädigen. Viele Therapien induzieren direkt oder indirekt genotoxischen Stress in Krebszellen, aber auch zu einigen in normalen Zellen. Chemotherapie oder gezielte Medikamente werden oft mit Strahlentherapie kombiniert, um die Radiosensitivität des bestrahlten Tumors1,2,3,4,5zu verbessern, was eine die Strahlendosis, um normale Gewebeschäden zu minimieren.

Ionisierende Strahlung und andere genotoxische Mittel verursachen verschiedene Arten von DNA-Schäden, einschließlich Basismodifikationen, Strang-Querverbindungen und Ein- oder Zweistrangbrüche. DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) sind die schwerwiegendsten DNA-Läsionen und ihre Induktion ist der Schlüssel zur Zelltötungswirkung ionisierender Strahlung und verschiedener zytostatischer Medikamente in der Radiochemotherapie. DSBs schädigen nicht nur die Integrität des Genoms, sondern fördern auch die Bildung von Mutationen6,7. Daher haben sich während der Evolution verschiedene DSB-Reparaturpfade und Mechanismen zur Beseitigung irreparabel beschädigter Zellen wie Apoptose entwickelt. Die gesamte DNA-Schadensreaktion (DDR) wird durch ein komplexes Netzwerk von Signalwegen reguliert, die von der ERKENNUNG von DNA-Schäden und dem Zellzyklusstillstand reichen, um eine DNA-Reparatur, einen programmierten Zelltod oder eine Inaktivierung im Falle eines Reparaturfehlers zu ermöglichen8.

Die vorgestellte zytometrische Strömungsmethode wurde entwickelt, um die DDR nach genotoxischem Stress in einem umfassenden Test zu untersuchen, der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Folgen eines Reparaturfehlers abdeckt. Es kombiniert die Messung des weit verbreiteten DSB-Markers H2AX mit der Analyse des Zellzyklus und der Induktion der Apoptose, mit klassischer SubG1-Analyse und einer spezifischeren Auswertung der Caspase-3-Aktivierung.

Die Kombination dieser Endpunkte in einem Test reduziert nicht nur Zeit-, Arbeits- und Kostenaufwand, sondern ermöglicht auch die zellzyklusspezifische Messung der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Caspase-3-Aktivierung. Solche Analysen wären mit unabhängig durchgeführten Assays nicht möglich, aber sie sind für ein umfassendes Verständnis der REAKTION auf DNA-Schäden nach genotoxischem Stress von großer Bedeutung. Viele Krebsmedikamente, wie z. B. zytostatische Verbindungen, richten sich gegen die Zellteilung und ihre Effizienz ist stark vom Zellzyklusstadium abhängig. Die Verfügbarkeit verschiedener DSB-Reparaturprozesse hängt auch von der Zellzyklusstufe und der Fürdier-Genauigkeit entscheidenden Zellzyklusphase und -wegwahl ab und bestimmt wiederum das Schicksal der Zelle9,10,11, 12. Darüber hinaus ist die zellzyklusspezifische Messung des DSB-Spiegels genauer als die gepoolte Analyse, da die DSB-Spiegel nicht nur von der Dosis einer genotoxischen Verbindung oder Strahlung abhängen, sondern auch vom DNA-Gehalt der Zelle.

Die Methode wurde verwendet, um die Wirksamkeit verschiedener Radiotherapien zu vergleichen, um Resistenzmechanismen bei Glioblastom13 zu überwinden und das Zusammenspiel zwischen ionisierender Strahlung und gezielten Medikamenten bei Osteosarkom14,15 zu sezieren. und atypische teraide Rhabdoidkrebs16. Darüber hinaus wurde die beschriebene Methode weit verbreitet, um Nebenwirkungen von Radio- und Chemotherapie auf mesenchymale Stammzellen17,18,19,20,21, 22,23,24, die für die Reparatur von behandlungsbedingten normalen Gewebeschäden unerlässlich sind und eine mögliche Anwendung in der regenerativen Medizin haben.

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Protokoll

1. Vorbereitung

  1. Bereiten Sie 1 x 105 Zellen/Probe in jeder Art von Kulturgefäß als Ausgangsmaterial vor.
    1. Führen Sie beispielsweise ein Zeit-Kurs-Experiment nach Exposition von U87-Glioblastomzellen gegenüber ionisierender Strahlung durch: Bestrahlen Sie subkonfluente U87-Zellen in T25-Flaschen in Triplicaten für jeden Zeitpunkt. Wählen Sie frühe Zeitpunkte (15 min bis 8 h nach Bestrahlung), um die Kinetik der DSB-Reparatur (H2AX-Niveau) und späte Zeitpunkte (24 h bis 96 h) zu verfolgen, um Rest-DSB-Spiegel, Zellzykluseffekte und Apoptose zu bewerten.
      HINWEIS: Das Protokoll ist nicht auf Bestrahlungsexperimente oder eine bestimmte Zelllinie beschränkt. Es wurde mit zahlreichen Zelllinien aller Art, von verschiedenen Arten und für verschiedene Behandlungsbedingungen getestet.
  2. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor, einschließlich 10 % Übervolumen.
    1. Bereiten Sie 2 ml pro Probe der Fixationslösung vor, die aus 4,5 % Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Saline (PBS) besteht. Bereiten Sie die Lösung frisch vor. PFA in PBS verdünnen, indem man mit langsamem Rühren unter der Dunstabzugshaube auf 80 °C erhitzt. Bedecken Sie den Kolben mit Aluminiumfolie, um Wärmeverlust zu verhindern. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und stellen Sie das endgültige Volumen ein. Übergeben Sie die Lösung durch einen gefalteten Zellulosefilter, Grad 3hw (siehe Materialtabelle).
      ACHTUNG: PFA-Dämpfe sind giftig. Führen Sie diesen Schritt unter einer Dunstabzugshaube durch und entsorgen Sie PFA-Abfall entsprechend.
    2. 3 ml pro Probe der Permeabilisationslösung, bestehend aus 70% Ethanol in eiskaltemH2O. bei -20 °C lagern.
    3. Bereiten Sie 7 ml pro Probe der Waschlösung vor, die aus 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS besteht.
    4. Bereiten Sie 100 l pro Probe von 3% BSA in PBS als Antikörperverdünnung vor.
    5. Bereiten Sie 100-250 l pro Probe der DNA-Färbungslösung vor, die aus 1 g/ml 4',6-Diamidin-2-Phenylindol (DAPI) in PBS besteht.
  3. Die Zentrifuge für 15 ml-Rohre auf 5 min bei 200 x g und 7 °C einstellen. Lassen Sie die Zentrifuge abkühlen und verwenden Sie diese Einstellungen für alle Zentrifugationsschritte.

2. Probensammlung

  1. Wenn die Verarbeitung von anhaftenden Zellen (z. B. U87-Glioblastomzellen, die in T25-Flaschen mit 5 ml des modifizierten Eagle-Mediums von Dulbecco angebaut werden, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum bei 37 °C und 5 % Kohlendioxidatmosphäre), mit den Schritten 2.1.1 fortfahren. und 2.1.2. Für Suspensionszellen fahren Sie direkt mit Schritt 2.1.2 fort.
    1. Sammeln Sie das Medium in einem Zentrifugationsrohr. Lösen Sie die Zellen mit einer routinemäßigen Zellkulturmethode, die die Verwendung von Trypsin, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder anderen Zellablösungsmitteln umfassen kann.
      1. Für U87-Zellen, Vorwarme PBS und Trypsin/EDTA (siehe Materialtabelle) bis 37 °C, waschen Sie die Zellschicht mit 1 ml PBS, inkubieren Sie die Zellen für 1-2 min mit 1 ml Trypsin/EDTA und unterstützen Sie die Zellablösung durch Antippen auf den Kolben. Sammeln Sie alle Waschlösung und die Zellsuspension in der Röhre mit dem Medium.
    2. Zentrifugieren Sie die Zellen, verwerfen Sie das Medium und setzen Sie die Zellen in 1 ml PBS wieder aus.
  2. Pipetdiere die Zellen mehrmals nach oben und unten, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten und die Zellsuspension in ein Rohr mit 2 ml Fixierlösung (4,5% PFA/PBS, 3% Endkonzentration) zu übertragen.
    ACHTUNG: PFA-Dämpfe sind giftig. Führen Sie diesen Schritt unter einer Dunstabzugshaube durch und entsorgen Sie PFA-Abfall entsprechend.
  3. Inkubieren Sie die Zellen für 10 min bei Raumtemperatur.
  4. Zentrifugieren Sie die Zellen und entsorgen Sie den Überstand durch Dekantierung.
  5. Lösen Sie das Zellpellet, indem Sie auf das Rohr tippen, und setzen Sie die Zellen in 3 ml 70% Ethanol wieder auf. Fahren Sie direkt mit dem nächsten Schritt fort oder lagern Sie die Proben bis zu mehreren Wochen bei 4 °C.

3. Waschen und Färben

  1. Zentrifugieren Sie die Zellen und entsorgen Sie den Überstand durch Dekantierung.
  2. Lösen Sie das Zellpellet, indem Sie auf das Rohr tippen. Die Zellen in 3 ml Waschlösung (0,5% BSA/PBS), Zentrifuge wieder aufhängen und den Überstand entsorgen.
  3. Wiederholen Sie den Waschschritt 1x mit 3 ml und dann 1x mit 1 ml Waschlösung. Entsorgen Sie den Überstand im letzten Schritt sorgfältig durch Pipettieren. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu aspirieren.
  4. Verdünnen Sie die Antikörper gegen H2AX, Phospho-Histon H3 (Ser10) und Caspase-3 (siehe Materialtabelle) in 100 l/Probe mit Antikörperverdünnungsmittel (3% BSA/PBS).
  5. Lösen Sie das Zellpellet, indem Sie auf das Rohr tippen, und setzen Sie die Zellen in 100 l der in Schritt 3.4 hergestellten Antikörperlösung wieder auf. Halten Sie die Proben ab diesem Schritt im Dunkeln.
  6. Inkubieren Sie die Proben für 1 h bei Raumtemperatur.
  7. Zentrifugieren Sie die Zellen und entsorgen Sie den Überstand sorgfältig durch Pipettieren. Achten Sie darauf, das Pellet nicht zu aspirieren.
  8. Lösen Sie das Zellpellet, indem Sie auf das Rohr tippen, und setzen Sie die Zellen in 100-250 l DNA-Färbungslösung (1 g/ml DAPI/PBS) wieder auf.
    1. Verwenden Sie 100 l, wenn 1-2 x105 Zellen vorhanden sind, und erhöhen Sie das Volumen für höhere Zellzahlen (250 l für 1 x 106 Zellen). Fahren Sie direkt mit dem nächsten Schritt fort oder lagern Sie die Proben bis zu 2 Wochen bei 4 °C im Dunkeln.
      HINWEIS: Bei einigen Zelltypen kann die Optimierung der DAPI-Konzentration dazu beitragen, die Trennung der Zellzyklusphasen zu verbessern.
  9. Pipet die Proben durch die Zellsiebkappe eines Probenrohrs mit einer Mesh-Porengröße von 35 m.

4. Messung

  1. Legen Sie die Proben auf Eis, starten Sie das Durchflusszytometer (siehe Materialtabelle), das mit einem optischen Setup gemäß Tabelle 1 konfiguriert ist, und drücken Sie die Prime-Taste. Schalten Sie bei Bedarf den ultravioletten Laser (355 nm Wellenlänge) separat ein und stellen Sie die Leistung mit der entsprechenden Software auf 10 mW ein.
  2. Öffnen Sie die Erfassungssoftware (siehe Tabelle der Materialien), melden Sie sich an und erstellen Sie ein neues Experiment, indem Sie auf der Browsersymbolleiste auf die Schaltfläche Neues Experiment klicken.
  3. Verwenden Sie das Inspektor-Fenster, um den Namen des Experiments anzupassen, und wählen Sie '5 Protokolljahrzehnte' für die Plotanzeige aus.
  4. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Neue Probe" in der Browser-Symbolleiste, und erweitern Sie den neuen Eintrag, indem Sie auf das Symbol "+" auf der linken Seite klicken, um die erste Tubeanzuzeigen. Wählen Sie das entsprechende Symbol und den entsprechenden Typ aus, um die Specimen (z. B. Zelltyp) und die Tube (Beispielbezeichner) umzubenennen. Klicken Sie auf den Tube-Zeiger der ersten Röhre (pfeilartiges Symbol auf der linken Seite), um sie grün (aktiv) zu drehen.
  5. Öffnen Sie die Registerkarte Parameter im Zytometer-Fenster, und wählen Sie die Parameter gemäß Tabelle 1 aus. Löschen Sie alle nicht benötigten Parameter.
    HINWEIS: Die Parameternamen können je nach den benutzerdefinierten Voreinstellungen variieren (z. B. Cy3 anstelle von Alexa555). Stellen Sie sicher, dass die Auswahl mit den optischen Filtern und Detektoren in Tabelle 1übereinstimmt. Die Lichtpfade aller Fluorophore sind bei diesem Aufbau völlig unabhängig und eine Kompensation der spektralen Überlappung ist nicht erforderlich; Es kann jedoch erforderlich sein, wenn ein anderes optisches Setup verwendet wird.
  6. Öffnen Sie das Arbeitsblattfenster, und erstellen Sie Plots gemäß Abbildung 1. Zeichnen Sie 2 Punktdiagramme und 4 Histogramme mit den entsprechenden Symbolleistenschaltflächen und klicken Sie auf die Achsenbeschriftungen, um die entsprechenden Parameter (Frontstreuung (FSC-A) im Vergleich zu Seitenstreuung (SSC-A), DAPI-W versus DAPI-A und ein Histogramm für DAPI-A und jeden Antikörper gekoppelt auszuwählen. Fluorophor.
  7. Befestigen Sie eine Steuerprobe am Zytometer und drücken Sie die Run-Taste am Instrument. Wählen Sie die erste Röhre im Browserfenster der Software aus, und klicken Sie im Erfassungsdashboard auf die Schaltfläche Daten erfassen. Passen Sie das Probeninjektionsvolumen mit den TastenLow, Mid oder High und dem Feinabstimmungsrad am Instrument an. Arbeiten Sie vorzugsweise bei Low- einstellung, aber versuchen Sie, mindestens 100 Ereignisse/Sekunde zu erwerben (siehe Erfassungsdashboard).
  8. Passen Sie die Detektorspannungen für FSC, SSC und DAPI in der Registerkarte Parameter des Inspektorfensters an, indem Sie die Punktdiagramme in Abbildung 1 als Richtlinie verwenden. Wechseln Sie zur logarithmischen Skala für die FSC- und SSC-Parameter, wenn die Zellpopulation auf einer linearen Skala zu dispergiert erscheint.
  9. Drücken Sie die Standby-Taste am Zytometer, und fahren Sie mit der Einrichtung des Arbeitsblatts in der Software fort.
    1. Verwenden Sie das Polygon-Gate-Werkzeug, um die Cells-Population im Diagramm FSC-A im Vergleich zu SSC-A und das Rechtecktor-Werkzeug zu definieren, um die SingleCells-Population im DAPI-W-im-DAPI-A-Diagramm zu definieren. Drücken Sie die Strg + G-Tasten, um die Bevölkerungshierarchie anzuzeigen, und klicken Sie auf die Standard-Gate-Namen, um sie umzubenennen.
    2. Anschließend mit der rechten Maustaste auf alle Histogramme klicken und Populationen anzeigen | SingleCells aus dem Kontextmenü.
  10. Optimieren Sie die Detektorspannungen für die antikörpergekoppelten Fluorophore, um den gesamten Dynamikbereich abzudecken, indem Sie anschließend Kontroll- und behandelte Proben erfassen. Maximieren Sie das Signal-Rausch-Verhältnis und vermeiden Sie die Sättigung des Detektors. Stellen Sie sicher, dass der Alexa488-Peak in der SingleCells-Population weder im Steuerelement noch in der behandelten Stichprobe abgeschnitten wird.
  11. Drücken Sie die Standby-Taste am Zytometer, und führen Sie optional die Schritte 4.11.1-4.11.3 im Arbeitsblattfenster der Software aus, um eine grobe Schätzung der Behandlungseffekte während der Probenentnahme zu erhalten.
    1. Wählen Sie SingleCells in der Bevölkerungshierarchie aus, und verwenden Sie das Rechtecktor-Werkzeug, um die G1-Population im DAPI-W-Im-DAPI-A-Diagramm zu definieren. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Alexa488 Histogramm und wählen Sie Populationen anzeigen | G1 aus dem Kontextmenü.
    2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Alexa488-Histogramm, und wählen Sie Im Kontextmenü Statistikansicht erstellen aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Statistikansicht, und wählen Sie Statistikansicht bearbeitenaus. Gehen Sie auf die Registerkarte Statistik und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für den Median des Alexa488-Signals in der G1-Population (deaktivieren Sie alle anderen Optionen).
    3. Wählen Sie SingleCells in der Bevölkerungshierarchie aus, und verwenden Sie das Werkzeug Intervalltor, um die SubG1-,M- und Casp3+-Populationen in dAPI-A, Alexa555-A (Cy3-A in Abbildung 1) und Alexa647-A Histogramme.
  12. Drücken Sie die Run-Taste am Zytometer und messen Sie die Proben mit dem Erfassungsdashboard in der Software. Legen Sie das Stopptor auf Alle Ereignisse oder das Cells-Gate (wenn zahlreiche kleine Partikel vorhanden sind) und die Anzahl der Ereignisse, die auf 10.000 aufzeichnen sollen.
  13. Klicken Sie auf Nächste Ansicht, um ein neues Beispiel zu erstellen, benennen Sie es im Browserfenster um, klicken Sie auf Daten erfassen, um die Erfassung zu starten, und nehmen Sie Daten auf, um die Aufzeichnung zu starten.
  14. Datei auswählen | Export | Experimentiert in der Menüleiste und wählt Verzeichnisexport im Dialogfeld aus, um die Daten als '.fcs'-Dateien zu speichern. Speichern Sie das Experiment optional als zusätzliche ZIP-Datei, wenn sie den erneuten Import des Experiments zu einem späteren Zeitpunkt aktivieren soll.
    HINWEIS: Die Einrichtung vorhandener Experimente kann einfach mit Edit | Duplizieren ohne Daten.

5. Datenauswertung

  1. Ziehen Sie die Dateien ".fcs" in den Beispielbrowser der zytometrischen Analysesoftware (siehe Materialtabelle). Wenden Sie die in Abbildung 2gezeigte Gating-Strategie an. Stellen Sie sicher, dass die Tore in allen Proben zur entsprechenden Population passen, bevor Sie mit dem nächsten Tochtertor fortfahren.
    1. Um Änderungen auf alle Samples anzuwenden, wählen Sie das geänderte Gate im Beispielbrowser aus, kopieren Sie es, indem Sie Strg + Cdrücken, das übergeordnete Gate auswählen, Strg + Umschalttaste + E drücken, um die entsprechenden Knoten in allen Samples auszuwählen, und drücken Sie Strg + V, um es einzufügen oder zu überschreiben. das Tor. Verwenden Sie keine Gruppentore.
    2. Doppelklicken Sie auf das erste Beispiel im Browser, um das Diagramm SSC-A vs. FSC-A zu öffnen. Verwenden Sie das Polygon-Werkzeug in der Symbolleiste, um die Zellenpopulation zu definieren (Abbildung2, Diagramm 1), ohne Trümmer aus der Analyse. Stellen Sie sicher, dass das Tor breit genug in Richtung der oberen rechten Ecke ist, um behandlungsbezogene Verschiebungen aufzunehmen, aber beschränken Sie den Rand nach unten links, um die Zelle zuverlässig auszuschließen.
    3. Doppelklicken Sie auf das Cells-Gate, um ein neues Plotfenster zu öffnen und die Achsen in DAPI-W (vertikal) vs. DAPI-A (horizontal) zu ändern, indem Sie auf die Achsenbeschriftungen klicken. Verwenden Sie das Rechteck-Werkzeug, um die SingleCells-Population (Abbildung2, Plot 2) zu definieren, ohne Zelldoublets oder Klumpen aus der Analyse (Doublets von G1-Zellen haben die gleiche DAPI-A-Intensität wie G2- und M-Zellen, aber eine deutlich höhere DAPI-W Wert).
      HINWEIS: Unterschiedliche Zellzahl in verschiedenen Proben führt aufgrund der Gleichgewichtsbindung von DAPI an die DNA zu Verschiebungen in der gesamten DAPI-A-Signalstärke. Dies wirkt sich nicht auf die Zellzyklusanalyse aus, aber es kann notwendig sein, den rechten Rand der Einzelzellen-Gate-Probe nach Stichprobe anzupassen, um diese Verschiebungen zu berücksichtigen.
    4. Doppelklicken Sie auf das SingleCells-Gate, um ein neues Plotfenster zu öffnen und die Achsen zu ändern, um das DAPI-A-Histogramm anzuzeigen. Verwenden Sie das Bisektor-Tool, um einzelne Zellen mit normalem DNA-Gehalt (CellCycle-Population) von apoptotischen Zellen mit degradierter DNA (SubG1-Population) zu unterscheiden. Wählen Sie anschließend die neuen Gates im Browser aus und drücken Sie Strg + R, um sie entsprechend umzubenennen (Abbildung2, Plot 3).
    5. Wählen Sie das CellCycle-Gate im Browser aus und wählen Sie Tool | Biologie | Zellzyklus... aus der Menüleiste, um das Werkzeug zur Zellzyklusmodellierung zu öffnen. Wählen Sie Dean-Jett-Fox25,26 im Abschnitt Modell, um die Häufigkeit von Zellen in der G1-, S- und G2/M-Phase zu schätzen (Abbildung2, Plot 4). Verwenden Sie Abhängigkeiten nur bei schlechter Modellierungsleistung (Minimieren Sie die Grundlegende Mittelwert-Quadrat-Abweichung zwischen Modell und Daten).
    6. Erstellen Sie Tore für die Phase G1 (Ellipse-Werkzeug), S ( Polygon-Werkzeug) und G2 + M (Ellipsenwerkzeug) im DAPI-W vs. DAPI-A-Diagramm der CellCycle-Population, um die zellzyklusspezifische Messung von H2AX zu ermöglichen ( Abbildung 2, Plot 5). Verwenden Sie das Modellierungstool nicht für die automatische Zellenzyklus-Gating basierend auf dem DAPI-A-Histogramm, da dies ungenau sein kann.
      HINWEIS: Es kann notwendig sein, die Gates entlang der DAPI-A-Achsenstichprobe nach Beispiel zu verschieben, um die oben genannten Verschiebungen der gesamten DAPI-Signalstärke zu berücksichtigen. Nur die drei Tore als Gruppe bewegen und nicht die Form der einzelnen Tore ändern, um Voreingenommenheit zu vermeiden.
    7. Verwenden Sie das Bisektor-Werkzeug, um Phospho-Histon H3-positive (M) und -negative (M-)Zellen im Alexa555-A Histogramm der CellCycle-Population zu unterscheiden (Abbildung 2, Diagramm 6). Halten Sie Strg gedrückt und wählen Sie die Tore G2 + M und M-. Drücken Sie Strg + Umschalttaste + A, um das G2 (G2+M & M-) Tor zu erstellen.
    8. Verwenden Sie das Bisektor-Werkzeug, um Caspase-3-positive (Casp3+) und -negative (Casp3-) Zellen im Alexa647-A Histogramm der SingleCells-Population zu unterscheiden (Abbildung 2, Plot 7). Legen Sie den Schwellenwert so fest, dass der Durchschnitt der Casp3+-Population in den unbehandelten Kontrollen 0,8 % beträgt, um eine hohe Empfindlichkeit zu gewährleisten und Assay-to-Assay-Variationen zu minimieren.
    9. Drücken Sie Strg + T, um den Tabelleneditor zu öffnen und gemäß Abbildung 3zu konfigurieren. Ziehen Sie die verschiedenen Gliederungen aus dem Beispielbrowser in den Tabellen-Editor und doppelklicken Sie auf die Zeilen, um die Statistik-, Parameter- und Namenseinstellungen zu ändern. Entfernen Sie die unnötigen Zeilen, die nach dem Ziehen und Ablegen des Symbols für die Zellzyklusmodellierung automatisch hinzugefügt werden, indem Sie die Zeilen auswählen und Deldrücken.
    10. Wählen Sie In Datei, das Format und das Ziel im Ausgabeabschnitt des Menübands, und klicken Sie auf Tabelle erstellen, um die Daten als '.xlsx'-Datei zu exportieren.
  2. Verwenden Sie die Tabellenberechnungssoftware (siehe Materialtabelle) für die weitere Datenanalyse gemäß Der Ergänzenden Datei 1 (FACS_Analysis_Template_(1).xlsx).
    1. Korrigieren Sie die Frequenzen der Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen so, dass ihre Summe 100% beträgt, indem Sie die Formel X' = X * 100 / ( alle Zellzyklusphasen) anwenden, mit X': korrigierter Wert, X: Rohwert, auf jede Zellzyklusphase.
      HINWEIS: Abweichungen von einer Summe von 100% treten aufgrund von Ungenauigkeiten in der Zellzyklusmodellierung auf, sind aber in der Regel gering (<5%).
    2. Normalisieren Sie die medianen H2AX-Intensitäten auf den DNA-Gehalt in den verschiedenen Zellzyklusphasen, indem Sie die Werte in der S-Phase durch 1,5 und in g2- und M-Phase durch 2,0 dividieren.
    3. Um den kombinierten normalisierten H2AX-Pegel in der gesamten Zellpopulation zu berechnen, verwenden Sie die Formel IA = IG1 * G1 + IS * S + IG2 * G2 + IM * M, wobei IA, IG1, IS, IG2, IM sind normalisierte Median-H2AX-Intensitäten aller, G1, S, G2, M-Zellen bzw. G1, S, G2, M sind korrigierte Frequenz der Zellen in der jeweiligen Zellzyklusphase.
    4. Subg.H2AX-Werte und die Häufigkeit von SubG1- und Caspase-3-positiven Zellen subtrahieren den Durchschnittswert der unbehandelten Steuerelemente von jeder Probe.
    5. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung jedes Parameters aus allen Replikationsstichproben, und zeichnen Sie die Ergebnisse in Diagramme ein.

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Ergebnisse

Menschliche U87- oder LN229-Glioblastomzellen wurden mit 4 Gy Photonen- oder Kohlenstoffionenstrahlung bestrahlt. Zellzyklus-spezifische H2AX-Spiegel und Apoptose wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten bis zu 48 h nach Bestrahlung mit der hier vorgestellten Strömungszytometriemethode gemessen (Abbildung 3). In beiden Zelllinien induzierten Kohlenstoffionen höhere H2AX-Spitzenwerte, die langsamer zurückgingen und mit 24 bis 48 h signifikant erhöht blieben, verglichen mit Photonenstrahlun...

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Diskussion

Die vorgestellte Methode ist einfach zu bedienen und bietet eine schnelle, genaue und reproduzierbare Messung der DNA-Schadensreaktion einschließlich Doppelstrangbruch (DSB) Induktion und Reparatur, Zellzykluseffekte und apoptotischezellige Tod. Die Kombination dieser Endpunkte bietet ein vollständigeres Bild ihrer Zusammenhänge als einzelne Assays. Die Methode kann in den Bereichen Strahlenbiologie, Therapie und Schutz und ganz allgemein in der Onkologie (z. B. für die Bewertung von Umweltrisikofaktoren, Arzneimitte...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken dem Flow Cytometry Facility Team des Deutschen Krebsforschungszentrums (DKFZ) für die Unterstützung.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1,000 µL filter tipsNerbe plus07-693-8300
100-1,000 µL pipetteEppendorf3123000063
12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore sizeBD Falcon352235
15 mL tubesBD Falcon352096
200 µL filter tipsNerbe plus07-662-8300
20-200 µL pipetteEppendorf3123000055
4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)Sigma-AldrichD9542Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C
Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011BioLegend613406Dilute 1:20
Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414BD Pharmingen560626Dilute 1:20
BD FACSClean solutionBD Biosciences340345For cytometer cleaning routine after measurement
BD FACSRinse solutionBD Biosciences340346For cytometer cleaning routine after measurement
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)BiochromL 182Dissolve in water to 1x concentration
Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutaminBiochromFG 0415Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Ethanol absoluteVWR20821.330
Excel softwareMicrosoft
FBS Superior (fetal bovine serum)BiochromS 0615Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
FlowJo v10 softwareLLConline order
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples
Folded cellulose filters, grade 3hwNeoLab11416
LSRII or LSRFortessa cytometerBD Biosciences
MG132Calbiochem474787optional drug for apoptosis positive control
Multifuge 3SR+Heraeus
ParaformaldehydeAppliChemA3813Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter.
Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639Cell Signaling Technology#3475Dilute 3:200
PIPETBOY acu 2Integra Biosciences155 016
Serological pipettes, 10 mLCorning4488
Serological pipettes, 25 mLCorning4489
Serological pipettes, 5 mLCorning4487
SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand)BiomolAG-40T-0002-C020optional drug for apoptosis positive control
T25 cell culture flasksGreiner bio-one690160Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Trypsin/EDTAPAN BiotechP10-025500Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
U87 MG glioblastoma cellsATCCATCC-HTB-14Example cell line used in the protocol

Referenzen

  1. Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122(2006).
  2. Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
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