JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Sunulan yöntem DNA çift iplikçiks breaks (DSBs), hücre döngüsü dağılımı ve apoptosis kantitatif analizi birleştirerek DSB indüksiyon ve onarım hücre döngüsü özgü değerlendirilmesi yanı sıra onarım başarısızlık sonuçları sağlar.

Özet

Sunulan yöntem veya biraz değiştirilmiş versiyonları klinik onkolojide kullanılan çeşitli anti-kanser tedavilerinin spesifik tedavi yanıtlarını ve yan etkilerini incelemek için geliştirilmiştir. Radyoterapi ve çok sayıda anti-kanser ilacının indüklediği gibi, genotoksik stres sonrası DNA hasar yanıtının kantitatif ve uzunlamasına analizini sağlar. Yöntem DNA hasar tepkisinin tüm aşamalarını kapsamaktadır, dna çift iplikçikli sonları (DSBs), hücre döngüsü durması ve onarım apoptosis ile hücre ölümü için uç noktaları sağlar. Bu ölçümlerin birleştirilmesi hücre döngüsüne bağlı tedavi etkileri hakkında bilgi sağlar ve böylece hücresel proliferasyon ve DNA hasarına karşı başa çıkma mekanizmaları arasındaki etkileşimin derinlemesine incelenmesini sağlar. Kemoterapötik ajanlar ve iyonlaştırıcı radyasyon da dahil olmak üzere birçok kanser terapötik etkisi sınırlı dır veya güçlü belirli hücre döngüsü aşamalarına göre değişir, korelasyon analizleri tedavi etkilerini değerlendirmek için sağlam ve uygulanabilir bir yöntem güveniyor hücre döngüsüne özgü bir şekilde DNA üzerinde. Bu tek uç nokta lı denemeler ve sunulan yöntemin önemli bir avantajı ile mümkün değildir. Yöntem herhangi bir hücre hattı ile sınırlı değildir ve iyice tümör ve normal doku hücre hatları çok sayıda test edilmiştir. Çevresel risk faktörü değerlendirmesi, ilaç taraması ve tümör hücrelerindeki genetik istikrarsızlığın değerlendirilmesi de dahil olmak üzere radyo-onkolojinin yanı sıra onkolojinin birçok alanında kapsamlı bir genotoksisite teşbesi olarak yaygın olarak uygulanabilir.

Giriş

Onkolojinin amacı normal hücrelere zarar vermeden kanser hücrelerini öldürmek veya inaktive etmektir. Birçok tedaviler ya doğrudan ya da dolaylı olarak kanser hücrelerinde genotoksik stres neden, ama aynı zamanda bazı normal hücrelerde genişletmek. Kemoterapi veya hedefli ilaçlar genellikle radyasyonlu tümör 1 radyosensitivite artırmak için radyoterapi ile birleştirilir1,2,3,4,5, hangi bir azalma sağlar normal doku hasarı en aza indirmek için radyasyon dozu.

Iyonlaştırıcı radyasyon ve diğer genotoksik ajanlar, baz modifikasyonları, iplikçik çapraz bağlantıları ve tek veya çift iplikçikli kırılmalar da dahil olmak üzere farklı türde DNA hasarına neden olur. DNA çift iplikçiksi sonları (DSB' ler) en ciddi DNA lezyonlarıdır ve indüksiyonları radyokemoterapide iyonlaştırıcı radyasyon ve çeşitli sitostatik ilaçların hücre öldürücü etkisinin anahtarıdır. DSB'ler sadece genomun bütünlüğüne zarar vermekle kalmıyor, aynızamanda mutasyonların oluşumunu teşvik 6,7. Bu nedenle, farklı DSB onarım yolları, ve mekanizmalar apoptoz gibi onarılamaz hasarlı hücreleri ortadan kaldırmak için evrim sırasında geliştirilmiştir. Tüm DNA hasar yanıtı (DDR) DNA hasarı tanıma ve hücre döngüsü tutuklama DNA onarımı için izin vermek için ulaşmak sinyal yolları karmaşık bir ağ tarafından düzenlenir, programlanmış hücre ölümü veya inaktivasyon onarım başarısızlık durumunda8.

Sunulan akış sitometrik yöntemi, DSB indüksiyon ve onarımının yanı sıra onarım arızalarının sonuçlarını kapsayan kapsamlı bir analizde genotoksik stresten sonra DDR'yi araştırmak için geliştirilmiştir. Yaygın olarak uygulanan DSB marker γH2AX'ın ölçümü ile hücre döngüsünün analizi ve apoptozin indüksiyonu, klasik subG1 analizi ve caspase-3 aktivasyonunun daha spesifik değerlendirilmesi ile birleştirir.

Bu uç noktaların tek bir teşrindeki birleşimi sadece zaman, işçilik ve maliyet giderlerini azaltmaz, aynı zamanda hücre döngüsüne özgü DSB indüksiyon ve onarım ölçümünün yanı sıra caspase-3 aktivasyonunu da sağlar. Bu tür analizler bağımsız olarak yapılan tahlillerle mümkün değildir, ancak genotoksik stres sonrası DNA hasar yanıtının kapsamlı bir şekilde anlaşılması için son derece önemlidir. Birçok anti-kanser ilaçları, sitostatik bileşikler gibi, hücreleri bölen karşı yönlendirilir ve verimlilik güçlü hücre döngüsü aşamasına bağlıdır. Farklı DSB onarım süreçlerinin durumu da hücre döngüsü aşaması ve onarım doğruluğu için kritik olan yol seçimi bağlıdır ve sırayla hücre nin kaderini belirler9,10,11, 12. Yıl. Buna ek olarak, DSB düzeylerinin hücre döngüsüne özgü ölçümü havuzlu analizden daha doğrudur, çünkü DSB düzeyleri sadece bir genotoksik bileşiğin veya radyasyonun dozuna değil, aynı zamanda hücrenin DNA içeriğine de bağlıdır.

Bu yöntem glioblastoma13 direnç mekanizmaları aşmak için farklı radyoterapilerin etkinliğini karşılaştırmak ve osteosarkom 14,15 iyonlaştırıcı radyasyon ve hedefli ilaçlar arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılmıştır ve atipik teratoid rabdoid kanserler16. Ayrıca, açıklanan yöntem yaygın olarak mezenkimal kök hücreler üzerinde radyo ve kemoterapi yan etkilerini analiz etmek için kullanılmıştır17,18,19,20,21, 22,23,24, tedavikaynaklı normal doku hasarının onarımı için gerekli olan ve rejeneratif tıpta potansiyel bir uygulama var.

Protokol

1. Hazırlık

  1. Başlangıç malzemesi olarak her türlü kültür kabında ≥1 x 105 hücre/örnek hazırlayın.
    1. Örneğin, U87 glioblastoma hücrelerinin iyonlaştırıcı radyasyona maruz kaldıktan sonra bir zaman-ders deneyi gerçekleştirin: T25 şişelerinde her zaman noktası için alt kondronlu U87 hücrelerini ışınlayın. DSB onarımının kinetiklerini (γH2AX seviyesi) ve geç zaman noktalarını (24 saat 96 saate kadar) takip etmek için kalıntılar, hücre döngüsü etkileri ve apoptozu değerlendirmek için erken zaman noktalarını (ışınlamadan sonra 8 saate kadar 15 dk) seçin.
      NOT: Protokol ışınlama deneyleri veya belirli bir hücre hattı ile sınırlı değildir. Farklı türlerden ve çeşitli tedavi koşullarından her türden çok sayıda hücre hattı ile test edilmiştir.
  2. %10 fazla hacim de dahil olmak üzere aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
    1. Fosfat tamponlu salinde (PBS) %4,5 paraformaldehit (PFA) oluşan fiksasyon çözeltisi numunesi başına 2 mL hazırlayın. Çözümü taze hazırlayın. Duman kaputunun altında yavaş karıştırarak 80 °C'ye ısıtarak PBS'de PFA'yı seyreltin. Isı kaybını önlemek için şişeyi alüminyum folyo ile kapatın. Çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve son hacmi ayarlayın. Bir katlanmış selüloz filtre, grade 3hw (Malzemeler Tablosubakınız) ile çözüm geçirin.
      DİkKAT: PfA dumanları zehirlidir. Bu adımı bir duman başlığı altında gerçekleştirin ve PfA atıklarını uygun şekilde atın.
    2. -20 °C'de buz gibi H2O. Deposunda %70 etanolden oluşan permeabilizasyon çözeltisi numunesi başına 3 mL hazırlayın.
    3. PBS'de %0,5 büyükbaş serum albuminden (BSA) oluşan yıkama çözeltisi numunesi başına 7 mL hazırlayın.
    4. PBS'de %3 BSA numunesi başına 100 μL'yi antikor dilüent olarak hazırlayın.
    5. PBS'de 1 μg/mL 4',6-diamidin-2-phenylindol (DAPI) oluşan DNA boyama çözeltisi numunesi başına 100-250 μL hazırlayın.
  3. Santrifüju 15 mL tüpler için 200 x g ve 7 °C'de 5 dk'ya ayarlayın. Santrifüj soğumaya bırakın ve tüm santrifüj adımları için bu ayarları kullanın.

2. Örnek Toplama

  1. Yapışık hücrelerin işlenmesi (örneğin, U87 glioblastoma hücreleri T25 şişelerinde 5 mL ile Yetiştirilen Ve Dulbecco'nun modifiye Kartal'ın 37 °C'de %10 fetal sığır serumu ve %5 karbondioksit atmosferi ile desteklenmiş sayılsa), 2.1.1 adımlarıyla devam edin. ve 2.1.2. Süspansiyon hücreleri için doğrudan adım 2.1.2 devam edin.
    1. Bir santrifüj tüpü nde orta toplayın. Hücreleri tripsin, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) veya diğer hücre ayırma ajanlarının kullanımını içerebilen rutin bir hücre kültürü yöntemi kullanarak ayırın.
      1. U87 hücreleri için, prewarm PBS ve tripsin/EDTA (Malzeme Tablosunabakınız) 37 °C'ye, hücre tabakasını 1 mL PBS ile yıkayın, hücreleri 1 mL tripsin/EDTA ile 1 mL'lik kuluçkaya yatırın ve şişeye dokunarak hücre ayrıştırmasını destekleyin. Tüm yıkama çözeltisi ve orta ile tüp hücre süspansiyon toplayın.
    2. Hücreleri santrifüj edin, ortayı atın ve PBS'nin 1 mL'sinde hücreleri yeniden askıya alın.
  2. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı pipet ve fiksasyon çözeltisi 2 mL ile bir tüp içine hücre süspansiyon transfer (4.5% PFA / PBS, 3% son konsantrasyon).
    DİkKAT: PfA dumanları zehirlidir. Bu adımı bir duman başlığı altında gerçekleştirin ve PfA atıklarını uygun şekilde atın.
  3. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. Hücreleri santrifüj ve decantation tarafından supernatant atın.
  5. Tüpüzerine dokunarak hücre pelet gevşetin ve% 70 etanol 3 mL hücreleri yeniden askıya. Doğrudan bir sonraki adıma geçin veya numuneleri 4 °C'de birkaç haftaya kadar saklayın.

3. Yıkama ve Boyama

  1. Hücreleri santrifüj ve decantation tarafından supernatant atın.
  2. Tüpüzerine dokunarak hücre pelet gevşetin. Yıkama çözeltisi 3 mL hücreleri resuspend (0.5% BSA / PBS), santrifüj ve supernatant atın.
  3. Yıkama adımını 3 mL, 1 mL yıkama çözeltisi ile 1x tekrarlayın. Son adımda, pipetting tarafından dikkatle supernatant atın. Pelet aspire değil dikkat edin.
  4. Antikorları γH2AX, fosfo-histon H3 (Ser10) ve caspase-3 (Malzeme Tablosuna bakınız) karşı 100 μL/numunede antikor dilüentli (%3 BSA/PBS) karşı seyreltin.
  5. Hücre peletini tüpe dokunarak gevşetin ve 3.4 adımda hazırlanan antikor solüsyonunun 100 μL'sinde hücreleri yeniden askıya alın. Bu adımdan itibaren örnekleri karanlıkta tutun.
  6. Örnekleri oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
  7. Hücreleri santrifüj edin ve pipetting tarafından dikkatle supernatant atın. Pelet aspire değil dikkat edin.
  8. Hücre peletini tüpe dokunarak gevşetin ve 100-250 μL DNA boyama çözeltisi (1 μg/mL DAPI/PBS) ile hücreleri yeniden askıya alın.
    1. 1-2 x105 hücre varsa 100 μL kullanın ve daha yüksek hücre numaraları (≥1 x 106 hücre için 250 μL) için hacmi artırın. Doğrudan bir sonraki adıma geçin veya numuneleri karanlıkta 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
      NOT: DAPI konsantrasyonu optimize bazı hücre türleri için hücre döngüsü aşamalarının ayrılmasını artırmak için yardımcı olabilir.
  9. Örnekleri, 35 μm mesh gözenek boyutuna sahip bir numune tüpünün hücre süzgeci kapağından geçirin.

4. Ölçüm

  1. Örnekleri buza yerleştirin, tablo 1'e göre optik kurulumla yapılandırılan akış sitometresini başlatın (Malzeme Tablosu'na bakın). Gerekirse ultraviyole lazeri (355 nm dalga boyu) ayrı ayrı açın ve uygun yazılımı kullanarak gücü 10 mW'a ayarlayın.
  2. Satın alma yazılımını açın (Bkz. MalzemeTablosu), oturum açın ve Tarayıcı araç çubuğundaki Yeni Deneme düğmesini tıklatarak yeni bir deneme oluşturun.
  3. Denemenin adını özelleştirmek için Denetçi penceresini kullanın ve çizim ekranı için '5 Günlük On Yıl' seçeneğini belirleyin.
  4. Tarayıcı araç çubuğundaki Yeni Örnek düğmesini tıklatın ve ilk Tüpügöstermek için sol tarafındaki '+' simgesine tıklayarak yeni girişi genişletin. Numuneyi (örn. hücre türü) ve Tüpü (örnek tanımlayıcı) yeniden adlandırmak için ilgili simgeyi ve türü seçin. Yeşile çevirmek (etkin) açmak için ilk Tüpün Tube Pointer'ını (soldaki ok benzeri sembol) tıklatın.
  5. Sitometre penceresindeki Parametreler sekmesini açın ve Tablo 1'e göre parametreleri seçin. Tüm gereksiz parametreleri silin.
    NOT: Parametre adları özel hazır ayarlara bağlı olarak değişebilir (örneğin, Alexa555 yerine Cy3). Seçimin Tablo1'deki optik filtreler ve dedektörlerle eşleştiğinden emin olun. Tüm floroforların ışık yolları bu kurulumda tamamen bağımsızdır ve spektral örtüşme telafisi gerekli değildir; ancak, başka bir optik kurulum kullanılırsa gerekli olabilir.
  6. Çalışma Sayfası penceresini açın ve Şekil1'e göre çizimler oluşturun. İlgili araç çubuğu düğmelerini kullanarak 2 nokta çizimi ve 4 histogram çizin ve uygun parametreleri (ön dağılım (FSC-A) karşı yan dağılım (SSC-A), DAPI-W ve DAPI-A için bir histogram ve her antikor birleştiğinde seçmek için eksen etiketlerini tıklatın florofor.
  7. Sitometreye bir kontrol örneği takın ve cihazın üzerindeki Çalıştır düğmesine basın. Yazılımın Tarayıcı penceresindeki ilk tüpü seçin ve Edinme Panosundaki Veri Kazan düğmesini tıklatın. Düşük, Orta veya Yüksek düğmeleri ve alet üzerindeki ince ayar tekerleğikullanarak numune enjeksiyon hacmini ayarlayın. Tercihen Düşük ayarda çalışın, ancak en az 100 etkinlik/saniye edinmeye çalışın (Bkz. EdinmePanosu).
  8. Şekil 1'deki nokta çizimlerini kılavuz olarak kullanarak Denetçi penceresinin Parametreler sekmesinde FSC, SSC ve DAPI için dedektör gerilimlerini ayarlayın. Hücre popülasyonu doğrusal ölçekte çok dağınık görünüyorsa FSC ve SSC parametreleri için logaritmik skalaya geçin.
  9. Sitometredeki Bekleme düğmesine basın ve yazılımdaki çalışma sayfası kurulumuna devam edin.
    1. DAPI-W ve DAPI-A çizimindeki SingleCells popülasyonunu tanımlamak için FSC-A ve SSC-A çizimindeki Hücre popülasyonu ve Dikdörtgen Kapı aracını tanımlamak için Çokgen Kapısı aracını kullanın. Nüfus Hiyerarşisini göstermek için Ctrl + G tuşlarına basın ve bunları yeniden adlandırmak için varsayılan kapı adlarını tıklatın.
    2. Daha sonra tüm histogramlara sağ tıklayın ve Popülasyonları Göster'i seçin | Bağlam menüsünden SingleCells.
  10. Daha sonra kontrol ve tedavi örnekleri elde ederek tam dinamik aralığı kapsayacak şekilde antikor birleştiği floroforlar için dedektör voltajlarını optimize edin. Sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarın ve dedektör doygunluğundan kaçının. SingleCells popülasyonundaki Alexa488 zirvesinin ne kontrolde ne de tedavi edilen örnekte kesildikdiğinden emin olun.
  11. Sitometredeki Bekleme düğmesine basın ve numune alımı sırasında tedavi etkilerihakkında kabaca bir tahmin elde etmek için yazılımın Çalışma Sayfası penceresinde isteğe bağlı olarak 4.11.1-4.11.3 adımlarını gerçekleştirin.
    1. Nüfus Hiyerarşisi'nde SingleCells'i seçin ve DAPI-W ile DAPI-A çizimindeki G1 popülasyonunu tanımlamak için Dikdörtgen Kapı aracını kullanın. Alexa488 histogram sağ tıklayın ve Nüfus göster seçin | Bağlam menüsünden G1.
    2. Alexa488 histogramına sağ tıklayın ve bağlam menüsünden İstatistik Görünümü Oluştur'u seçin. İstatistik Görünümü'ne sağ tıklayın ve İstatistik Görünümü'niEdit'i seçin. İstatistikler sekmesine gidin ve G1 popülasyonundaki Alexa488 sinyalinin ortancası için onay kutusunu etkinleştirin (diğer tüm seçenekleri devre dışı bırakın).
    3. Nüfus Hiyerarşisi'ndeki SingleCells'i seçin ve DAPI-A, Alexa555-A (Şekil 1'deki Cy3-A) alt G1 , M ve Casp3+ popülasyonlarını tanımlamak için Interval Gate aracını kullanın ve Alexa647-A histogramları.
  12. Sitometredeki Çalıştır düğmesine basın ve yazılımdaki Edinme Panosu'nu kullanarak örnekleri ölçün. Durdurma kapısını Tüm olaylara veya Hücreler kapısına (çok sayıda küçük parçacık varsa) ve kaydedilecek olay sayısını 10.000'e ayarlayın.
  13. Yeni bir örnek oluşturmak için Sonraki Tube'u tıklatın, tarayıcı penceresinde yeniden adlandırın, satınalma başlatmak için Veri Edinin'i tıklatın ve kaydetmeye başlamak için Verileri Kaydet'i tıklatın.
  14. Dosya Yı Seçin | İhracat | Menü çubuğundan denemeler yapın ve verileri '.fcs' dosyaları olarak kaydetmek için iletişim kutusunda Dizin Dışa Aktar'ı seçin. Denemenin daha sonraki bir noktada yeniden içe aktarılmasını sağlamak için denemeyi isteğe bağlı olarak ek bir zip dosyası olarak kaydedin.
    NOT: Varolan denemelerin kurulumu Düzenle | Veri olmadançoğaltma.

5. Veri Değerlendirmesi

  1. '.fcs' dosyalarını akış sitometrik analiz yazılımının örnek tarayıcısına sürükleyin ve bırakın (bkz. Malzeme Tablosu). Şekil2'de gösterilen gating stratejisini uygulayın. Bir sonraki kız kapısına geçmeden önce kapıların tüm örneklerdeki ilgili popülasyona uyduğunu unutmayın.
    1. Tüm örneklere değişiklik uygulamak için, örnek tarayıcıda değiştirilen kapıyı seçin, Ctrl + Ctuşuna basarak kopyalayın, ana kapıyı seçin, tüm örneklerdeki eşdeğer düğümleri seçmek için Ctrl + Shift + E tuşuna basın ve yapıştırmak veya üzerine yazmak için Ctrl + V tuşuna basın kapı. Grup kapılarını kullanmayın.
    2. SSC-A vs. FSC-A çizimini açmak için tarayıcıdaki ilk örneğe çift tıklayın. Analizden enkaz hariç, Hücre popülasyonu (Şekil2, çizim 1) tanımlamak için araç çubuğundaki Çokgen aracını kullanın. Geçidin, tedaviyle ilgili vardiyaları karşılamak için sağ üst köşeye doğru yeterince geniş olduğundan emin olun, ancak hücreyi güvenilir bir şekilde dışlamak için çizimin sol alt köşesine bakan sınırı kısıtlayın.
    3. Yeni bir çizim penceresi açmak için Hücreler kapısına çift tıklayın ve eksen etiketlerini tıklatarak eksenleri DAPI-W (dikey) ile DAPI-A (yatay) olarak değiştirin. TekHücre popülasyonunu tanımlamak için Dikdörtgen aracını kullanın (Şekil2,çizim 2), hücre çiftleri veya kümeleri hariç (G1 hücrelerinin doublet'leri G2 ve M hücreleriyle aynı DAPI-A yoğunluğuna sahiptir, ancak çok daha yüksek bir DAPI-W değeri).
      NOT: Farklı örneklerdeki hücre sayılarının değişmesi, DAPI'nin DNA'ya denge seli nedeniyle genel DAPI-A sinyal gücünde kaymalara neden olur. Bu, hücre döngüsü çözümlemesi etkilemez, ancak bu vardiyaları hesaba katmak için tek hücreli geçit örneğinin doğru kenarlığı örnek tarafından ayarlanması gerekebilir.
    4. Yeni bir çizim penceresi açmak ve DAPI-A histogramını göstermek için eksenleri değiştirmek için SingleCells kapısına çift tıklayın. Normal DNA içeriğine (HücreDöngüsü popülasyonu) sahip tek hücreleri bozulmuş DNA'ya(subG1 popülasyonu) sahip apoptotik hücrelerden ayırmak için Bisector aracını kullanın. Daha sonra tarayıcıdaki yeni kapıları seçin ve ctrl + R tuşuna basın ve bunları buna göre yeniden adlandırmak için (Şekil2, çizim 3).
    5. Tarayıcıdaki CellCycle kapısını seçin ve Araç | Biyoloji | Hücre Döngüsü... hücre döngüsü modelleme aracını açmak için menü çubuğundan. G1, S ve G2/M fazındaki hücrelerin sıklığını tahmin etmek için Model bölümünde Dean-Jett-Fox25,26'yı seçin (Şekil2, çizim 4). Kısıtlamaları yalnızca düşük modelleme performansı durumunda kullanın (model ve veriler arasındaki Kök Ortalama Kare sapması en aza indirin).
    6. Hücre döngüsüne özgü γH2AX ölçümü sağlamak için DAPI-W ve DAPI-A konusu olan Hücre Döngüsü popülasyonunda G1 (Elips aracı), S (Polygon aracı) ve G2 + M (Elips aracı) fazı için kapılar oluşturun ( Şekil 2, arsa 5). Bu yanlış olabilir gibi, DAPI-A histogram dayalı otomatik hücre döngüsü gating için modelleme aracı kullanmayın.
      NOT: Genel DAPI sinyal gücünde yukarıda belirtilen kaymaları hesaba katmak için kapıları niçin ÖRNEK le DAPI-A ekseni numunesi boyunca taşımak gerekebilir. Sadece bir grup olarak üç kapı hareket ve önyargı önlemek için tek tek kapıların şeklini değiştirmeyin.
    7. Hücre Döngüsü popülasyonunun Alexa555-A histogramındaki fosfo-histon H3-pozitif(M) ve -negatif(M-)hücrelerini ayırt etmek için Bisector aracını kullanın (Şekil2, çizim 6). Ctrl tuşuna basılı tutun ve G2 + M ve M-kapılarını seçin. G2 (G2+M & M-) kapısını oluşturmak için Ctrl + Shift + A tuşuna basın.
    8. TekHücre popülasyonunun Alexa647-A histogramındaki caspase-3-pozitif(Casp3+) ve -negatif(Casp3-) hücrelerini ayırt etmek için Bisector aracını kullanın (Şekil 2, çizim 7). İşlenmemiş kontrollerde Casp3+ popülasyonortalamasının yüksek hassasiyeti sağlamak ve asay-to-tsay varyasyonlarını en aza indirmek için %0,8'e tekabül edecek şekilde eşiği ayarlayın.
    9. Tablo Düzenleyicisini açmak ve Şekil3'e göre yapılandırmak için Ctrl + T tuşuna basın. Örnek tarayıcıdaki farklı popülasyonları Tablo Düzenleyicisi'ne sürükleyin ve bırakın ve istatistik, parametre ve ad ayarlarını değiştirmek için satırları çift tıklatın. Satırları seçerek ve Deltuşuna basarak hücre döngüsü modelleme simgesinin sürüp düşmesinden sonra otomatik olarak eklenen gereksiz satırları kaldırın.
    10. Menü şeridinin Çıktı bölümündeki biçim ve hedef dosyayı seçinve verileri '.xlsx' dosyası olarak dışa aktarmak için Tablo Oluştur'u tıklatın.
  2. Ek Dosya 1'e (FACS_Analysis_Template_(1).xlsx) göre daha fazla veri analizi için tablo hesaplama yazılımını (bkz. Malzeme Tablosu) kullanın.
    1. X' = X * 100 / Σ (tüm hücre döngüsü fazları) formülünü x' ile uygulayarak, farklı hücre döngüsü evrelerindeki hücrelerin frekanslarını düzeltin: düzeltilmiş değer, X: ham değer, her hücre döngüsü aşamasına.
      NOT: Hücre döngüsü modellemesindeki yanlışlıklar nedeniyle %100'lük bir toplamsapmalar meydana gelir, ancak genellikle küçüktür (<%5).
    2. S fazındaki değerleri 1,5 ve G2 ve M fazındaki değerleri 2,0'a bölerek farklı hücre döngüsü evrelerinde DNA içeriğine ortanca γH2AX yoğunluklarını normalleştirin.
    3. Tüm hücre popülasyonundaki kombine normalleştirilmiş γH2AX düzeyini hesaplamak için, IA = IG1 * G1 + IS * S * IG2 * G2 + IM * M, IA, IG1, IS, IG2, IM formüllerini kullanın tüm, G1, S, G2, M hücrelerinin sırasıyla median γH2AX yoğunlukları normalleştirilmiş ve G1, S, G2, M ilgili hücre döngüsü fazında hücrelerin sıklığı düzeltilir.
    4. Normalleştirilmiş γH2AX düzeyleri ve subG1 ve kaspas-3-pozitif hücrelerin sıklığı için, her örnekten işlenmemiş kontrollerin ortalama değerini çıkarın.
    5. Her parametrenin tüm çoğaltma örneklerinden ortalama ve standart sapmasını hesaplayın ve sonuçları diyagramlara dönüştürün.

Sonuçlar

İnsan U87 veya LN229 glioblastoma hücreleri 4 Gy foton veya karbon iyon radyasyonu ile ışınlandı. Hücre döngüsüne özgü γH2AX düzeyleri ve apoptoz, burada sunulan akış sitometrik yöntemi kullanılarak ışınlama dan sonra 48 saate kadar farklı zaman noktalarında ölçüldü (Şekil 3). Her iki hücre hattında da karbon iyonları daha yüksek γH2AX pik seviyelerini indükler ve aynı fiziksel dozdaki foton radyasyonuna kıyasla 24 ila 48 h'de önemli ölçüde yükselmiş...

Tartışmalar

Özellikli yöntem kullanımı kolaydır ve çift iplikçik break (DSB) indüksiyon ve onarım, hücre döngüsü etkileri ve apoptotik hücre ölümü de dahil olmak üzere DNA hasar yanıtı hızlı, doğru ve tekrarlanabilir ölçüm sunuyor. Bu uç noktaların birleşimi, bireysel tahlillerden daha fazla ilişki ortamı sağlar. Bu yöntem, radyasyon biyolojisi, tedavisi ve korunması alanlarında ve daha genel olarak onkolojide (örn. çevresel risk faktörü değerlendirmesi, ilaç taraması ve genetik değerlendir...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Alman Kanser Araştırma Merkezi'ndeki (DKFZ) Flow Sitometri Tesisi ekibine desteklerinden dolayı teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1,000 µL filter tipsNerbe plus07-693-8300
100-1,000 µL pipetteEppendorf3123000063
12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore sizeBD Falcon352235
15 mL tubesBD Falcon352096
200 µL filter tipsNerbe plus07-662-8300
20-200 µL pipetteEppendorf3123000055
4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)Sigma-AldrichD9542Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C
Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011BioLegend613406Dilute 1:20
Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414BD Pharmingen560626Dilute 1:20
BD FACSClean solutionBD Biosciences340345For cytometer cleaning routine after measurement
BD FACSRinse solutionBD Biosciences340346For cytometer cleaning routine after measurement
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)BiochromL 182Dissolve in water to 1x concentration
Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutaminBiochromFG 0415Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Ethanol absoluteVWR20821.330
Excel softwareMicrosoft
FBS Superior (fetal bovine serum)BiochromS 0615Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
FlowJo v10 softwareLLConline order
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples
Folded cellulose filters, grade 3hwNeoLab11416
LSRII or LSRFortessa cytometerBD Biosciences
MG132Calbiochem474787optional drug for apoptosis positive control
Multifuge 3SR+Heraeus
ParaformaldehydeAppliChemA3813Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter.
Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639Cell Signaling Technology#3475Dilute 3:200
PIPETBOY acu 2Integra Biosciences155 016
Serological pipettes, 10 mLCorning4488
Serological pipettes, 25 mLCorning4489
Serological pipettes, 5 mLCorning4487
SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand)BiomolAG-40T-0002-C020optional drug for apoptosis positive control
T25 cell culture flasksGreiner bio-one690160Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Trypsin/EDTAPAN BiotechP10-025500Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
U87 MG glioblastoma cellsATCCATCC-HTB-14Example cell line used in the protocol

Referanslar

  1. Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
  2. Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
  3. Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
  4. Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
  5. Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
  6. Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
  7. Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
  8. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  9. Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
  10. Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  11. Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
  12. Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
  13. Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
  14. Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
  15. Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
  16. Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
  17. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
  18. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
  19. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
  20. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
  21. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
  22. Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
  23. Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
  24. Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
  25. Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
  26. Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
  27. Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
  28. Meyer, B., Voss, K. -. O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  29. Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
  30. Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
  31. Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
  32. Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
  33. Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
  34. Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
  35. Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmaSay 151DNA ift iplik ik k r klarh cre d ng s da l mapoptosisDNA hasar yan tiyonla t r c radyasyonkarbon iyon radyasyonugenotoksik stresak sitometri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır