JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

השיטה המוצגת משלבת את הניתוח הכמותי של מעברי ה-DNA כפול סטרנד (DSBs), מחזור התא הפצה ו אפופטוזיס כדי לאפשר מחזור התא הערכה ספציפית של האינדוקציה DSBS ותיקון, כמו גם את ההשלכות של כשל בתיקון.

Abstract

השיטה המוצגת או גרסאות מעט שונה כבר המציאו ללמוד תגובות טיפול ספציפיות תופעות לוואי של טיפולים שונים נגד סרטן משמש אונקולוגיה קלינית. היא מאפשרת ניתוח כמותי ואורכי של התגובה נזק DNA לאחר הלחץ גנוטוקסי, כפי שנגרם על ידי הקרנות והמון תרופות נגד סרטן. השיטה מכסה את כל השלבים של תגובת ה-DNA התגובה, מתן נקודות קצה עבור אינדוקציה ותיקון של ה-DNA כפול הגדיל מעברי (DSBs), מעצר תא המעצר תא מוות על ידי אפופטוזיס במקרה של כשל בתיקון. שילוב מדידות אלה מספק מידע על השפעות הטיפול תלויי מחזור התא ובכך מאפשר מחקר מעמיק של הגומלין בין התפשטות הסלולר ומנגנוני ההתמודדות נגד נזק לדנ א. כמו ההשפעה של מtherapeutics סרטן רבים כולל סוכני כימותרפיה וקרינה מייננת מוגבל או משתנה מאוד על פי שלבים ספציפיים מחזור התא, מנתח הקורקורונים להסתמך על שיטה חזקה והומה להעריך את השפעות הטיפול ב-DNA באופן ספציפי למחזור התא. דבר זה אינו אפשרי עם בחני נקודת קצה אחת ויתרון חשוב של השיטה המוצגת. השיטה אינה מוגבלת לקו תא מסוים ונבדק ביסודיות בהמון שורות של תאים סרטניים ורקמות רגילות. זה יכול להיות מיושם באופן נרחב בתור שיטת הרעילות מקיפה בתחומים רבים של אונקולוגיה מלבד רדיו-אונקולוגיה, כולל גורם סיכון סביבתי הערכה, הקרנת סמים והערכה של אי-יציבות גנטית בתאי הגידול.

Introduction

המטרה של אונקולוגיה היא להרוג או להשבית תאים סרטניים מבלי לפגוע בתאים נורמליים. טיפולים רבים או ישירות או עקיף לגרום ללחץ גנוטוקסינים בתאים סרטניים, אבל גם כמה להאריך בתאים נורמליים. כימותרפיה או תרופות ממוקדות משולבים לעתים קרובות עם הקרנות כדי לשפר את רגישות הרדיו של הגידול לקרינה,1,2,3,4,5, אשר מאפשר ירידה של את המינון הרדיואקטיבי כדי למזער את הנזק לרקמות נורמלי.

קרינה מייננת וסוכנים גנוסיים אחרים לגרום סוגים שונים של נזק לדנ א, כולל שינויי בסיס, מרובי סטרנד והפסקות יחיד או כפול סטרנד. DNA מעברי הגדיל כפול (DSBs) הם נגעים DNA החמורה ביותר האינדוקציה שלהם הוא המפתח להשפעה הריגת תאים של קרינה מייננת ותרופות ציטוסטטי שונים בכימותרפיה רדיותרפיה. Dsbs לא רק לפגוע ביושרה של הגנום, אלא גם לקדם את היווצרות של מוטציות6,7. לכן, מסלולים תיקון DSB שונים, מנגנונים לחסל תאים פגומים באופן חסר תקנה כמו אפופטוזיס פיתחו במהלך האבולוציה. התגובה הנזק DNA כולו (DDR) מוסדר על ידי רשת מורכבת של איתות מסלולים המגיעים מ-DNA זיהוי נזק ומחזור תא מעצר כדי לאפשר תיקון DNA, למות תאים מתוכנתים או הפעלה במקרה של כשל תיקון8.

שיטת הזרימה המוצגת של סייטוטומטנה פותחה כדי לחקור את ה-DDR לאחר הלחץ הגנומי באחת השיטות המקיפות שמכסה את האינדוקציה והתיקון של DSB, כמו גם תוצאות כשל בתיקון. הוא משלב את המדידה של היישום הנרחב DSB סמן γH2AX עם ניתוח של מחזור התא אינדוקציה של אפופטוזיס, באמצעות ניתוח subG1 הקלאסי והערכה ספציפית יותר של caspase-3 הפעלה.

השילוב של נקודות קצה אלה באחד מה, לא רק מפחית את הזמן, העבודה והוצאות העלות, אלא גם מאפשר מדידה ספציפית של מחזור התא של האינדוקציה והתיקון של DSB, כמו גם הפעלת caspase-3. ניתוחים כאלה לא יהיה אפשרי עם שנערך באופן עצמאי, אבל הם רלוונטיים מאוד להבנה מקיפה של התגובה נזק לדנ א לאחר הלחץ גנוטוקסיד. תרופות רבות נגד סרטן, כגון תרכובות ציטוסטטי, מכוונים נגד חלוקת תאים והיעילות שלהם תלויה מאוד בשלב מחזור התא. הזמינות של תהליכי תיקון dsb שונים תלויה גם בשלב מחזור התא ובחירת מסלול שהיא קריטית לדיוק התיקון, ובתורו קובע את גורלו של התא9,10,11, . שתיים עשרה בנוסף, מדידה ספציפית למחזור תאים של רמות DSB מדויקת יותר מניתוח במאגר, מכיוון שרמות DSB אינן תלויות רק במינון של תרכובת מגנטית או קרינה, אלא גם בתוכן הדנ א של התא.

השיטה שימש כדי להשוות את היעילות של רדיותרפיות שונות כדי להתגבר על מנגנוני ההתנגדות ב גלינובלסטומה13 ולנתח את הגומלין בין קרינה מייננת תרופות ממוקדות אוסטאוסרקומה14,15 וסרטן השרירים הטיפוסי... בנוסף, השיטה המתוארת שימש רבות כדי לנתח תופעות לוואי של רדיו-וכימותרפיה על תאי גזע mesenchymal17,18,19,20,21, 22,23,24, אשר חיוניים לתיקון של טיפול המושרה נזק רקמות נורמלי יש יישום פוטנציאלי ברפואה רגנרטיבית.

Protocol

1. הכנה

  1. הכן ≥ 1 x 105 תאים/מדגם בכל סוג של כלי התרבות כחומר התחלתי.
    1. לדוגמה, התנהלות ניסוי זמן-קורס לאחר חשיפת התאים U87 גליסטומה לקרינה מייננת: Irradiate קרנת U87 תאים sub-confluent בצלוחיות T25 ב טרילקטים עבור כל נקודת זמן. בחר בזמן מוקדם נקודות (15 דקות עד 8 h לאחר ההקרנה) כדי לעקוב אחר קינטיקה של תיקון DSB (γH2AX level) ונקודות זמן מאוחר (24 h עד 96 h) כדי להעריך רמות DSB שיורית, השפעות מחזור התא ואפופטוזיס.
      הערה: הפרוטוקול אינו מוגבל לניסויי הקרנה או לקו תא ספציפי. הוא נבדק עם קווי תאים רבים מכל הסוגים, ממינים שונים ולתנאי טיפול שונים.
  2. הכן את הפתרונות הבאים כולל נפח עודף של 10%.
    1. הכינו 2 מ ל לכל מדגם של פתרון קיבעון המורכב מ-4.5% פאראפורמלדהיד (בתחתית) בתמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS). . הכן את הפתרון טרי באמצעות חימום ל-80 מעלות צלזיוס, מתחת למכסה המנוע, יש לדלל את הג. לכסות את הבקבוקון עם רדיד אלומיניום כדי למנוע אובדן חום. תן לפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר ולהתאמת אמצעי האחסון הסופי. להעביר את הפתרון דרך מסנן תאית מקופל, כיתה 3hw (לראות את הטבלה של חומרים).
      זהירות: . אדי הכדורגלן רעילים בצעו שלב זה תחת מכסה המנוע והיפטרו מפסולת הרחוב בהתאם.
    2. הכינו 3 מ ל לכל מדגם של פתרון חדירות המורכב מ-70% אתנול בקרח קר H2O. Store ב-20 ° c.
    3. הכינו 7 מ ל לכל מדגם של פתרון כביסה המורכב מ-0.5% בסרום (BSA) בערוץ הPBS.
    4. להכין 100 μL לכל מדגם של 3% BSA ב-PBS כמו מדלל נוגדן.
    5. להכין 100-250 μL לכל מדגם של פתרון כתמים DNA המורכב 1 μg/mL 4, 6-diamidin-2-פניינידול (DAPI) ב PBS.
  3. הגדר את הצנטריפוגה עבור 15 צינורות mL ל 5 דקות ב 200 x ו -7 ° c. תן את הצנטריפוגה להתקרר ולהשתמש הגדרות אלה עבור כל השלבים צנטריפוגה.

2. אוסף דוגמאות

  1. אם עיבוד תאים מחסיד (למשל, U87 גליובלסטומה של תאים גדל ב T25 מבחנות עם 5 מ ל של מדיום שונה של הנשר של דולבקה שנוספו עם 10% סרום העוברי העובר ב 37 ° צ' ו 5% פחמן דו חמצני אווירה), להמשיך עם שלבים 2.1.1. ו2.1.2. עבור תאים ההשעיה להמשיך ישירות לשלב 2.1.2.
    1. לאסוף את המדיום בצינור צנטריפוגה. נתק את התאים באמצעות שיטה של תרבות תא שגרתית, העשויה לכלול את השימוש בטריפסין, בחומצה האצתית (EDTA) או בסוכני ניתוק תאים אחרים.
      1. עבור תאים U87, לחמם את PBS ו טריפסין/EDTA (לראות את הטבלה של חומרים) עד 37 ° c, לשטוף את שכבת התא עם 1 מ ל של PBS, דגירה את התאים עבור 1-2 דקות עם 1 מ ל טריפסין/edta ותמיכה תא הניתוק על ידי הקשה על הבקבוקון. לאסוף את כל הפתרונות כביסה ואת ההשעיה התא בצינור עם המדיום.
    2. צנטריפוגה את התאים, למחוק את המדיום ולהשעות מחדש את התאים 1 מ ל של PBS.
  2. Pipet התאים למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח השעיה תא בודד ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינור עם 2 מ ל של פתרון קיבעון (4.5% התחתית/PBS, 3% הריכוז הסופי).
    זהירות: . אדי הכדורגלן רעילים בצעו שלב זה תחת מכסה המנוע והיפטרו מפסולת הרחוב בהתאם.
  3. דגירה את התאים 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. צנטריפוגה את התאים והשמט את הסופרנטנט באמצעות שפייה.
  5. שחרר את הגלולה על ידי הקשה על הצינור להשעות מחדש את התאים 3 מ ל של 70% אתנול. המשך ישירות עם השלב הבא או אחסן את הדגימות ב-4 ° צ' למשך עד מספר שבועות.

3. כביסה וכתמים

  1. צנטריפוגה את התאים והשמט את הסופרנטנט באמצעות שפייה.
  2. שחרר את הגלולה הסלולרית באמצעות הקשה על השפופרת. להשעות את התאים ב 3 מ ל של פתרון כביסה (0.5% BSA/PBS), צנטריפוגה ולמחוק את הסופרנטאנט.
  3. חזור על שלב כביסה 1x עם 3 מ ל, ולאחר מכן 1x עם פתרון כביסה 1 mL. בשלב האחרון, מחק את הסופרנטנט בזהירות על ידי ליטוף. . תדאג לא להוריד את הגלולה
  4. לדלל את הנוגדנים נגד γH2AX, פוספהו-histone H3 (Ser10) ו caspase-3 (לראות את הטבלה של חומרים) ב 100 μl/מדגם עם נוגדן דילול (3% BSA/PBS).
  5. שחרר את הגלולה התא על ידי הקשה על הצינור ולהשעות מחדש את התאים ב-100 μL של פתרון הנוגדן שהוכן בשלב 3.4. השאר את הדגימות בחשכה משלב זה ואילך.
  6. מודב את הדגימות בטמפרטורה. של 1 שעות בחדר
  7. צנטריפוגה את התאים ולמחוק את הסופרנטאנט בזהירות על ידי ליטוף. . תדאג לא להוריד את הגלולה
  8. לשחרר את הגלולה התא על ידי הקשה על הצינור ולהשעות מחדש את התאים ב-100-250 μL של פתרון בצביעת DNA (1 μg/mL DAPI/PBS).
    1. השתמש 100 μL אם 1-2 x105 תאים קיימים ולהגדיל את עוצמת הקול עבור מספרי תאים גבוהים יותר (250 μl עבור ≥ 1 x 106 תאים). המשיכו ישירות עם השלב הבא או אחסנו את הדגימות בחשכה ב -4 ° c עד 2 שבועות.
      הערה: עבור סוגי תאים מסוימים מיטוב ריכוז DAPI יכול לעזור לשפר את הפרדת השלבים של מחזור התא.
  9. Pipet דגימות דרך הכובע מסננת התא של צינור מדגם עם גודל נקבובית של שינוי של 35 μm.

4. מדידה

  1. מניחים את הדגימות על הקרח, להתחיל את cytometer הזרימה (לראות את הטבלה של חומרים) מוגדר עם התקנה אופטית לפי לוח 1 ולחץ על הלחצן הראשי . אם נדרש, להחליף את הלייזר האולטרה סגול (355 ננומטר גל) בנפרד ולהגדיר את הכוח ל 10 mW באמצעות התוכנה המתאימה.
  2. פתח את תוכנת הרכישה (ראה טבלת חומרים), היכנס למערכת וצור ניסוי חדש על-ידי לחיצה על לחצן הניסוי החדש בסרגל הכלים של הדפדפן.
  3. השתמש בחלון המפקח כדי להתאים אישית את שם הניסוי ובחר ' 5 יומן רישום עשורים ' עבור תצוגת התוויה.
  4. לחץ על לחצן הדגימה החדשה בסרגל הכלים של הדפדפן והרחב את הערך החדש על-ידי לחיצה על סימן ' + ' בצידו השמאלי כדי להציג את השפופרת הראשונה. בחר את הסמל המתאים והקלד כדי לשנות את שם המדגם (למשל, סוג תא) ואת הצינור (מזהה דגימה). לחץ על מצביע הצינור של הצינורית הראשונה (סמל בדומה לחץ משמאל) כדי להפוך אותו לירוק (פעיל).
  5. פתח את הכרטיסיה פרמטרים בחלון cytometer ובחר את הפרמטרים לפי לוח 1. מחק את כל הפרמטרים המיותרים.
    הערה: שמות הפרמטרים עשויים להשתנות בהתאם להגדרות הקבועות מראש המותאמות אישית (לדוגמה, Cy3 במקום Alexa555). ודא שהבחירה תואמת למסננים ולגלאים האופטיים בטבלה 1. שבילי האור של כל fluorophores הם עצמאיים לחלוטין התקנה זו פיצוי של חפיפה ספקטרלית אינו נדרש; עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בכך אם נעשה שימוש בכיוונון אופטי אחר.
  6. פתח את חלון גליון העבודה וצור מגרשים לפי איור 1. צייר 2 מגרשים ו 4 היסטגרמות באמצעות הלחצנים המתאימים בסרגל הכלים ולחץ על תוויות הציר כדי לבחור את הפרמטרים המתאימים (פיזור קדמי (FSC-A) לעומת פיזור הצד (מהאס-אס-אס), DAPI-W לעומת DAPI-A ו היסטוגרמה עבור DAPI-A וכל נוגדן מצמידים . בסדר, שיהיה
  7. צרף דגימת בקרה לציטוטומטר ולחץ על כפתור ההפעלה על המכשיר. בחר את הצינורית הראשונה בחלון הדפדפן של התוכנה ולחץ על לחצן רכישת נתונים בלוח המחוונים לרכישה. כוונן את עוצמת ההזרקה לדוגמה באמצעות הלחצנים נמוך, בינוני או גבוה וגלגל הכוונון העדין במכשיר. רצוי לעבוד בהגדרה נמוכה , אך נסו לרכוש לפחות 100 אירועים/שנייה (ראו לוח מחוונים לרכישה).
  8. התאם את המתח הגלאי עבור FSC, מדינת האס-אס ו-DAPI בכרטיסיה פרמטרים של חלון המפקח באמצעות מחלקות הנקודה באיור 1 כמנחה. עבור לקנה מידה לוגריתמי עבור הפרמטרים של FSC ו-אס. אס. אם אוכלוסיית התא מופיעה מפוזרת מדי בקנה מידה ליניארי.
  9. לחץ על לחצן ' המתנה ' בציטוטומטר והמשך בהתקנת גליון העבודה בתוכנה.
    1. השתמש בכלי ' שער מצולע ' כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים בחלקה fsc-a לעומת מחלקת האס-אס-אס והכלי שער המלבן כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים המרובים ב-Dapi-W לעומת ההתוויה של Dapi-a. הקש Ctrl + G keys כדי להציג את הירארכיית האוכלוסיה ולחץ על שמות השערים המהווים ברירת מחדל כדי לשנות את שמם.
    2. לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על כל היסטגרמות ובחר הצג אוכלוסיות | תאים בלבד מהתפריט תלוי-ההקשר.
  10. למטב את המתח גלאי עבור הנוגדן מצמידים fluorophores כדי לכסות את טווח דינמי מלא על ידי רכישת שליטה לאחר מכן דגימות. למקסם את היחס אות לרעש ולהימנע הרוויה גלאי. ודא שהשיא Alexa488 באוכלוסיה בלבד של תאים אינו נחתך בפקד ולא במדגם שטופל.
  11. לחץ על לחצן המתנה על cytometer ובאופן אופציונלי לבצע שלבים 4.11.1-4.11.3 בחלון גליון העבודה של התוכנה כדי לקבל אומדן מחוספס של אפקטי הטיפול במהלך רכישת לדוגמה.
    1. בחר באפשרות ' תאים בלבד ' בהירארכיית האוכלוסיה והשתמש בכלי ' שער מלבן ' כדי להגדיר את אוכלוסיית G1 ב-dapi-W לעומת ההתוויה של dapi-A. לחצו לחיצה ימנית בהיסטוגרמה Alexa488 ובחרו באפשרות ' הצג אוכלוסיות ' | G1 מהתפריט תלוי-ההקשר.
    2. לחצו לחיצה ימנית בהיסטוגרמה Alexa488 ובחרו ' צור תצוגת סטטיסטיקה ' מהתפריט תלוי-ההקשר. לחצו לחיצה ימנית בתצוגת הסטטיסטיקה ובחרו ' עריכת תצוגת סטטיסטיקה '. עבור אל הכרטיסיה סטטיסטיקה והפעל את תיבת הסימון עבור החציון של אות Alexa488 באוכלוסיה של G1 (בטל את כל האפשרויות האחרות).
    3. בחר באפשרות ' תאים בלבד ' בהירארכיית האוכלוסיה והשתמש בכלי שער מרווח כדי להגדיר את האוכלוסיות subG1, M ו- Casp3 + ב-dapi-a, Alexa555-a (Cy3-a באיור 1) ו Alexa647...
  12. לחץ על לחצן הפעלה על cytometer ולמדוד את הדגימות באמצעות לוח המחוונים לרכישת בתוכנה. הגדר את שער העצירה לכל האירועים או לשער התאים (אם קיימים חלקיקים קטנים רבים) ומספר האירועים שיש לרשום ל-10,000.
  13. לחץ על השפופרת הבאה כדי ליצור מדגם חדש, שנה את שמו בחלון הדפדפן, לחץ על רכישת נתונים כדי להתחיל את הרכישה ולהקליט נתונים כדי להתחיל בהקלטה.
  14. בחר קובץ | ייצוא | ניסויים משורת התפריטים ובחרו ' ייצוא ספריות ' בתיבת הדו כדי לשמור את הנתונים כקבצי '. fcs '. באפשרותך לשמור את הניסוי כקובץ zip נוסף אם לאפשר ייבוא מחדש של הניסוי בנקודת זמן מאוחרת יותר.
    הערה: הכיוונון של ניסויים קיימים ניתן לשימוש חוזר בקלות עם עריכת | שכפל ללא נתונים.

5. הערכת נתונים

  1. גרור ושחרר את הקבצים '. fcs ' לתוך הדפדפן לדוגמה של תוכנת הניתוח של הזרימה cy, (ראה טבלת חומרים). החל את אסטרטגיית הפעולה המוצגת באיור 2. ודאו שהשערים מתאימים לאוכלוסייה המתאימה בכל הדגימות לפני שממשיכים עם שער הבת הבא.
    1. כדי להחיל שינויים על כל הדגימות, בחר את השער שהשתנה בדפדפן לדוגמה, העתק אותו על-ידי הקשת ctrl + C, בחר את שער האב, הקש ctrl + Shift + E כדי לבחור את הצמתים המקבילים בכל הדגימות ולאחר מכן הקש ctrl + V כדי להדביק או להחליף השער . אל תשתמשו בשערי הקבוצה
    2. לחץ פעמיים על המדגם הראשון בדפדפן כדי לפתוח את העלילה של מחלקת הקרקע לעומת FSC-a. השתמש בכלי מצולע בסרגל הכלים כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים (איור 2, עלילה 1), ללא הריסות מהניתוח. ודא שהשער רחב מספיק לכיוון הפינה הימנית העליונה כדי להתאים למשמרות הקשורות לטיפול, אך הגבל את הגבול הפונה לפינה השמאלית התחתונה של העלילה כדי לשלול באופן אמין את התא.
    3. לחץ פעמיים על שער התאים כדי לפתוח חלון עלילה חדש ולשנות את הצירים ל-Dapi-W (אנכי) לעומת Dapi-a (אופקי) על-ידי לחיצה על תוויות הצירים. השתמש בכלי מלבן כדי להגדיר את האוכלוסיה של תאים בלבד (איור 2, עלילה 2), למעט כמות התאים או הגושים של הניתוח (כמות התאים של G1 כוללים את אותה עוצמת Dapi-A כתאים של G2 ו-M, אבל Dapi גבוה במידה ניכרת-W ערך).
      הערה: ספירת תאים משתנים בדגימות שונות תגרום לשינויים ב-DAPI הכולל-עוצמת אות בשל הכריכה השיווי משקל של DAPI ל-DNA. פעולה זו לא תשפיע על ניתוח מחזור התא, אך ייתכן שיהיה צורך להתאים את הגבול הימני של דגימת שער התא היחיד במדגם לחשבון עבור משמרות אלה.
    4. לחץ פעמיים על השער בלבד כדי לפתוח חלון עלילה חדש ולשנות את הצירים כדי להציג את ההיסטוגרמה של Dapi-a. השתמש בכלי ביקטור כדי להבחין בין תאים בודדים לבין תוכן dna רגיל (אוכלוסייתcellcycle ) מתאים אפוטוטיים עם דנ א מושפל (subG1 אוכלוסיה). לאחר מכן בחר את השערים החדשים בדפדפן והקש Ctrl + R כדי לשנות את שמם בהתאם (איור 2, עלילה 3).
    5. בחר את השער Cellcycle בדפדפן ובחר כלי | ביולוגיה | מחזור תאים. .. משורת התפריטים כדי לפתוח את כלי הדוגמנות של מחזור התא. בחר דין-jett-Fox25,26 בסעיף המודל כדי להעריך את תדירות התאים ב-G1, S ו-G2/M שלב (איור 2, עלילה 4). השתמש באילוצים רק במקרה של ביצועי מודלים ירודים (מזער את סטיית ממוצע השורש בין מודל לנתונים).
    6. יצירת שערים ל- G1 (כליאליפסה ), S (כלי מצולע) ו- G2 + M (הכליאליפסה ) ב-dapi-W Vs. dapi-מזימה של אוכלוסיית cellcycle כדי לאפשר מדידה γH2AX ספציפי למחזור תאים ( איור 2, עלילה 5). אין להשתמש בכלי הדוגמנות לביצוע מחזור תאים אוטומטי בהתבסס על היסטוגרמה DAPI-A, מאחר שפעולה זו עשויה להיות לא מדויקת.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך להעביר את השערים לאורך מדגם DAPI-A על-ידי דוגמה לחשבון עבור השינויים האמורים בחוזק האותות הכולל של DAPI. הזיזו את שלושת השערים כקבוצה ואל תשנו את צורת השערים הבודדים כדי להימנע מהטיה.
    7. השתמש בכלי ביסקטור כדי להבדיל בין פוספאו-Histone H3-חיובי (m) ו-שלילי (m-) תאים בAlexa555-היסטוגרמה של האוכלוסייה cellcycle (איור 2, עלילה 6). החזק את המקשים Ctrl ובחר את השערים G2 + m ו -m. הקש Ctrl + Shift + A כדי ליצור את השער g2 (G2 + m & m-).
    8. השתמש בכלי ביקטור כדי להבדיל בין תאים (Casp3 +) ושליליים (Casp3-) בAlexa647-היסטוגרמה של אוכלוסיית התאים הסינגניים ( איור 2, עלילה 7). הגדר את הסף כך שהממוצע של האוכלוסיה Casp3 + בפקדים שאינם מטופלות מסתכם ב-~ 0.8% כדי להבטיח רגישות גבוהה ולמזער את הווריאציות של הקביעה-לתוך-שיטת הטיפול.
    9. הקש Ctrl + T כדי לפתוח את עורך הטבלה ולקבוע את תצורתו לפי איור 3. גרור ושחרר את האוכלוסיות השונות מהדפדפן לדוגמה לעורך הטבלה ולחץ פעמיים על השורות כדי לשנות את הגדרות הסטטיסטיקה, הפרמטרים והשמות. הסר את השורות הלא נחוצות הנוספות באופן אוטומטי לאחר הגרירה והשחרור של סמל דגמי מחזור התא על-ידי בחירת השורות וההקשה על Del.
    10. בחר בקובץ, בתבנית וביעד במקטע הפלט של רצועת הכלים של התפריט ולחץ על צור טבלה כדי לייצא את הנתונים כקובץ '. xlsx '.
  2. השתמש בתוכנת חישוב טבלה (ראה טבלת חומרים) לניתוח נתונים נוסף בהתאם לקובץ המשלים 1 (FACS_Analysis_Template_ (1). xlsx).
    1. תקן את תדרי התאים בשלבי מחזור התא השונים, כך שהסכום שלהם מסתכם ב-100% על-ידי החלת הנוסחה X ' = X * 100/Σ (כל שלבי מחזור התא), עם X ': ערך מתוקן, X: ערך גולמי, לכל שלב של מחזור התא.
      הערה: סטיות מסכום של 100% מתרחשות עקב אי-דיוקים בדגמי מחזור התא, אך בדרך כלל קטנים (< 5%).
    2. לנרמל את עוצמות הγH2AX החציוני לתוכן ה-DNA בשלבי מחזור התא השונים על-ידי חלוקת הערכים בשלב S ב-1.5 ובשלב G2 ו-M-2.0.
    3. כדי לחשב את רמת הγH2AX המנורמלת המשולבת באוכלוסיית התאים כולה, השתמש בנוסחה IA = אניg1 * g1 + is * s + אניg2 * g2 +i * m , שםאני, אניG1, אניS, אניG2, אני הם מנורמל γH2AX עוצמות החציוני של כל, G1, S, G2, M תאים בהתאמה ו-G1, S, G2, M הם מתוקנים תדירות של תאים בשלב מחזור התא בהתאמה.
    4. עבור רמות γH2AX מנורמלות ותדירות התאים של subG1 ו caspase-3-חיוביים, הפחת את הערך הממוצע של הפקדים שאינם מטופלות מכל מדגם.
    5. לחשב את הממוצע ואת סטיית התקן של כל פרמטר מכל הדגימות לשכפל ולהתוות את התוצאות לתוך דיאגרמות.

תוצאות

U87 אנושיים או LN229 התאים הגלינובללי היו לקרינה עם 4 Gy של פוטון או קרינת יון פחמן. מחזור תא ספציפי γH2AX רמות ו אפופטוזיס נמדדו בזמן נקודות שונות עד 48 h לאחר ההקרנה באמצעות שיטת הזרימה cy, הציג כאן (איור 3). בשני קווי התא, יוני פחמן המושרה גבוה יותר γH2AX השיא רמות שנדחו לאט יותר ונשארה ?...

Discussion

השיטה הכוללת היא קלה לשימוש ומציעה מדידה מהירה, מדויקת ומתחודש של התגובה נזק DNA כולל הפסקה כפולה הגדיל (DSB) אינדוקציה ותיקון, מחזור התא אפקטים מוות תאים האפוטוטיים. השילוב של נקודות קצה אלה מספק תמונה מלאה יותר של יחסי הגומלין שלהם מאשר הפרט היחיד. השיטה יכולה להיות מיושמת באופן נרחב כשיקול ...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

אנו מודים לצוות המתקן הרפואי של המרכז לחקר הסרטן הגרמני (DKFZ) על תמיכתם.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,000 µL filter tipsNerbe plus07-693-8300
100-1,000 µL pipetteEppendorf3123000063
12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore sizeBD Falcon352235
15 mL tubesBD Falcon352096
200 µL filter tipsNerbe plus07-662-8300
20-200 µL pipetteEppendorf3123000055
4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)Sigma-AldrichD9542Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C
Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011BioLegend613406Dilute 1:20
Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414BD Pharmingen560626Dilute 1:20
BD FACSClean solutionBD Biosciences340345For cytometer cleaning routine after measurement
BD FACSRinse solutionBD Biosciences340346For cytometer cleaning routine after measurement
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)BiochromL 182Dissolve in water to 1x concentration
Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutaminBiochromFG 0415Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Ethanol absoluteVWR20821.330
Excel softwareMicrosoft
FBS Superior (fetal bovine serum)BiochromS 0615Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
FlowJo v10 softwareLLConline order
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples
Folded cellulose filters, grade 3hwNeoLab11416
LSRII or LSRFortessa cytometerBD Biosciences
MG132Calbiochem474787optional drug for apoptosis positive control
Multifuge 3SR+Heraeus
ParaformaldehydeAppliChemA3813Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter.
Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639Cell Signaling Technology#3475Dilute 3:200
PIPETBOY acu 2Integra Biosciences155 016
Serological pipettes, 10 mLCorning4488
Serological pipettes, 25 mLCorning4489
Serological pipettes, 5 mLCorning4487
SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand)BiomolAG-40T-0002-C020optional drug for apoptosis positive control
T25 cell culture flasksGreiner bio-one690160Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Trypsin/EDTAPAN BiotechP10-025500Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
U87 MG glioblastoma cellsATCCATCC-HTB-14Example cell line used in the protocol

References

  1. Jensen, A., et al. Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518). BMC Cancer. 6, 122 (2006).
  2. Oertel, S., et al. Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec). Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).
  3. Timke, C., et al. Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy. Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).
  4. Zhang, M., et al. Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761. Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).
  5. Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
  6. Hoeijmakers, J. H. DNA Damage, Aging, and Cancer. New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).
  7. Rodgers, K., McVey, M. Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).
  8. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  9. Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle. Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).
  10. Escribano-Díaz, C., et al. A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice. Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  11. Bakr, A., et al. Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice. Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).
  12. Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation. Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).
  13. Lopez Perez, R., et al. DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells. Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).
  14. Oertel, S., et al. Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines. Radiation oncology. 6 (1), 119 (2011).
  15. Blattmann, C., et al. Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation. Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).
  16. Thiemann, M., et al. In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model. Radiation Oncology. 7 (1), 52 (2012).
  17. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).
  18. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy. Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).
  19. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition. Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).
  20. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin. Scientific Reports. 6, 20035 (2016).
  21. Nicolay, N. H., et al. Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment. Scientific Reports. 6, 26645 (2016).
  22. Rühle, A., et al. Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells. Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).
  23. Münz, F., et al. Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment. Scientific Reports. 8 (1), 312 (2018).
  24. Rühle, A., et al. The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).
  25. Dean, P. N., Jett, J. H. Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry. Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).
  26. Fox, M. H. A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry. Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).
  27. Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
  28. Meyer, B., Voss, K. -. O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  29. Lopez Perez, R., et al. Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci. FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).
  30. Schipler, A., Iliakis, G. DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice. Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).
  31. Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. DNA fragmentation by charged particle tracks. Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).
  32. Friedland, W., et al. Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping. Scientific Reports. 7, 45161 (2017).
  33. Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy. Frontiers in Oncology. 6, 130 (2016).
  34. Böcker, W., Iliakis, G. Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells. Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).
  35. Löbrich, M., et al. γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization. Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151DNAcy

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved