유세포측정에 의한 유독성 응력 후 γH2AX 및 세포자멸의 세포 주기별 측정

요약

제시된 방법은 DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs), 세포 주기 분포 및 세포 자멸의 정량 분석을 결합하여 DSB 유도 및 수리의 세포 주기 별 평가뿐만 아니라 수리 실패의 결과를 가능하게합니다.

초록

제시된 방법 또는 약간 변형된 버전은 임상 종양학에서 사용된 것과 같이 각종 항암 처리의 특정 처리 반응 그리고 부작용을 공부하기 위하여 고안되었습니다. 방사선 요법과 다수의 항암 제에 의해 유도된 바와 같이, 유독성 스트레스 후 DNA 손상 반응의 정량적 및 세로 분석을 가능하게 한다. 이 방법은 DNA 손상 반응의 모든 단계를 커버, DNA 이중 가닥 휴식의 유도 및 수리를위한 엔드 포인트를 제공 (DSBs), 세포 주기 체포 및 수리 실패의 경우 세포 사멸에 의한 세포 사망. 이 측정을 결합하는 것은 세포 주기 의존적인 처리 효력에 관하여 정보를 제공하고, 이렇게 DNA 손상에 대하여 세포 증식과 대처 기계장치 사이 상호 작용의 심층적인 연구를 허용합니다. 화학요법제 및 이온화 방사선을 포함한 많은 암 치료제의 효과는 특정 세포 주기 단계에 따라 제한되거나 강하게 변화하기 때문에, 상관분석은 치료 효과를 평가하기 위한 강력하고 실행 가능한 방법에 의존합니다. 세포 주기 특정 방식으로 DNA에. 이것은 단일 엔드포인트 어세이와 제시된 방법의 중요한 이점으로는 불가능합니다. 이 방법은 임의의 특정 세포주에 제한되지 않으며 다수의 종양 및 정상 조직 세포주에서 철저히 시험되었다. 종양 세포의 유전적 불안정성 평가, 약물 스크리닝 및 평가를 포함하여 방사선 종양학 외에 종양학의 많은 분야에서 포괄적인 유전독성 분석술로 널리 적용될 수 있다.

서문

종양학의 목표는 정상적인 세포를 손상시키지 않고 암세포를 죽이거나 비활성화하는 것입니다. 많은 치료는 직접 또는 간접적으로 암세포에서 유전자 독성 스트레스를 유도하지만, 일부는 정상 세포에서 확장됩니다. 화학요법 또는 표적 약물은 종종 방사선 요법과 결합되어 조사된종양 1, 2,^3,4,5의방과민성을 향상시킵니다. 방사선 선량은 정상적인 조직 손상을 최소화합니다.

이온화 방사선 및 기타 유독성 제제는 염기 수정, 가닥 가교 및 단일 또는 이중 가닥 파손을 포함한 다양한 종류의 DNA 손상을 유발합니다. DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs)는 가장 심각한 DNA 병변이고 그들의 유도는 방사선과 방사선 화학요법에 있는 각종 세포 성 약의 세포 살해 효력의 열쇠입니다. DSB는 게놈의 무결성을 해칠뿐만 아니라 돌연변이 6,^{7의형성을}촉진합니다. 따라서, 다른 DSB 수리 경로, 및 세포 사멸 과 같은 돌이킬 수없는 손상된 세포를 제거하는 메커니즘은 진화 중에 개발되었다. 전체 DNA 손상 반응(DDR)은 DNA 손상 인식 및 세포 주기 검거로부터 DNA 복구, 프로그램된 세포 사멸 또는 수리 실패시불활성화에 이르는 신호 경로의 복잡한 네트워크에 의해 조절된다 8.

제시된 유동 세포 측정 방법은 DSB 유도 및 수리뿐만 아니라 수리 실패의 결과를 포함하는 하나의 포괄적 인 분석에서 유독성 스트레스 후 DDR을 조사하기 위해 개발되었습니다. 그것은 고전적인 subG1 분석 및 caspase-3 활성화의 더 구체적인 평가를 사용하여 세포 주기 및 세포 사멸의 유도의 분석과 널리 적용되는 DSB 마커 γH2AX의 측정을 결합합니다.

하나의 분석에서 이러한 엔드포인트의 조합은 시간, 인건비 및 비용 비용을 감소시킬 뿐만 아니라 Caspase-3 활성화뿐만 아니라 DSB 유도 및 수리의 세포 주기별 측정을 가능하게 합니다. 이러한 분석은 독립적으로 수행 된 분석으로는 불가능하지만, 유독성 스트레스 후 DNA 손상 반응에 대한 포괄적 인 이해를 위해 매우 관련이 있습니다. 세포성 화합물과 같은 많은 항암제는 세포 분열에 대해 지시되며 그 효율은 세포 주기 단계에 크게 의존합니다. 상이한 DSB 수리 공정의 가용성은 또한 수리 정확도에 중요한 세포 주기 단계 및 경로 선택에 따라 달라지며, 차례로^셀9,^10,11의운명을 결정합니다. ¹². 또한, DSB 수준은 유독성 화합물 또는 방사선의 투여량뿐만 아니라 세포의 DNA 함량에 의존하기 때문에 DSB 수준의 세포 주기별 측정은 풀화 분석보다 더 정확하다.

이 방법은 교모세포종^13에서 내성 메커니즘을 극복하고 골육종14,15에서 이온화 방사선과 표적 약물 간의 상호 작용을 해부하기 위해 다른 방사선 요법의 효능을 비교하는 데 사용되었습니다. 및 비정형 테라로이드 라브도이드 암^16. 또한, 기재된 방법은 중간엽 줄기세포^{17,18,19,20,21, 22,23,24,}이는 치료 유도 정상 조직 손상의 수리에 필수적이며 재생 의학에서 잠재적 인 응용 프로그램을 갖는다.

프로토콜

1. 준비

1. 시작 물질로 배양 용기의 모든 유형에 ≥1 x 10⁵ 세포 / 샘플을 준비합니다.
   1. 예를 들어, U87 아교모세포종 세포를 이온화 방사선에 노출한 후 시간 코스 실험을 수행합니다: 각 시점마다 삼중배액으로 T25 플라스크에서 하위-Confluent U87 세포를 조사합니다. 초기 시간 포인트(조사 후 15분에서 최대 8시간)를 선택하여 DSB 수리(γH2AX 수준) 및 늦은 시간 점(24h ~ 96시간)의 역학을 따라 잔류 DSB 수준, 세포 주기 효과 및 세포 사멸을 평가합니다.
      참고: 프로토콜은 조사 실험 또는 임의의 특정 세포주에 제한되지 않는다. 그것은 모든 종류의 수많은 세포주, 다른 종에서 그리고 다양 한 치료 조건에 대 한 테스트 되었습니다.
2. 10% 초과 부피를 포함한 다음 솔루션을 준비합니다.
   1. 인산완식염수(PBS)에서 4.5% 파라포름알데히드(PFA)로 구성된 고정 용액 샘플당 2 mL를 준비합니다. 솔루션을 신선하게 준비합니다. 연기 후드 하에서 천천히 교반하여 80°C로 가열하여 PBS에서 PFA를 희석한다. 열 손실을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 플라스크를 덮습니다. 용액을 실온으로 식히고 최종 부피를 조정하십시오. 접힌 셀룰로오스 필터, 등급 3hw를 통해 용액을 전달합니다 (재료 표참조).
      주의 사항: PFA 연기는 독성이 있습니다. 이 단계를 연기 후드 아래에서 수행하고 PFA 폐기물을 적절하게 폐기하십시오.
   2. -20°C의 얼음-차가운_H2O. 스토어에서 70% 에탄올로 구성된 투과성 용액 샘플당 3 mL를 준비합니다.
   3. PBS에서 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)으로 구성된 세척용액의 샘플당 7 mL를 준비한다.
   4. 항체 희석제로 PBS에서 3% BSA의 샘플 당 100 μL을 준비한다.
   5. PBS에서 1 μg/mL 4', 6-디아미딘-2-페닐린돌(DAPI)으로 구성된 DNA 염색 용액 샘플당 100-250 μL을 준비합니다.
3. 15 mL 튜브에 대한 원심 분리기를 200 x g 및 7 °C에서 5 분으로 설정합니다. 원심분리기를 식히고 모든 원심분리 단계에 이러한 설정을 사용합니다.

2. 샘플 수집

1. 부착 세포(예를 들어, T25 플라스크에서 자란 U87 교모세포 세포가 Dulbecco의 변형된 이글 배지 5 mL로 37°C 및 5% 이산화탄소 대기에서 10% 태아 소 혈청을 보충한 경우) 2.1.1단계를 계속합니다. 및 2.1.2. 현탁액 세포의 경우 2.1.2 단계로 직접 진행됩니다.
   1. 원심분리관에서 배지를 수집합니다. 일상적인 세포 배양 방법을 사용하여 세포를 분리, 이는 트립신의 사용을 포함 할 수있다, 에틸렌디아민테아세트산 (EDTA) 또는 다른 세포 분리 에이전트.
      1. U87 세포의 경우, 프리웜 PBS 및 트립신/EDTA(재료 표참조)를 37°C로 세척하고, 1 mL의 PBS로 세포층을 세척하고, 트립신/EDTA 1mL로 세포를 배양하고, 플라스크를 탭하여 세포 분리를 지원합니다. 배지와 함께 튜브내의 모든 세척용액 및 셀 현탁액을 수집한다.
   2. 세포를 원심분리하고, 배지를 폐기하고, PBS의 1 mL에서 세포를 다시 중단한다.
2. 세포를 위아래로 여러 번 피펫하여 단일 셀 현탁액을 보장하고 2 mL의 고정 용액 (4.5 % PFA / PBS, 3 % 최종 농도)으로 튜브로 셀 현탁액을 옮니다.
   주의 사항: PFA 연기는 독성이 있습니다. 이 단계를 연기 후드 아래에서 수행하고 PFA 폐기물을 적절하게 폐기하십시오.
3. 실온에서 세포를 10 분 동안 배양하십시오.
4. 세포를 원심분리하고 장식에 의해 상한제를 버린다.
5. 튜브에 눌러 세포 펠릿을 느슨하게하고 70 % 에탄올의 3 mL에서 세포를 다시 중단. 다음 단계로 직접 진행하거나 샘플을 최대 몇 주 동안 4 °C에 저장하십시오.

3. 세탁 및 염색

1. 세포를 원심분리하고 장식에 의해 상한제를 버린다.
2. 튜브에 눌러 세포 펠릿을 느슨하게. 3 mL의 세척 용액 (0.5 % BSA / PBS)에서 세포를 다시 일시 중단하고 원심 분리기를 제거하고 상한체를 폐기하십시오.
3. 3 mL로 세탁 단계를 1x반복한 다음 1mL 세척 용액으로 1x를 반복합니다. 마지막 단계에서, 파이펫팅하여 상급을 조심스럽게 버린다. 펠릿을 흡인하지 않도록주의하십시오.
4. 100 μL/샘플에서 γH2AX, 포스포스-히스톤 H3(Ser10) 및 카스파제-3에 대한 항체를 희석(3% BSA/PBS).
5. 튜브에 탭하여 세포 펠릿을 느슨하게 하고 3.4 단계에서 제조된 항체 용액의 100 μL에서 세포를 다시 중단한다. 이 단계부터 샘플을 어두운 곳에서 유지하십시오.
6. 실온에서 1 시간 동안 샘플을 배양하십시오.
7. 세포를 원심 분리하고 피펫팅하여 상급체를 조심스럽게 버립니다. 펠릿을 흡인하지 않도록주의하십시오.
8. 튜브에 눌러 세포 펠릿을 느슨하게하고 DNA 염색 용액의 100-250 μL에서 세포를 다시 중단 (1 μg / mL DAPI / PBS).
   1. 1-2 x10⁵ 세포가 존재하는 경우 100 μL을 사용하고 더 높은 세포 수에 대한 부피를 증가시다 (≥1 x 10⁶ 셀의 경우 250 μL). 다음 단계로 직접 진행하거나 샘플을 최대 2주 동안 4°C에서 어두운 위치에 보관하십시오.
      참고: DAPI 농도를 최적화하는 일부 세포 유형의 경우 세포 주기 단계의 분리를 개선하는 데 도움이 될 수 있다.
9. 35 μm의 메쉬 기공 크기로 샘플 튜브의 셀 스트레이너 캡을 통해 샘플을 피펫.

4. 측정

1. 샘플을 얼음 위에 놓고 표 1에 따라 광학 설정으로 구성된 유량 세포계(재료 표참조)를 시작하고 프라임 버튼을 누릅니다. 필요한 경우 자외선 레이저(355nm 파장)를 별도로 켜고 적절한 소프트웨어를 사용하여 10mW로 전력을 설정합니다.
2. 수집 소프트웨어(재료 표참조)를 열고 브라우저 도구 모음에서 새 실험 단추를 클릭하여 로그인하고 새 실험을 만듭니다.
3. 검사기 창을 사용하여 실험 이름을 사용자 지정하고 플롯 표시를 위해 '5 Log 수십년'을 선택합니다.
4. 브라우저 도구 모음에서 새 표본 단추를 클릭하고 왼쪽에 있는 '+' 기호를 클릭하여 새 항목을 확장하여 첫 번째 튜브를표시합니다. 각각의 아이콘을 선택하고 표본(예: 셀 유형) 및 튜브(샘플 식별자)의 이름을 바꿀 수 있습니다. 첫 번째 튜브의 튜브 포인터(왼쪽에 있는 화살표 모양 기호)를 클릭하여 녹색(활성)으로 바뀝니다.
5. 세포계 창에서 매개 변수 탭을 열고 표 1에 따라 매개 변수를 선택합니다. 불필요한 매개 변수를 모두 삭제합니다.
   참고: 매개 변수 이름은 사용자 지정 사전 설정(예: Alexa555 대신 Cy3)에 따라 달라질 수 있습니다. 선택 항목이 표1의 광학 필터 및 검출기와 일치하는지 확인합니다. 모든 형광단의 광 경로는 이 설정에서 완전히 독립적이며 스펙트럼 중복의 보정은 필요하지 않습니다. 그러나 다른 광학 설정을 사용하는 경우 필요할 수 있습니다.
6. 워크시트 창을 열고 그림1에 따라 플롯을 작성합니다. 해당 도구 모음 버튼을 사용하여 2개의 도트 플롯과 4개의 히스토그램을 그려 적절한 매개변수(전면 산란(FSC-A) 대 측면 산란(SSC-A), DAPI-W 대 DAPI-A 및 DAPI-A 및 각 항체 결합을 위한 히스토그램을 선택합니다. 형광소.
7. 제어 샘플을 세포계에 부착하고 기기의 실행 버튼을 누릅니다. 소프트웨어의 브라우저 창에서 첫 번째 튜브를 선택하고 수집 대시보드에서 데이터 수집 버튼을 클릭합니다. 낮은, 중간 또는 높은 버튼과 계측기의 미세 튜닝 휠을 사용하여 샘플 주입 볼륨을 조정합니다. 낮은 설정에서 작동하지만 초당 100개 이상의 이벤트를 획득하는 것이 좋습니다(획득 대시보드참조).
8. 지침으로 그림 1의 점 플롯을 사용하여 검사기 창의 매개 변수 탭에서 FSC, SSC 및 DAPI에 대한 검출기 전압을 조정합니다. 셀 채우기가 선형 눈금으로 너무 분산된 것처럼 보이는 경우 FSC 및 SSC 매개변수에 대한 로그 축척으로 전환합니다.
9. 세포계의 대기 버튼을 누르고 소프트웨어의 워크시트 설정을 계속합니다.
   1. 다각형 게이트 도구를 사용하여 FSC-A 대 SSC-A 플롯및 직사각형 게이트 도구의 셀 모집단을 정의하여 DAPI-W 대 DAPI-A 플롯의 SingleCells 모집단을 정의합니다. Ctrl + G 키를 눌러 모집단 계층 구조를 표시하고 기본 게이트 이름을 클릭하여 이름을 바꿉니다.
   2. 그 후 모든 히스토그램을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 인구 표시 | 컨텍스트 메뉴에서 SingleCells입니다.
10. 항체 결합 형광단에 대한 검출기 전압을 최적화하여 이후에 제어 및 처리된 샘플을 획득하여 전체 동적 범위를 커버합니다. 신호 대 잡음 비를 최대화하고 검출기 채도를 방지합니다. SingleCells 채우기의 Alexa488 피크가 컨트롤이나 처리된 샘플에서 잘린 것이 없는지 확인합니다.
11. 세포계의 대기 버튼을 누르고 소프트웨어의 워크시트 창에서 4.11.1-4.11.3 단계를 선택적으로 수행하여 샘플 수집 중에 치료 효과의 대략적인 추정치를 얻을 수 있습니다.
    1. 모집단 계층 구조에서 SingleCells을 선택하고 사각형 게이트 도구를 사용하여 DAPI-W 대 DAPI-A 플롯에서 G1 모집단을 정의합니다. Alexa488 히스토그램에서 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 채우기 표시 | 컨텍스트 메뉴에서 G1.
    2. Alexa488 히스토그램을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 컨텍스트 메뉴에서 통계 보기 만들기를 선택합니다. 통계 보기에서 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 통계 보기 편집을선택합니다. 통계 탭으로 이동하여 G1 모집단의 Alexa488 신호 중앙값에 대한 확인란을 활성화합니다(다른 모든 옵션을 비활성화).
    3. 모집단 계층 구조에서 SingleCells을 선택하고 간격 게이트 도구를 사용하여 DAPI-A, Alexa555-A(그림 1의 Cy3-A)에서 하위G1, M 및 Casp3+ 모집단을 정의하고 알렉사647-A 히스토그램.
12. 세포계의 실행 버튼을 누르고 소프트웨어의 수집 대시보드를 사용하여 샘플을 측정합니다. 모든 이벤트 또는 셀 게이트(수많은 작은 파티클이 있는 경우)와 기록할 이벤트 수를 10,000개로 설정합니다.
13. 다음 튜브를 클릭하여 새 샘플을 만들고 브라우저 창에서 이름을 바꾸고 데이터 수집을 클릭하여 수집을 시작하고 데이터를 기록하여 기록을 시작합니다.
14. 파일 선택 | 수출 | 메뉴 모음에서 실험을 하고 대화 상자에서 디렉터리 내보내기를 선택하여 데이터를 '.fcs' 파일로 저장합니다. 선택적으로 나중에 실험을 다시 가져올 수 있도록 하는 경우 추가 zip 파일로 실험을 저장합니다.
    참고: 기존 실험의 설정은 편집으로 쉽게 재사용할 수 있습니다 | 데이터없이 복제.

5. 데이터 평가

1. '.fcs' 파일을 유동 세포 측정 분석 소프트웨어의 샘플 브라우저에 끌어 놓습니다(재료 표 참조). 그림2에 표시된 게이팅 전략을 적용합니다. 다음 딸 게이트를 진행하기 전에 게이트가 모든 샘플의 해당 모집단에 맞는지 확인하십시오.
   1. 모든 샘플에 변경 사항을 적용하려면 샘플 브라우저에서 변경된 게이트를 선택하고 Ctrl +C를 눌러 복사하고 상위 게이트를 선택하고 Ctrl + Shift + E를 눌러 모든 샘플에서 동등한 노드를 선택하고 Ctrl + V를 눌러 붙여 넣거나 덮어씁니다. 게이트. 그룹 게이트를 사용하지 마십시오.
   2. 브라우저의 첫 번째 샘플을 두 번 클릭하여 SSC-A 대 FSC-A 플롯을 엽니다. 도구 모음의 다각형 도구를 사용하여 해석에서 이물질을 제외한 셀 모집단(그림2,플롯 1)을 정의합니다. 게이트가 치료 관련 교대조를 수용할 수 있을 만큼 오른쪽 상단 모서리쪽으로 충분히 넓지 않은지 확인하지만 플롯의 왼쪽 아래 모서리를 향하는 테두리를 제한하여 셀을 안정적으로 제외합니다.
   3. 셀 게이트를 두 번 클릭하여 새 플롯 창을 열고 축 레이블을 클릭하여 축을 DAPI-W(세로) 대 DAPI-A(가로)로 축을 변경합니다. 사각형 도구를 사용하여 SingleCells 모집단(그림2, 플롯 2)을 정의하고 분석에서 셀 이배또는 덩어리를 제외합니다(G1 셀의 이중은 G2 및 M 셀과 동일한 DAPI-A 강도를 가지지만 DAPI-W는 상당히 높습니다. 값)을 참조하십시오.
      참고: 상이한 샘플에서 다양한 세포 수는 DNA에 대한 DAPI의 평형 결합으로 인해 전체 DAPI-A 신호 강도의 변화를 야기할 것이다. 이것은 세포 주기 분석에 영향을 미치지 않습니다, 그러나 이 교대를 설명하기 위하여 견본에 의하여 단 세포 문 견본의 적당한 경계를 조정하는 것이 필요할 지도 모릅니다.
   4. SingleCells 게이트를 두 번 클릭하여 새 플롯 창을 열고 축을 변경하여 DAPI-A 히스토그램을 표시합니다. Bisector 도구를 사용하여 정상 DNA 함량(CellCycle population)을 저하 된 DNA(subG1 인구)가있는 세포 세포세포에서 단일 세포를 구별하십시오. 그런 다음 브라우저에서 새 게이트를 선택하고 Ctrl + R을눌러 그에 따라 이름을 바꿉니다(그림 2, 플롯 3).
   5. 브라우저에서 셀사이클 게이트를 선택하고 도구를 선택 | 생물학 | 세포 주기... 메뉴 모음에서 셀 주기 모델링 도구를 엽니다. 모델 섹션에서 딘 제트 폭스^25,26을 선택하여 G1, S 및 G2/M 상에서 셀의 빈도를 추정합니다(그림2,플롯 4). 모델링 성능이 저하된 경우에만 제약 조건을 사용합니다(모델과 데이터 간의 근평균 제곱 편차를 최소화).
   6. 셀사이클 모집단의 DAPI-W 대 DAPI-A 플롯에서 G1(타원 도구), S(다각형 도구) 및 G2 + M(타원 도구) 단계에 대한 게이트 생성 그림2, 플롯 5). DAPI-A 히스토그램을 기반으로 하는 자동 셀 주기 게이팅에는 모델링 도구를 사용하지 마십시오.
      참고: 전체 DAPI 신호 강도의 전술한 변화를 설명하기 위해 샘플별로 DAPI-A 축 샘플을 따라 게이트를 이동해야 할 수도 있습니다. 세 개의 게이트만 그룹으로 이동하고 바이어스를 피하기 위해 개별 게이트의 모양을 변경하지 마십시오.
   7. 세포순환 집단의 알렉사555-A 히스토그램에서 인-히스톤 H3 양성(M) 및 -음극(M-) 세포를 구별하기 위해 바이섹터 도구를 사용한다(그림 2,플롯 6). Ctrl을 잡고 게이트 G2 + M 및 M-를선택합니다. Ctrl + Shift + A를 눌러 G2(G2+M & M-) 게이트를 만듭니다.
   8. Bisector 도구를 사용하여 단일 셀 모집단의 Alexa647-A 히스토그램에서 카스파제 3-양성(Casp3+ +) 및 -negative(Casp3-) 셀을 구별합니다(그림2,플롯 7). 처리되지 않은 대조군에서 Casp3+ 인구의 평균이 ~0.8%에 달하는 임계값을 설정하여 높은 민감도를 보장하고 분석-분석 변형을 최소화합니다.
   9. Ctrl + T를 눌러 테이블 편집기를 열고 그림3에 따라 구성합니다. 샘플 브라우저에서 다른 채우기를 끌어서 테이블 편집기로 끌어놓고 행을 두 번 클릭하여 통계, 매개 변수 및 이름 설정을 변경합니다. 행을 선택하고 Del을 눌러 셀 주기 모델링 아이콘의 드래그 앤 드롭 후에 자동으로 추가되는 불필요한 행을 제거합니다.
   10. 파일 로선택 , 메뉴 리본의 출력 섹션에서 형식 및 대상을 선택하고 테이블 만들기를 클릭하여 데이터를 '.xlsx' 파일로 내보냅니다.
2. 보충 파일 1(FACS_Analysis_Template_(1).xlsx)에 따른 추가 데이터 분석을 위해 표 계산 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용합니다.
   1. X'= X * 100 / Σ (모든 셀 사이클 단계)를 적용하여 각 셀 주기 단계에서 세포의 주파수를 수정합니다.
      참고: 100 %의 합계에서 편차는 세포 주기 모델링의 부정확성으로 인해 발생하지만 일반적으로 작습니다 (<5%).
   2. S상에서값을 1.5로 나누고 G2 및 M상에서 2.0으로 나누어 상이한 세포 주기 단계에서 DNA 함량에 대한 중앙값 γH2AX 강도를 정상화한다.
   3. 전체 세포 집단에서 결합 된 정규화 된 γH2AX 수준을 계산하려면 공식_{I A} = I_G1 * G1 + I_S * S + I_G2 * G2 + I_M , 여기서 I_A, I_G1, I_S, I_G2, I_M을 사용합니다. 모두의 중간 γH2AX 강도, G1, S, G2, M 세포각각 및 G1, S, G2, M은 각각의 세포 주기 단계에서 세포의 주파수를 보정한다.
   4. 정규화된 γH2AX 수준 및 subG1 및 카스파제-3 양성 세포의 주파수의 경우, 각 샘플에서 처리되지 않은 대조물의 평균 값을 뺍니다.
   5. 모든 복제 샘플에서 각 매개변수의 평균 및 표준 편차를 계산하고 결과를 다이어그램으로 플로팅합니다.

결과

인간 U87 또는 LN229 교모세포종 세포를 광자 또는 탄소 이온 방사선의 4Gy로 조사하였다. 세포 주기 특이적 γH2AX 수준 및 세포자멸은 여기에 제시된 유세포측정 방법을 사용하여 조사 후 최대48시간까지 상이한 시점에서 측정하였다(도 3). 두 세포주에서, 탄소 이온은 더 느린 감소와 동일한 물리적 용량에서 광자 방사선에 비해 24~48시간에서 유의하게 상승된 γH2AX 피크 수준을 ?...

토론

추천된 방법은 사용하기 쉽고 이중 가닥 브레이크(DSB) 유도 및 수리, 세포 주기 효과 및 세포 사멸을 포함한 DNA 손상 반응의 빠르고 정확하며 재현 가능한 측정을 제공합니다. 이러한 끝점의 조합은 개별 적인 비약적인 비고지 보다는 그들의 상호 관계의 더 완전한 그림을 제공합니다. 이 방법은 방사선 생물학, 치료 및 보호, 그리고 종양학 (예를 들어, 환경 위험 요소 평가, 약물 스크리닝 및 유전 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 µL filter tips	Nerbe plus	07-693-8300
100-1,000 µL pipette	Eppendorf	3123000063
12 mm x 75 mm Tubes with Cell Strainer Cap, 35 µm mesh pore size	BD Falcon	352235
15 mL tubes	BD Falcon	352096
200 µL filter tips	Nerbe plus	07-662-8300
20-200 µL pipette	Eppendorf	3123000055
4’,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Dissolve in water at 200 µg/mL and store aliquots at -20 °C
Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody, RRID: AB_2248011	BioLegend	613406	Dilute 1:20
Alexa Fluor 647 Rabbit Anti-Active Caspase-3 Antibody, AB_1727414	BD Pharmingen	560626	Dilute 1:20
BD FACSClean solution	BD Biosciences	340345	For cytometer cleaning routine after measurement
BD FACSRinse solution	BD Biosciences	340346	For cytometer cleaning routine after measurement
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biochrom	L 182	Dissolve in water to 1x concentration
Dulbecco's Modified Eagle's Medium with stable glutamin	Biochrom	FG 0415	Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Ethanol absolute	VWR	20821.330
Excel software	Microsoft
FBS Superior (fetal bovine serum)	Biochrom	S 0615	Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
FlowJo v10 software	LLC	online order
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	Embedding medium for optional preparation of microscopic slides from stained samples
Folded cellulose filters, grade 3hw	NeoLab	11416
LSRII or LSRFortessa cytometer	BD Biosciences
MG132	Calbiochem	474787	optional drug for apoptosis positive control
Multifuge 3SR+	Heraeus
Paraformaldehyde	AppliChem	A3813	Prepare 4.5% solution fresh. Dilute in PBS by heating to 80 °C with slow stirring under the fume hood. Cover the flask with aluminium foil to prevent heat loss. Let the solution cool to room temperature and adjust the final volume. Pass the solution through a cellulose filter.
Phospho-Histone H3 (Ser10) (D2C8) XP Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjugate) RRID: AB_10694639	Cell Signaling Technology	#3475	Dilute 3:200
PIPETBOY acu 2	Integra Biosciences	155 016
Serological pipettes, 10 mL	Corning	4488
Serological pipettes, 25 mL	Corning	4489
Serological pipettes, 5 mL	Corning	4487
SuperKillerTRAIL (modified TNF-related apoptosis-inducing ligand)	Biomol	AG-40T-0002-C020	optional drug for apoptosis positive control
T25 cell culture flasks	Greiner bio-one	690160	Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
Trypsin/EDTA	PAN Biotech	P10-025500	Routine cell culture material for the example cell line used in the protocol
U87 MG glioblastoma cells	ATCC	ATCC-HTB-14	Example cell line used in the protocol