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  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里，我们演示如何设置具有可编程输出频率的廉价伏特安度计，该仪表可与市售的筷子电极一起使用，用于跨皮/内皮电阻测量。

摘要

自 20 世纪 80 年代以来，一直使用过皮/内皮电阻 （TEER） 来确定体外屏障模型系统的汇合性和渗透性。在大多数情况下，筷子电极用于确定包含蜂窝单层的细胞培养过滤器插入系统的上腔和下腔之间的电阻抗。过滤膜允许细胞通过建立紧密的结点粘附、极化和相互作用。该技术已被描述与各种不同的细胞系（例如，血脑屏障的细胞，血脑脊液屏障，或胃肠道和肺肠道）。TEER 测量设备可以从不同的实验室设备供应商处轻松获得。但是，如果适当的电压计是自行组装的，则有更具成本效益和可定制的解决方案。本出版物的总体目标是建立一个可靠的具有可编程输出频率的器件，该器件可与市售的筷子电极一起使用，用于 TEER 测量。

引言

上皮细胞和内皮细胞作为细胞边界发挥作用，分离身体的表皮和巴索侧。如果它们通过紧密的交汇点连接，则通过副细胞空间的被动物质扩散受到限制1，从而形成选择性渗透屏障。几个人工屏障系统已经开发了2使用微血管内皮细胞（HBMEC，血脑屏障3，4，5，6，7），乔体丛上皮细胞（HIBCPP/PCPEC，血脑脊液屏障8，9，10，11，12，13，14），结肠直肠腺癌细胞（Caco-2，胃肠道模型15），或气道/肺泡细胞系（肺模型16，17）。这些系统通常由在可渗透膜上的单层生长的细胞组成（即过滤器插入系统），以便进入锥形和双侧侧。模型系统的完整性与体内条件相匹配非常重要。因此，通过测量示踪化合物在细胞层中的准细胞扩散来分析阻物功能。这些物质包括放射性标记蔗糖，染料标记的白蛋白，FITC标记的inulin，或染料标记的德克斯特兰2。然而，化学染料会使细胞无法用于进一步的实验。为了非侵入性地监测屏障系统，可以使用2、18、19测量跨皮层/跨体电阻（TEER）。由于双极电极系统受电极-电解质接口处电极极化阻抗的影响，通常使用四极测量来克服这一限制20。底铺设技术是一个四端传感（4T），最早由威廉汤姆森（主开尔文）21在1861年描述。简而言之，电流由一对载流电极注入，而第二对电压感应电极用于测量电压降20。如今，所谓的筷子电极由一对双电极组成，每个电极都含有用于测量电压的银/氯化银颗粒和用于通过电流2的银电极。电阻抗测量在锥形和双侧隔间之间，细胞层介于两者之间（图1）。在外部电极上应用频率为 12.5 Hz 的方波信号，并测量由此产生的交流电 （AC）。此外，通过第二个（内部）电极对测量整个细胞层的电位下降。然后根据欧姆定律计算电阻抗。TEER 值通过乘以阻抗和细胞层表面积进行归化，通常表示为±+ cm2。

在有些系统中，电池和电极的排列方式更为复杂，但也基于 4T 测量原理，可与相同的测量设备一起使用。例如，插入过滤器的 EndOhm 系统包含一个腔室和盖，其同心电极与筷子电极的结构相同。电极的形状允许更均匀的电流密度流过膜，从而减少读数之间的变化。更复杂的（但也更准确）是一个Using室，其中一个细胞层分隔两个腔室充满了Ringer的溶液22。腔室本身可以用氧气、CO2或N2气体，并搅拌或补充实验物质。当发生穿过细胞层的电离传输时，可以通过组织附近的两个电压感应电极来测量电位差。此电压由放置在电池层旁边的两个带电电极消除。测量电流然后给出净电位传输和透皮电阻，这反映了屏障的完整性，可以确定22。TEER测量也可以应用于代表屏障组织模型23、24的片上体系统。这些系统模仿细胞的体内条件，通常由几种类型的细胞组成，它们相互堆叠在一层之上。

以下协议说明了如何设置具有可编程输出频率的具有经济高效且可靠的伏特表，与市售的测量系统相比，TEER 在 TEER 中不会产生统计显著性差异。

研究方案

1. 用于 TEER 测量的基本伏安度计组装

  1. 准备一个标准的USB充电器作为5V D.C.电源，USB延长线，微控制器，将用作可编程方波发生器，两个标准万用表，能够测量交流电和电压作为根平均平方（True-RMS），四根带香蕉插头的电缆、带 RJ14 母连接器的电话延长线，包括六根带内四根有线 （6P4C） 的引脚、两条短电缆、一个光泽端子、一个 120 kΩ 预电阻器、线端铁圈和焊接凸耳。所需的工具包括绝缘剥离器、压接工具和焊接熨斗。
  2. 首先，将 USB 扩展连接到微控制器板。
  3. 剥去两条短电缆的端绝缘。每根电缆的焊条一面直接焊接到微控制器的引脚 0 和 2 或焊接凸耳，这些凸耳又被夹在相应的引脚上。将其他端压到导线端套圈，并将其连接到光泽端子，如图1所示。
  4. 将香蕉插头连接到万用表。剥去并压接四根电缆的另一端。
  5. 将电话延长线切成两块，并拆除并压接包含母连接器的侧面导线。检查导线和针脚的连续性。
  6. 第一个万用表将用于测量 μA 的电流（请注意，必须显式设置交流模式）。使用 120 kΩ 预电阻器将其串联到 RJ14 连接器的 5 个和 6 引脚上，对应于筷子电极的外电极对。
  7. 最后，通过光泽端子将第二个万用表连接到RJ14连接器的引脚3和4，与筷子电极的内部电极对相对应，该万用表将用于测量mV的透皮电压降。
  8. 如果需要，请将安装安装安装到机箱中。

2. 微控制器编程

  1. 根据需要修改提供的源代码（补充编码文件 1）。在给定形式中，引脚 0 和 2 将在接地和 +5 V 之间交替，振荡为 40 ms 的半时间。因此，将生成振幅为 5 V 且频率约为 12.5 Hz 的方波信号。由于微控制器的时间发射器不准确，实际值可能会有所不同。
  2. 通过USB端口将微控制器连接到台式计算机，并上传具有匹配软件25的源代码。

3. 电压示波线记录（可选）

  1. 带 1 kΩ 测试电阻的 RJ14 连接器的 5 个和 6 个旁路引脚，并连接到示波器。
  2. 检查频率、峰值电压和波形。数字化和导出数据。
  3. 如果需要，从参考设备 （EVOM） 和自组装的伏特表记录示波图进行比较。
    注: 在这种情况下，数据记录与数字存储范围 HM 208。图像是一个非常基本的数字示波器，可以在内部数字化（冻结），但必须使用模拟PM 8143 X-Y录像机进行绘制。随后对图像进行扫描。

4. 细胞培养和TEER测量

  1. 种子人类丘雷普丘帕氏菌（HIBCPP）细胞在细胞培养过滤器插入与孔径3μm在DMEM/F12（见材料表）含有10%胎儿小牛血清9。如Dinner等人9所述，在含有5%CO2的水饱和环境中在37°C下生长细胞。
  2. 当滤波器达到 70 Ω + cm2的阻抗时，将更改为无血清 DMEM/F12 并将时间点定义为第 0 天。
  3. 将电极连接到自组装伏特的 RJ14 端口，然后插入 USB 电源。将万用表分别设置为交流电压模式 （mV） 和交流电流模式 （μA）。
    1. 或者，将电极连接到市售的参考设备，然后根据制造商的说明打开。
  4. 在80%乙醇中消毒电极10分钟，在适当的介质中再平衡10分钟。
  5. 将电极放在细胞培养过滤器插入系统的两个隔间中（电极在下舱中的较长部分和上腔室中较短的部分），其中包含一个 HIBCPP 单元层，直到测量值保持不变。
  6. 对于参考设备，直接记下阻抗或根据欧姆定律 （R = U/I） 计算自组装伏特的阻抗。请注意，电极角度会影响测量值。
  7. 从第 0 天到第 4 天重复 TEER 测量（步骤 3⁄6）。

结果

为了比较自组装的电压计与市售的电压表的运行情况，记录了两个器件的电压示波器。

如图2 A所示，当使用1 kΩ测试电阻器进行负载工作时，参考仪器生成了振幅为80 mV、振荡时间为80 ms的方波信号，相当于12.5 Hz的频率。

相反，如果没有设置预电阻器，自?...

讨论

在自制伏特计可用于日常操作之前，必须检查设备是否正常工作。在我们的例子中，40 ms（12.5 Hz）的半时振荡被编程，但有效振荡时间的结果是60 ms （16.7 Hz）。微控制器时间发射器的这种不准确对TEER测量没有可检测的影响。最好使用万用表之一的频率设置来确定实际频率。如果发现任何偏差，可以相应地调整源代码。此外，强烈建议检查测试电阻器或其他定义的设置是否提供正确且可重现的结?...

披露声明

提交人没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。

致谢

作者要感谢赫尔曼·利格斯迈尔和马文·本德在电工和信息学方面的专家建议。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
120 kOhm resistorGeneral (generic) equipment
Banana plug cablesGeneral (generic) equipment
CablesGeneral (generic) equipment
Chopstick electrodeMerck MillicellMERSSTX01
Chopstick electrode (alternative)WPI World Precision InstrumentsSTX2
Crimping toolGeneral tool
Digispark / ATtiny85AZ-Delivery Vertriebs GmbHDigispark Rev.3 Kickstarter
DMEM:F12Gibco (Thermo Fisher)31330038
Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS)Life Technologies10270106
Filter inserts 3µm translucentGreiner Bioone662631
HIBCPPHiroshi Ishikawa / Horst Schroten
Insulation stripperGeneral tool
Luster terminalGeneral (generic) equipment
OscilloscopeHAMEGDigital Storage Scope HM 208
PlotterPHILIPSPM 8143 X-Y recorder
Software Arduinohttps://www.arduino.ccArduino 1.8.9
Soldering ironGeneral tool
Soldering lugsGeneral (generic) equipment
Telephone cable with RJ14 (6P4C) connectorGeneral (generic) equipment
Test resistorMerck MillicellMERSSTX04
True-RMS multimetersVOLTCRAFTVC185
USB chargerGeneral (generic) equipment
USB extension cordGeneral (generic) equipment
Voltohmmeter for TEER measurementWPI World Precision InstrumentsEVOM
Voltohmmeter for TEER measurement (alternative)Merck MillicellERS
Wire end ferrulesGeneral (generic) equipment

参考文献

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