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Resumo

Aqui, demonstramos como configurar um volt-AMPEREMETER barato com frequência de saída programável que pode ser usado com eletrodos de pauzinho disponíveis comercialmente para medições de resistência elétrica transepielial/endotelial.

Resumo

A resistência elétrica transepielial/endotelial (TEER) tem sido utilizada desde a década de 1980 para determinar a confluência e a permeabilidade dos sistemas de barreira in vitro. Na maioria dos casos, os elétrodos do chopstick são usados para determinar a impedância elétrica entre o compartimento superior e mais baixo de um sistema da inserção do filtro da cultura da pilha que contem monolayers celulares. A membrana do filtro permite que as células aderem, polarizar e interagir construindo junções apertadas. Esta técnica foi descrita com uma variedade de linhas de pilha diferentes (por exemplo, pilhas da barreira do sangue-cérebro, da barreira sangue-cerebrospinal do líquido, ou do intervalo gastrintestinal e pulmonar). Os dispositivos da medida de TEER podem prontamente ser obtidos dos fornecedores diferentes do equipamento de laboratório. No entanto, há soluções mais rentáveis e personalizáveis imagináveis se um voltamômetro apropriado for automontado. O objetivo geral desta publicação é configurar um dispositivo confiável com freqüência de saída programável que pode ser usado com eletrodos de pauzinho disponíveis comercialmente para medição TEER.

Introdução

As células epiteliais e endoteliais funcionam como limites celulares, separando os lados apical e basolateral do corpo. Se forem conectados através de junções apertadas, a difusão passiva da substância através dos espaços transcelulares paracelulares é restringida1, tendo por resultado a formação de uma barreira seletivamente permeável. Vários sistemas de barreira artificial foram desenvolvidos2 usando células endoteliais microvasculares (hbmec, barreira hematoencefálica3,4,5,6,7), plexocoróide células epiteliais (hibcpp/pcpec, barreira hemato-liquórica8,9,10,11,12,13,14), células de adenocarcinoma colorretal (Caco-2, modelos gastrintestinais15), oulinhagens de células aéreas/alveolares (modelos pulmonares16,17). Estes sistemas consistem tipicamente nas pilhas crescidas em um monocamada em membranas permeáveis (isto é, sistemas da inserção do filtro) para permitir o acesso aos lados apical e basolateral. É importante que a integridade do sistema modelo corresponda às condições in vivo. Assim, várias técnicas foram desenvolvidas para analisar a função de barreira medindo a difusão paracelular de compostos traçador em toda a camada celular. Essas substâncias incluem sacarose radiomarcada, albumina rotulada com corante, inulina rotulada com FITC ou dextranos2rotulado com corante. No entanto, corantes químicos podem tornar as células inutilizáveis para outras experiências. Para monitorar os sistemas de barreira de forma não invasiva, a mensuração da resistência elétrica transepielial/transendotelial (teer) em monocamada celular pode ser utilizada2,18,19. Porque os sistemas do elétrodo bipolar são influenciados pela impedância da polarização do elétrodo na relação do elétrodo-eletrólito, as medidas tetrapolar são usadas geralmente para superar esta limitação20. A técnica de underpostura é uma detecção de quatro terminais (4T) que foi descrita pela primeira vez em 1861 por William Thomson (Lord Kelvin)21. Em suma, a corrente é injetada por um par de eletrodos de transporte atual, enquanto um segundo par de eletrodos de detecção de voltagem é usado para medir a queda de tensão20. Hoje em dia, os chamados elétrodos do chopstick consistem em um par de elétrodos dobro, cada um que contem uma pelota da prata/prata-cloreto para medir a tensão e um elétrodo de prata para passar a corrente2. A impedância elétrica é medida entre o compartimento apical e o basolateral com a camada celular entre (Figura 1). Um sinal de onda quadrada em uma freqüência de tipicamente 12,5 Hz é aplicado nos eletrodos externos e a corrente alternada resultante (AC) medida. Adicionalmente, a gota potencial através da camada da pilha é medida pelo segundo par (interno) do elétrodo. A impedância elétrica é então calculada de acordo com a lei de Ohm. Os valores de TEER são normalizados multiplicando a impedância e a área de superfície da camada celular e são tipicamente expressos em Ω ∙ cm2.

Há os sistemas em que as pilhas e os elétrodos são arranjados em uma maneira mais sofisticada, mas são baseados igualmente no princípio de medição 4T e podem ser usados com os mesmos dispositivos da medida. Os sistemas de EndOhm, por exemplo, em que o filtro é introduzido, contêm uma câmara e um tampão com um par de elétrodos concêntricos com a mesma estrutura que o elétrodo do chopstick. A forma dos eletrodos permite um fluxo de densidade de corrente mais uniforme em toda a membrana, reduzindo assim a variação entre as leituras. Ainda mais complexo (mas também mais preciso) é uma câmara Ussing, onde uma camada celular separa duas câmaras preenchidas com solução de Ringer22. A própria câmara pode ser gaseificada com oxigénio, CO2ou N2, e agitada ou suplementada com substâncias experimentais. Porque o transporte do íon através da camada da pilha ocorre, uma diferença potencial pode ser medida por dois elétrodos tensão-detectando perto do tecido. Esta voltagem é cancelada por dois eletrodos de transporte de corrente colocados ao lado da camada celular. A corrente medida dará então o transporte de íons líquidos e a resistência transepitelial, que reflete a integridade da barreira, pode ser determinada22. A medida de teer pode igualmente ser aplicada nos sistemas Body-on-a-chip que representam os modelos de barreira-tecido23,24. Estes sistemas imitam in vivo as condições das células e muitas vezes consistem em vários tipos de células, empilhadas em cima umas das outras em camadas.

O protocolo a seguir explica como configurar um voltamômetro econômico e confiável com frequência de saída programável que não produz diferenças estatisticamente significativas no TEER em comparação com os sistemas de medição disponíveis comercialmente.

Protocolo

1. montagem de um volt-AMPEREMETER básico para a medida do TEER

  1. Prepare um carregador USB padrão como a fonte de alimentação de 5 V DC, um cabo de extensão USB, um microcontrolador que será usado como um gerador de onda quadrada programável, dois multímetros padrão que são capazes de medir corrente alternada e tensão como raiz média quadrada ( True-RMS), quatro cabos com plugues da banana, um cabo de extensão do telefone com um conector fêmea RJ14 que inclui seis pinos com os quatro internos prendidos (6P4C), dois cabos curtos, um terminal do brilho, um 120 kΩ Pre-resistor, ferrules da extremidade do fio, e lugs de solda. As ferramentas exigidas são um descascador da isolação, uma ferramenta de friso, e um ferro de solda.
  2. Primeiro, conecte a extensão USB à placa do microcontrolador.
  3. Tira o isolamento final de dois cabos curtos. Soldar um lado por cabo ou diretamente aos pinos 0 e 2 do microcontrolador ou aos talões de solda, que por sua vez são cortados nos respectivos pinos. Friso as outras extremidades para a extremidade do fio virolas e conectá-los a um terminal de brilho como representado na Figura 1.
  4. Ligue os plugues de banana para os multímetros. Tira e friso a outra extremidade de cada um dos quatro cabos.
  5. Corte o cabo de extensão do telefone em duas partes e desmontar e friso os condutores do lado que contém o conector fêmea. Verifique a continuidade dos condutores e pinos.
  6. O primeiro multímetro será usado para medir a corrente em μA (note que o modo AC tem de ser definido explicitamente). Conecte-o em uma série com um pré-resistor de 120 kΩ para pinos cinco e seis do conector RJ14, correspondendo ao par de eletrodos externo do eletrodo de pauzinho.
  7. Finalmente, vincular o segundo multímetro, que será usado para medir a queda de tensão transepielial em mV, através do terminal de brilho para pinos três e quatro do conector RJ14, correspondendo ao par eletrodo interno do eletrodo pauzinho.
  8. Se desejar, monte a instalação em um chassi.

2. programar o microcontrolador

  1. Modifique o código-fonte fornecido (arquivo de codificação suplementar 1) conforme necessário. Na forma dada, os pinos 0 e 2 alternarão entre o solo e + 5 V com 40 MS de meia-hora de oscilação. Assim, um sinal de onda quadrada com uma amplitude de 5 V e uma frequência de aproximadamente 12,5 Hz será gerado. Os valores reais podem diferir devido à imprecisão do emissor de tempo do microcontrolador.
  2. Conecte o microcontrolador a um computador desktop através de uma porta USB e carregue o código-fonte com o software correspondente25.

3. gravação de oscilosgramas de tensão (opcional)

  1. Contorne os pinos cinco e seis do conector RJ14 com um resistor de teste de 1 kΩ e conecte-se a um osciloscópio.
  2. Verifique a frequência, a tensão de pico e a forma de onda. Digitalize e exporte os dados.
  3. Se desejado, oscilogramas de registro de um dispositivo de referência (EVOM) e o voltamômetro automontado para comparação.
    Nota: neste caso, os dados foram gravados com um escopo de armazenamento digital HM 208. Sendo um osciloscópio digital muito básico, a imagem pode ser digitalizada internamente (congelada), mas teve que ser plotada usando um gravador analógico PM 8143 X-Y. A imagem foi posteriormente digitalizada.

4. cultivo da pilha e medida de TEER

  1. Células de papiloma do plexo coróide humano de semente (HIBCPP) em inserções de filtro de cultura celular com um tamanho de poros de 3 μm em DMEM/F12 (ver tabela de materiais) contendo 10% de soro de bezerro fetal9. Cresça as células a 37 ° c em uma atmosfera saturada de água contendo 5% de CO2 , conforme descrito por Dinner et al.9.
  2. Quando os filtros atingem uma impedância de 70 Ω ∙ cm2, mude para DMEM/F12 sem soro e defina o temporal como dia 0.
  3. Conecte o eletrodo à porta RJ14 do voltamômetro automontado e conecte a fonte de alimentação USB. Defina os multímetros para o modo de tensão AC (mV) e o modo de corrente AC (μA), respectivamente.
    1. Alternativamente, conecte o eletrodo a um dispositivo de referência disponível comercialmente e ative de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Esterilizar o eletrodo em etanol a 80% por 10 min e equilibrar no meio apropriado por mais 10 min.
  5. Coloque o eletrodo em ambos os compartimentos de um sistema de inserção de filtro de cultura celular (a parte mais longa do eletrodo no compartimento inferior e a parte mais curta no compartimento superior) contendo uma camada de células HIBCPP até que os valores de medição permaneçam constantes.
  6. Para um dispositivo de referência, anote a impedância diretamente ou Calcule a impedância de acordo com a lei de Ohm (R = U/I) para o voltamômetro automontado. Esteja ciente de que o ângulo do eletrodo afeta as medições.
  7. Repita a medida de TEER (etapas 3 − 6) do dia 0 até o dia 4.

Resultados

Para comparar a operação de um voltamômetro automontado com sua contraparte comercialmente disponível, foi registrado um oscilosgrama de tensão de ambos os dispositivos.

Como mostrado na Figura 2a, oinstrumento de referência gerou um sinal de onda quadrada com uma amplitude de 80 MV e um tempo de oscilação de 80 MS, que corresponde a uma frequência de 12,5 Hz, quando operando em carga c...

Discussão

Antes que um voltamômetro self-made possa ser usado em uma rotina diária, é essencial verific o dispositivo para a função apropriada. No nosso caso, uma meia-hora de oscilação de 40 MS (12,5 Hz) foi programada, mas o tempo de oscilação efetivo acabou por ser de 60 MS (16,7 Hz). Esta imprecisão do emissor de tempo do microcontrolador não teve nenhum impacto detectável em medidas de TEER. Talvez seja melhor determinar a freqüência real usando a configuração de freqüência de um dos multímetros. Se algum d...

Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Herman Liggesmeyer e Marvin Bende pelo seu aconselhamento especializado em Eletrotécnica e informática.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
120 kOhm resistorGeneral (generic) equipment
Banana plug cablesGeneral (generic) equipment
CablesGeneral (generic) equipment
Chopstick electrodeMerck MillicellMERSSTX01
Chopstick electrode (alternative)WPI World Precision InstrumentsSTX2
Crimping toolGeneral tool
Digispark / ATtiny85AZ-Delivery Vertriebs GmbHDigispark Rev.3 Kickstarter
DMEM:F12Gibco (Thermo Fisher)31330038
Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS)Life Technologies10270106
Filter inserts 3µm translucentGreiner Bioone662631
HIBCPPHiroshi Ishikawa / Horst Schroten
Insulation stripperGeneral tool
Luster terminalGeneral (generic) equipment
OscilloscopeHAMEGDigital Storage Scope HM 208
PlotterPHILIPSPM 8143 X-Y recorder
Software Arduinohttps://www.arduino.ccArduino 1.8.9
Soldering ironGeneral tool
Soldering lugsGeneral (generic) equipment
Telephone cable with RJ14 (6P4C) connectorGeneral (generic) equipment
Test resistorMerck MillicellMERSSTX04
True-RMS multimetersVOLTCRAFTVC185
USB chargerGeneral (generic) equipment
USB extension cordGeneral (generic) equipment
Voltohmmeter for TEER measurementWPI World Precision InstrumentsEVOM
Voltohmmeter for TEER measurement (alternative)Merck MillicellERS
Wire end ferrulesGeneral (generic) equipment

Referências

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