JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, transepitelyal/endotel elektriksel direnç ölçümleri için piyasada bulunan çubuk elektrotlarla kullanılabilen programlanabilir çıkış frekansına sahip ucuz bir volt-ampermetrenin nasıl kurulabileceğini gösteriyoruz.

Özet

Transepitelyal/endotel elektriksel direnç (TEER) 1980'lerden beri in vitro bariyer model sistemlerinin birbirliğini ve geçirgenliğini belirlemek için kullanılmaktadır. Çoğu durumda, çubuk elektrotlar hücresel monolayers içeren bir hücre kültürü filtre eklemek sisteminin üst ve alt bölme arasındaki elektrik empedansını belirlemek için kullanılır. Filtre membranı, hücrelerin sıkı kavşaklar oluşturarak yapışmasını, polarize olmasını ve etkileşimde olmasını sağlar. Bu teknik farklı hücre hatları çeşitli ile tarif edilmiştir (örneğin, kan-beyin bariyerhücreleri, kan-beyin-omurilik sıvı bariyeri, veya gastrointestinal ve akciğer yolu). TEER ölçüm cihazları farklı laboratuvar ekipmanları tedarikçilerinden kolayca temin edilebilir. Ancak, uygun bir voltammetre kendi kendine monte edilirse hayal daha uygun maliyetli ve özelleştirilebilir çözümler vardır. Bu yayının genel amacı, TEER ölçümü için ticari olarak kullanılabilen çubuk elektrotlarla kullanılabilecek programlanabilir çıkış frekansına sahip güvenilir bir cihaz kurmaktır.

Giriş

Epitel ve endotel hücreleri hücresel sınırlar olarak işlev, vücudun apikal ve bazolateral taraf ayıran. Eğer sıkı kavşaklar aracılığıyla bağlanırsa, parasellüler alanlardapasif madde difüzyonu sınırlıdır1, seçici geçirgen bir bariyer oluşumu ile sonuçlanan. Çeşitli yapay bariyer sistemleri 2 mikrovasküler endotel hücreleri kullanılarakgeliştirilmiştir (HBMEC, kan-beyin bariyeri3,4,5,6,7), koroid pleksus epitel hücreleri (HIBCPP/PCPEC, kan-beyin-omurilik sıvısıbariyeri 8,9,10,11,12,13,14), kolorektal adenokarsinom hücreleri (Caco-2, gastrointestinal modeller15), veya hava yolu/alveoler hücre hatları (pulmoner modeller16,17). Bu sistemler genellikle geçirgen membranlar üzerinde tek katmanlı olarak yetiştirilen hücrelerden oluşur (yani, filtre ekleme sistemleri) apikal ve bazolateral kenarlara erişim sağlamak için. Model sisteminin bütünlüğünün in vivo koşullarla eşleşmesi önemlidir. Bu nedenle, hücre tabakası boyunca izleyici bileşiklerinin parasellüler difüzyon ölçerek bariyer fonksiyonunu analiz etmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bu maddeler radyoetiketli sakaroz, boya etiketli albumin, FITC etiketli inulin veya boya etiketli dekstrans2içerir. Ancak, kimyasal boyalar hücreleri daha fazla deney için kullanılamaz hale getirebilir. Bariyer sistemlerini noninvaziv olarak izlemek için hücresel monotabaka boyunca transepitelyal/transendolyal elektriksel direnç (TEER) ölçümü2,18,19kullanılabilir. Bipolar elektrot sistemleri elektrot-elektrolit arabirimindeki elektrot polarizasyon empedanstan etkilendiği için, tetrapolar ölçümler genellikle bu sınırlamayı aşmak için kullanılır20. Altatma tekniği ilk William Thomson (Lord Kelvin)21tarafından 1861 yılında açıklanan dört terminalli algılama (4T) olduğunu. Kısacası, akım akım taşıyan elektrotlar bir çift tarafından enjekte edilirken, gerilim ingvesini ölçmek için ikinci bir çift voltaj algılama elektrotları kullanılır20. Günümüzde, sözde çubuk elektrotlar çift elektrotlar bir çift oluşur, her gerilim ölçmek için bir gümüş / gümüş-klorür pelet içeren veakım2 geçmek için gümüş elektrot. Elektriksel empedans, apikal ve bazolateral bölme arasında ölçülür ve hücre tabakası arasındadır (Şekil 1). Dış elektrotlara tipik olarak 12,5 Hz frekansta kare dalga sinyali uygulanır ve ortaya çıkan alternatif akım (AC) ölçülür. Ayrıca, hücre tabakası boyunca potansiyel düşüş ikinci (iç) elektrot çifti ile ölçülür. Elektrikempdansı Daha sonra Ohm yasasına göre hesaplanır. TEER değerleri empedans ve hücre tabakası yüzey alanının çarpılmasıyla normalleşir ve genellikle Ω olarak ifade edilir .

Hücrelerin ve elektrotların daha sofistike bir şekilde düzenlendiği, ancak aynı zamanda 4T ölçüm prensibine dayandığı ve aynı ölçüm cihazlarıyla kullanılabildiği sistemler vardır. Örneğin, filtrenin yerleştirildiği EndOhm sistemleri, çubuk elektrotla aynı yapıya sahip bir çift konsantrik elektrotiçeren bir hazne ve kapak içerir. Elektrotların şekli membran boyunca daha düzgün bir akım yoğunluğu akışı sağlar, böylece okumalar arasındaki değişimi azaltır. Daha da karmaşık (ama aynı zamanda daha doğru) bir Hücre tabakası Ringer çözeltisi22ile dolu iki oda ayırır bir Ussing odası vardır. Oda kendisi oksijen ile gazlı olabilir, CO2, veya N2, ve karıştırılır veya deneysel maddeler ile takviye. Hücre tabakası boyunca iyon taşıması meydana geldiğinde, potansiyel bir fark doku ya da yakın iki voltaj algılama elektrotları ile ölçülebilir. Bu voltaj, hücre tabakasının yanına yerleştirilen iki akım taşıyan elektrot tarafından iptal edilir. Ölçülen akım daha sonra net iyon taşıma ve bariyer bütünlüğünü yansıtan transepitelyal direnç verecek,22belirlenebilir. TEER ölçümü, bariyer doku modellerini temsil eden çip üzerine vücut sistemlerinde de uygulanabilir23,24. Bu sistemler hücrelerin in vivo koşullarını taklit eder ve genellikle katmanlar halinde üst üste yığılmış çeşitli hücre türlerinden oluşur.

Aşağıdaki protokol, teer'de ticari olarak kullanılabilen ölçüm sistemlerine kıyasla istatistiksel olarak anlamlı fark lar üreten programlanabilir çıkış frekansına sahip uygun maliyetli ve güvenilir bir voltammetrenin nasıl kurulabildiğini açıklamaktadır.

Protokol

1. TEER ölçümü için temel bir volt-ampermetremontajı

  1. 5 V D.C. güç kaynağı, USB uzatma kablosu, programlanabilir kare dalga jeneratörü olarak kullanılacak bir mikrodenetleyici, alternatif akım ve gerilimi kök ortalama kare olarak ölçebilen iki standart multimetre olarak standart bir USB şarj cihazı hazırlayın ( True-RMS), muz fişleri ile dört kablo, iç dört kablolu altı pimleri de dahil olmak üzere bir RJ14 kadın konektör ile bir telefon uzatma kablosu (6P4C), iki kısa kablo, bir parlaklık terminali, bir 120 kΩ pre-resistor, tel uç ferrules ve lehim lugs. Gerekli araçlar bir yalıtım sıyırıcı, bir kıvrımlı araç ve bir lehim demirvardır.
  2. İlk olarak USB uzantısını mikrodenetleyici kartına bağlayın.
  3. İki kısa kablonun uç yalıtımını soyun. Kablo başına bir tarafı doğrudan mikrodenetleyicinin 0 ve 2 numaralı pimlerine veya lehimlü luglara lehimleme için lehimleme, bu da ilgili pimlere kırpılır. Diğer uçları tel ucu ferrules'a bağlayın ve Şekil 1'detasvir edildiği gibi bir parlaklık terminaline bağlayın.
  4. Muz fişini multimetrelere bağlayın. Dört kablonun her birinin diğer ucunu sıyırın ve kırıştırın.
  5. Telefon uzatma kablosunu iki parçaya kesin ve dişi konektör içeren tarafın iletkenlerini söküp kırpın. İletkenlerin ve pimlerin sürekliliğini kontrol edin.
  6. İlk multimetre, μA'daki akımı ölçmek için kullanılacaktır (AC modunun açıkça ayarlanması gerektiğini unutmayın). 120 kΩ ön dirençle bir seri halinde rj14 konektörünün beş ve altı sını sabitler, bu da çubuk elektrotun dış elektrot çiftine karşılık gelen bir seriye bağlayın.
  7. Son olarak, mV'deki transepitel gerilim düşüşünü ölçmek için kullanılacak olan ikinci multimetreyi, parlaklık terminali aracılığıyla RJ14 konektörünün üç ve dördünü, çubuk elektrotun iç elektrot çiftine karşılık gelen iğnelere bağlayın.
  8. İstenirse, montajı bir şasiye monte edin.

2. Mikrodenetleyicinin programlanması

  1. Sağlanan kaynak kodu (ek kodlama dosyası 1) gerektiği gibi değiştirin. Verilen formda, 0 ve 2 pinleri zemin ve +5 V arasında 40 ms salınım devresi ile dönüşümlü olacaktır. Böylece, 5 V genliği ve yaklaşık 12,5 Hz frekansı ile bir kare dalga sinyali üretilecektir. Mikrodenetleyicinin zaman yayıcısının yanlışlığı nedeniyle gerçek değerler farklılık gösterebilir.
  2. Mikrodenetleyiciyi usb bağlantı noktası üzerinden masaüstü bilgisayara bağlayın ve kaynak kodunu eşleşen yazılımla yükleyin25.

3. Voltaj osilogramlarının kaydı (isteğe bağlı)

  1. RJ14 konektörünün beş ve altı sını 1 kΩ test rezistansı ile bypass pinler ve bir osiloskopa bağlayın.
  2. Frekansı, pik voltajı ve dalga formunu kontrol edin. Verileri sayısallaştırın ve dışa aktarın.
  3. İstenirse, bir referans aygıtından (EVOM) ve karşılaştırma için kendi kendine monte edilmiş voltammetreden osilogramları kaydedin.
    NOT: Bu durumda, veriler Dijital Depolama Kapsamı HM 208 ile kaydedildi. Çok temel bir dijital osiloskop olan görüntü dahili dijital (dondurulmuş) olabilir ama analog PM 8143 X-Y kaydedici kullanılarak çizilmesi gerekiyordu. Görüntü daha sonra tarandı.

4. Hücre ekimi ve TEER ölçümü

  1. Tohum İnsan Koroid Pleksus Papilloma (HIBCPP) hücre kültürü filtre hücreleri DMEM/F12 3 μm gözenek boyutu ile ekler (Malzemeler Tablosubakınız) içeren 10% fetal buzağı serum9. Hücreleri 37 °C'de, Dinner ve ark.9'daaçıklandığı şekilde %5 CO2 içeren su doymuş bir atmosferde büyütün.
  2. Filtreler 70 Ω cm2'likbir empedansa ulaştığında serumsuz DMEM/F12'ye geçilir ve zaman noktasını 0 Gün olarak tanımlayın.
  3. Elektrot, kendi kendine monte edilmiş voltammetrenin RJ14 bağlantı noktasına bağlayın ve USB güç kaynağını takın. Multimetreleri sırasıyla AC gerilim modu (mV) ve AC akım moduna (μA) ayarlayın.
    1. Alternatif olarak, elektrotu ticari olarak kullanılabilen bir referans cihazına bağlayın ve üreticinin talimatlarına göre açın.
  4. Elektrodu 10 dakika boyunca %80 etanolde sterilize edin ve 10 dakika daha uygun ortamda dengeleyin.
  5. Elektrodu, ölçüm değerleri sabit kalana kadar hibcpp hücre tabakası içeren bir hücre kültürü filtre ekleme sisteminin her iki bölmesine (alt bölmedeki elektrotun uzun kısmı ve üst bölmedeki kısa kısmı) yerleştirin.
  6. Bir referans cihazı için empedansı doğrudan not edin veya kendi kendine monte edilen voltammetre için Ohm yasasına (R = U/I) göre empedansı hesaplayın. Elektrot açısının ölçümleri etkilediğini unutmayın.
  7. TEER ölçümlerini (adım 3−6) 0.günden 4.

Sonuçlar

Kendi kendine monte edilmiş voltammetrenin çalışmasını ticari olarak mevcut muadili ile karşılaştırmak için, her iki cihazın da voltaj osilogramı kaydedildi.

Şekil 2A'dagösterildiği gibi, referans cihazı 80 mV genlikli ve 1 kΩ test rezistansı ile on-load çalışırken 12,5 Hz frekansına karşılık gelen 80 ms salınım süresine sahip bir kare dalga sinyali oluşturup üret...

Tartışmalar

Kendi kendine yapılmış bir voltammetre günlük rutin kullanılabilir önce, uygun işlev için cihaz kontrol etmek esastır. Bizim olgumuzda, 40 ms (12.5 Hz) salınım ın yarı zamanlı olarak programlanmasına karşın, etkili salınım süresi 60 ms (16.7 Hz) olarak ortaya çıktı. Mikrodenetleyicinin zaman yayıcısının bu yanlışlığı TEER ölçümleri üzerinde tespit edilebilir bir etki yaratmaz. Çoklu metrelerden birinin frekans ayarını kullanarak gerçek frekansı belirlemek en iyisi olabilir. Herha...

Açıklamalar

Yazarların hiçbir rakip mali çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları var.

Teşekkürler

Yazarlar Elektroteknik ve bilişim konusunda uzman tavsiyeleri için Herman Liggesmeyer ve Marvin Bende teşekkür etmek istiyorum.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
120 kOhm resistorGeneral (generic) equipment
Banana plug cablesGeneral (generic) equipment
CablesGeneral (generic) equipment
Chopstick electrodeMerck MillicellMERSSTX01
Chopstick electrode (alternative)WPI World Precision InstrumentsSTX2
Crimping toolGeneral tool
Digispark / ATtiny85AZ-Delivery Vertriebs GmbHDigispark Rev.3 Kickstarter
DMEM:F12Gibco (Thermo Fisher)31330038
Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS)Life Technologies10270106
Filter inserts 3µm translucentGreiner Bioone662631
HIBCPPHiroshi Ishikawa / Horst Schroten
Insulation stripperGeneral tool
Luster terminalGeneral (generic) equipment
OscilloscopeHAMEGDigital Storage Scope HM 208
PlotterPHILIPSPM 8143 X-Y recorder
Software Arduinohttps://www.arduino.ccArduino 1.8.9
Soldering ironGeneral tool
Soldering lugsGeneral (generic) equipment
Telephone cable with RJ14 (6P4C) connectorGeneral (generic) equipment
Test resistorMerck MillicellMERSSTX04
True-RMS multimetersVOLTCRAFTVC185
USB chargerGeneral (generic) equipment
USB extension cordGeneral (generic) equipment
Voltohmmeter for TEER measurementWPI World Precision InstrumentsEVOM
Voltohmmeter for TEER measurement (alternative)Merck MillicellERS
Wire end ferrulesGeneral (generic) equipment

Referanslar

  1. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30, 228-234 (2003).
  2. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).
  3. Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).
  4. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).
  5. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
  6. Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).
  7. Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).
  8. Ishiwata, I., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP). Human Cell. 18, 67-72 (2005).
  9. Dinner, S., et al. A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
  10. Schwerk, C., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PLoS One. 7, e30069 (2012).
  11. Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).
  12. Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components. European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).
  13. Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes. Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).
  14. Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).
  15. Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).
  16. Mathia, N. R., et al. Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats. Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).
  17. Fuchs, S., et al. Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C. Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).
  18. Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).
  19. Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
  20. Yeste, J., et al. Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures. Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754 (2016).
  21. Northrup, E. VI: The Measurement of Low Resistance. Methods of Measuring Electrical Resistance. , 100-131 (1912).
  22. Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).
  23. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).
  24. Esch, M. B., et al. On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic 'body-on-a-chip' devices. Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).
  25. . Arduino Web Editor Available from: https://www.arduino.cc/en/Main/Software (2019)
  26. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5 (2013).
  27. Hufnagl, M. . Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. , (2010).
  28. Guimerà, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calderón, E., Villa, R., Dössel, O., Schlegel, W. C. Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. 25/7, (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 152transepitelyal elektrik direnciTEER4 terminal alg lamabariyervoltohmmetervoltammeter

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır