炎症敏感晚期缺氧缺血性脑损伤的Ferret模型

摘要

该方法描述了P17雪铁龙中发炎意识低氧缺血和高氧脑损伤，以模拟一些晚期早产儿经历的长期炎症和氧化性脑损伤之间的复杂相互作用。

摘要

目前需要临床上相关的围产期感染和缺氧-缺血（HI）模型，以测试早产症患者的治疗干预措施。铁杉是模拟早产儿大脑的理想候选者，因为它们出生时是脑电，产后发育有陀螺脑。出生时，雪铁龙大脑发育类似于13周的人类胎儿，产后（P）17个试剂盒被认为相当于妊娠32-36周的婴儿。我们描述了P17雪铁龙中的损伤模型，其中脂多糖组分后为双边脑缺血、缺氧和高血糖。这模拟了许多出现脑损伤的新生儿经历的长期炎症、缺血、缺氧和氧化应激的复杂相互作用。受伤的动物表现出一系列严重的损伤严重性，大脑中的形态变化包括缩小多个皮质陀螺和相关的硫化物。受伤的动物也表现出缓慢的反射发育，在自动走道中运动速度较慢和变速，在开阔的田野中减少探索。该模型提供了一个平台，用于测试与炎症和HI相关的新生儿脑病婴儿的假定疗法，研究影响皮质发育的损伤机制，并研究在不受影响的动物。

引言

目前需要大型动物模型，以反映早产和围产期缺氧-缺血症的病理生理学，在其中可以测试婴儿的治疗干预措施。2017年，在美国出生的382，726名婴儿中，9.93%是早产儿，其中84%的婴儿^在妊娠32至36周之间出生。在早产儿中，围产期接触感染或炎症很常见，其中由于病毒或细菌病原体而使产妇免疫活化可以启动早产。产后，早产儿有早或晚患败血症^{的高风险2。}早产儿也经常经历缺氧、低血压和高血糖期，原因是其心肺系统不成熟，大气中的氧气紧张程度高于子宫内的婴儿，以及异体性暴露。此外，在早产儿中，抗氧化防御是不^{成熟的3，}亲凋亡因子自然^调节4。氧化应激和细胞死亡导致免疫系统的激活和神经炎症。这些综合因素被认为有助于大脑的发育和生理脆弱性，并导致或加剧与早产^儿5、6、7发育不良结果相关的脑病。

由于雪铁龙大脑与人脑在物理和发育上的相似性，雪铁龙是一种有吸引力的物种，可以模拟脑损伤8、9、10、11、12。Ferrets也是模拟早产儿大脑的理想候选者，因为它们出生时是脑电，产后发育有陀螺的大脑，这为发育中的大脑暴露在侮辱中提供了一个窗口，模仿早产儿经历的侮辱。出生时，雪铁龙大脑发育类似于13周的人类胎儿，产后（P）17试剂盒被认为相当于^妊娠13周32-36周的婴儿。

我们小组最近发布了一个模型，在P10雪铁龙中，通过结合炎症敏感性与大肠杆菌脂多糖（LPS）与随后接触缺氧和高^血糖12的异常早产（<28周妊娠）脑损伤。在下面的协议中，我们现在描述了P17雪铁龙的晚期早产模型，LPS敏化之后是双边脑缺血、缺氧和高血糖。这导致一部分动物的损伤更为严重，并更密切地模拟了一些先期婴儿出现脑损伤的长期炎症、缺血、缺氧和氧化应激的复杂相互作用。

研究方案

程序是按照NIH《实验室动物护理和使用指南》和华盛顿大学机构动物护理和使用委员会批准的协议的一部分进行的。

1. 准备和LPS管理

注:有关过程的时间表，请参阅图 1。

1. 在开始手术之前，密封、消毒和高压灭菌所有手术器械和手术窗帘。在无菌小瓶中准备术前药物。计算在 8–10 分钟内用实验气体替换缺氧/高氧气室中空气所需的流量。
2. 在无菌盐水中制备脂多糖（来自大肠杆菌055:B5的LPS），以产生1mg/mL的浓度。 从电池中取出 P17 雪铁龙套件。称量并编号。通过垃圾和性别将动物随机化到对照组或受伤（或治疗）组。
3. 使用300 μL胰岛素注射器，在腹内施用3毫克/千克LPS，以在损伤组进行试剂盒，并施用同等体积的无菌盐水载体（3 μL/g）来控制动物。
4. 将动物置于水浴室中的37~40°C，以便在整个外科手术过程中保持36~37°C的目标直肠温度。

2. 麻醉

1. 在手术过程中，持续监测动物的温度、呼吸速率和心率。
2. 在手术前30分钟，在皮下施用丁丙诺啡（0.05毫克/千克）。诱导麻醉在混合物的3%的子胶平衡与100%氧气。从感应室中取出试剂盒，并将其放在设置为 37°C 的覆盖手术水毯上。将麻醉转移到鼻锥，并将单曲水平降低至2~3%。

3. 外科准备

1. 使用小型动物剪子去除腹颈区域的所有毛发。以矩形剃须，小心避免皮肤划伤或产生剃须皮疹。使用皮质利多卡因（4毫克/千克）和布皮瓦卡因（2.5毫克/千克）对被擦伤区域进行局部麻醉。
2. 用无菌棉签交替施用波维酮碘和70%乙醇磨砂，准备颈部。重复擦洗，使波维多-碘和70%乙醇分别以交替方式施用3倍。
3. 通过没有脚趾捏反射确认麻醉深度。保持分明的亚曲尼水平，在麻醉手术平面所需的最低百分比。使用无菌的一次性切口窗帘，暴露颈部区域，覆盖动物。

4. 双边胡萝卜动脉连接

1. 使用一次性#11手术刀，在颈部中心进行 1.5 厘米的中线切口。使用精细的节位和弯曲的钳子，直切到左胡萝卜动脉。将动脉从相关的神经血管束上分离。
2. 使用一对弯曲的细钳，通过动脉下10厘米长的无菌5-0丝缝合线。把缝合线切成两半。通过牢固地绑住两条长度的缝合线来拉闸道，在结之间留下至少2毫米。缝合线之间的左颈动脉，小心保持神经完好无损。
3. 在右侧重复解剖。用单条无菌 1/8 英寸脐带可逆地将右胡萝卜动脉绑住。用手术皮肤夹合伤口。
4. 在缺氧前，让动物在温控水浴中恢复至少30分钟。
   注:如果动脉没有完全与神经血管束的其余部分隔离，则在以后缺氧之前或期间可能会出现死亡率升高。

5. 连续缺氧、高血糖、缺氧

1. 在缺氧和高血糖期间，根据需要改变水浴温度，使哨点动物缺氧期间的直肠温度保持在37°C。
2. 将动物放在水浴室内的密封室中。持续监测腔内氧气浓度，以及至少一种哨点动物的直肠温度。用加湿的 9% 氧气（91% 氮气）冲洗腔室，然后根据腔室大小保持 3~5 L/min 的流速。一旦腔室中的氧气浓度达到9%，继续30分钟。
3. 30分钟后，将气体供应切换到80%加湿氧（20%氮气），并根据流量和腔室尺寸使腔室达到目标浓度。继续30分钟的高氧。打开腔室，使其通过与室内空气平衡，更快地到达诺莫夏。
4. 密封腔室，用 9% 加湿氧气冲洗。持续监控所有动物的视觉，注意动物显示的胸膜。一旦腔室中的氧气浓度达到9%，继续30分钟。如果在30分钟期结束前发现任何动物的缺氧死亡率（呼吸停止），立即终止缺氧。

6. 右胡萝卜动脉连接逆转

1. 将动物送回手术区，在3%的子胶混合物中诱导麻醉，并平衡100%氧气。将麻醉转移到鼻锥，并将单体水平降低至2~3%。取出手术伤口夹，用波维酮碘重新准备伤口区域。通过没有脚趾捏反射确认麻醉深度。将分夫人的水平保持在麻醉手术平面所需的最小百分比。使用无菌的一次性切口窗帘，暴露颈部区域，覆盖动物。
2. 使用弯曲的钳子，识别并解开右颈动脉的脐带。用手术皮肤夹合伤口。

7. 恢复和温度管理

1. 将所有套件返回其吉尔60分钟，用于护理和恢复。60分钟后，将受伤的动物送回水浴场37~40°C6小时，根据需要调节水温，使直肠温度保持在36~37°C。将工具包退回到他们的吉尔。
2. 手术后10~14天取出手术夹（P27~P31）。

8. 反射测试

1. 每天从 P21+P28 执行所有反射测试，每周至少执行 P28_P42 的 3 次反射测试，同时对接触（或治疗）组保持致盲。在反射测试之前，将试剂盒放入带热辅助（37 °C 水浴、热垫等）的腔室中 1 小时。对于每个测试，在测试下一个套件之前，完成每个套件的所有测试。
2. 负地理轴 （25°）
   1. 将平板（16 1/2 英寸 x 12 英寸）包裹在吸水式台面保护器中，防止物体，使板与桌子形成 25° 角。将套件放在容易下坡的板上，大约 75% 的路向上。
   2. 确保套件的身体是直的，并且在松开它之前，它的所有四个爪子都抓住板。一旦放置了套件，就开始时间评估。
   3. 记录套件相对于其起始位置旋转其主体 90° 的时间。记录套件旋转其主体 180° 的时间，然后向电路板顶部迈出整整一步。在进入下一个测试之前，在 25° 斜坡上执行 3 次试验。
3. 负地理轴 （45°）
   1. 再次对前面描述的负极性测试进行 3 次试验，这一次，电路板设定为 45° 角。
4. 悬崖厌恶
   1. 在窗台下方约 1 英尺处放置一个填充平台，以尽量减少在套件掉落时对套件的伤害。
   2. 放置一个面向实验室工作台边缘的套件，并垂直于实验室工作台的边缘。确保套件的机身笔直，其前爪与边缘齐平。从放置套件的那一刻起开始时间评估。注意区分远离悬崖的有意识的运动和其他不涉及协调行走的自发运动。
   3. 记录套件将身体移离边缘的时间（定义为套件备份、转动身体或将其前四肢移离边缘）。记录套件在边缘相反方向完成第一步的时间（定义为从其面向边缘的起始位置超过 90° 旋转的任何方向或角度）。
   4. 在进入下一个测试之前，每个套件执行 3 次悬崖厌恶试验。
5. 右反射
   1. 将套件放在长凳上，在松开之前轻轻地将其放在该位置，同时启动秒表。记录套件的静止时间，所有四个爪子同时平放在承重位置的长凳上。记录套件在任何方向上执行完整步骤的时间（定义为放置所有四个爪子，以便在给定方向上实现进度，无需旋转或拖动主体）。
   2. 每只动物进行5次右反射试验。
   3. 每个工具包完成5个正确的反射试验后，将垃圾送回吉尔。

9. 走道测试

1. 在 P42 上，从吉尔中取出套件。在测试前约 10 分钟将套件放入塑料笼中，以便它们能够适应环境。关闭测试室的灯，以确保环境光不会影响走道功能。
2. 在相关软件中创建新实验。调整实验设置，使最大运行持续时间不超过 10.00 s，最小运行持续时间不小于 1.50 s。设置最大速度变化，使其不超过 60%。为每个动物设定三次合规运行的最低要求。
3. 调整走道相对于动物大小的宽度，使其能够在不接触墙壁的情况下自由定位，同时保持足够窄，以阻止车削。使用自动检测在"检测设置配置文件"选项卡中添加新的检测设置。在给定年龄对所有垃圾和动物使用相同的检测设置。
4. 在每个动物之前和之后，用低绒纸纸巾和70%乙醇彻底清洁走道。定期清洁雪铁龙的爪子，以提高检测和分类的准确性。一旦走道和动物准备，开始试用采集。
5. 如果脚印积聚在玻璃上，或者动物通过尿液或粪便，暂停采集以清洁走道。一旦走道软件根据预先确定的实验设置识别了三次符合要求的运行，就停止采集。

10. 开放式现场测试 （P42）

1. 使用涂漆的哑光白色非孔丙烯酸盒（55 厘米 x 55 厘米 x 40 厘米高）。将摄像机定位在框正上方，并捕获所有四个墙壁。首次使用前和动物之间使用 70% 乙醇清洁测试场地。
2. 在相关软件中，选择"从模板新建"并应用预定义的模板。通过顺序选择"主题类型:其他"，继续设置过程;竞技场模板:开放场，方形;区域模板:中心、边框、角;要跟踪的功能:中心点。
3. 打开竞技场设置并从相机输入中抓取背景图像，确保竞技场墙壁的顶部可见。使用比例工具校准竞技场的尺寸。
4. 调整预定义的竞技场区域，调整轮廓以适合墙区（西北、NE、SW、SE）和地板区域（左上、中上、右上、左中、中、右中、左下、中下、右下）。验证设置以确认没有区域重叠。
5. 打开"获取"窗口，然后按"开始获取"。将雪铁龙置于测试舞台的中心，以一种对每个测试对象一致的方式。让雪铁龙在竞技场内自由移动5分钟。在测试期结束时，按"停止采集"。用下一个雪铁龙重复此过程。
   注:房间里的所有实验者都应该将自己定位为无法被雪铁龙观测到，并在测试期间保持安静。

11. 固定灌注

1. 在P42上，用5%的子胶进行深度麻醉试剂盒。施用五巴比妥过量（120~150毫克/千克i.p.）。由于没有对脚趾挤压和呼吸运动损失的反应，确保深度麻醉。
2. 将动物转移到烟罩。打开胸腔，用细的夹板夹紧下降主塔。切断右中庭。使用灌注泵，以 30 mL/min 的速度将左心室注入 60 mL 的无菌盐水，以 30 mL/min 的速度注入 60 mL 的甲酸（10% 甲醛）。
3. 用剪刀、钳子、钳子和铲子把尸体斩首，从头骨上取出大脑。拍摄每个大脑的背、腹和侧向的高分辨率照片。将大脑固定在正式中至少48小时。

12. Ex Vivo 大脑测量

1. 从形式（步骤11.3）中取出大脑，放在纸巾上吸收多余的液体。
2. 使用电子卡钳，通过将卡钳的尖端放在大脑的背和腹部分来测量大脑的高度。通过将卡钳的尖端放在嗅球和耳垂的后边界处，测量大脑的长度。通过将卡钳的尖端放在叶叶的最横向部分，测量大脑的宽度。称量大脑。
3. 测量纵向裂缝（前体和后部至十字硫酸盐），横向硫磺酸，苏西西尔西，半西尔西尔西尔西，伪西尔西，酸硫磺酸，西尔西，前西尔西，侧陀螺，苏普拉西尔文吉里，西格莫伊德吉里（前和后），日冕陀螺，叶松陀螺（前和后），和轨道陀螺。从相应硫磺的最不同部分的开头和结尾测量所有硫磺。从每个相应陀螺的最宽方面测量所有陀螺仪。
4. 通过将卡尺的一个尖端放在纵向裂缝的最后点，并将卡尺的另一个尖端放在小脑的最后半部分，测量小脑暴露量。
   注:在《费^雷特14号生物学与疾病》中发现的雪铁龙大脑图集，用于开发外生雪铁龙大脑测量。

13. 严重伤害评分

1. 使用步骤 11.3 中拍摄的照片，应用步骤 13.2_13.4 中的评分标准，以评估严重脑损伤（0+9 刻度），同时对接触（或治疗）组保持失明。
2. 评估纵向裂缝。如果看起来正常，则分配分数 0。如果它稍微加宽（大约 2 倍正常宽度），但宽度的增加在裂缝长度上不完整，则指定分数为 1。如果分数适度加宽（约 2~3 倍正常），则分配 2 分。如果明显加宽，沿大多数裂缝长度有可见的间隙 >3x 正常宽度，则应用 3 的分数。
3. 评估横向硫磺。如果它们显示正常定义，与侧陀螺仪和上西尔维安陀螺的分离，分配一个分数为0。如果看到轻微的单侧或双边减少的sulcus定义，特别是在牛角部分，与阴囊叶相比，前额叶和叶叶的缩小最小，则分配1分。
   1. 如果看到叶酸的定义适度减少， 与下一个亚西尔根陀螺，日冕和叶酸的收缩， 和轻度缩小的正面和叶相对于节叶， 分配分数 2.如果看到单边囊性退化，与反向半球的最小变化，分配3的分数。如果存在侧硫化物定义不佳，与双边囊肿或严重退化的卵叶和叶，分配分数 4。
4. 评估小脑的可见部分。如果它看起来正常，在 （<75% 的半球可见）和 <66% 的半球可见时，请分配 0 的分数。如果 75-90% 的半球和 +66% 的半球可见，则分配 1 的分数。如果大多数小脑可见，显示所有半球的害虫和 +66%，则分配 2 的分数。

14. 数据分析

1. 对于反射测试数据，为故障分配 61 秒的分数，以便将失败与时间结束时的成功（60 秒）进行比较，但在统计分析中排名更差。在每个反射测试中计算每个动物曲线下的面积。
2. 调整涉及爪子大小的压力，根据动物的重量的走道数据。
3. 使用非参数统计方法分析数据，使用中值和四分位数范围 （IQR） 描述数据。

结果

在受伤群体中，来自6个垃圾中的34只（n = 18男，n=16雌性）动物中，有8只动物（24%;n = 4雄，n=4雌性）在第二个缺氧期（n = 5），在温度管理期间（n = 2），或在侮辱后过夜（n = 1）。在受伤群体中，26名幸存者中有9人（35%）有明显的严重伤害。5只动物（n = 5只雄性）有中度损伤，4只动物（n = 2雄，n =2雌性）有严重伤害，定义为病理评分分别为2⁄5和6+9（图2A）。因?...

讨论

由于雪铁龙大脑和人脑之间的物理和发育相似性，雪铁龙正越来越多地被用来模拟成人和发育性脑损伤。^{8，9，10，11，12}。然而，迄今为止的研究表明，雪铁龙大脑既对初始损伤有抵抗力，而且具有高度可塑性，行为缺陷会随着时间而减少，即使在可见的病理^损...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
80% Oxygen	Praxair
9% Oxygen	Praxair
Absorbent benchtop protector	Kimtech	7546
Automated catwalk	Noldus
Betadine surgical scrub
Bupivacaine	Patterson Veterinary	07-888-9382
Buprenorphine
Calipers	SRA Measurement Products	ME-CAL-FP-200	200 mm range, 0.01 mm resolution
Cotton Gauze Sponge	Fisher Scientific	22028556
Curved fine hemostat	Roboz	RS-7101
Curved forceps	World Precision Instruments	501215
Curved suture-tying hemostat	Roboz	RS-7111
Ethovision tracking software	Noldus
Eye Lubricant	Rugby	NDC 0536-1970-72
Ferrets (Mustela putorius furo)	Marshall Biosciences		Outbred (no specific strain)
Formalin	Fisher Scientific	SF100-4	10% (Phosphate Buffer/Certified)
Hair Clippers	Conair	GMT175N
Insulin Syringes	BD	329461	0.3 cc 3 mm 31 G
Isoflurane	Piramal	66794-017-25
Lidocaine	Patterson Veterinary	07-808-8202
LPS	List Biological	LPS Ultrapure #423
Oxygen sensor	BW Gas Alert	GAXT-X-DL-2
Pentobarbital
Plastic chamber	Tellfresh	1960	10 L; 373 x 270 x 135 mm3
Saline Solution, 0.9%	Hospira	RL-4492
Scalpel blade	Integra Miltex	297
Scalpel handle	World Precision Instruments	500236	#3, 13 cm
Sterile suture	Fine Science Tools	18020-50	Braided Silk, 5/0
Surgical clip applicator	Fine Science Tools	12020-09
Surgical clip remover	Fine Science Tools	12023-00
Surgical drapes	Medline Unidrape	VET3000
Surgical gloves	Ansell Perry Inc	5785004
Surigical clips	Fine Science Tools	12022-09
Thermometer (rectal)	YSI	Precision 4000A
Thermometer (water)	Fisher Scientific	14-648-26
Umbilical tape	Grafco	3031	Sterile
Water bath	Thermo Scientific	TSCOL19	19 L