Ein Frettchenmodell einer entzündungssensibilisierten spätpräfristifernen hypoxischen-ischämischen Hirnverletzung

Zusammenfassung

Die Methode beschreibt entzündungsempfindliche hypoxisch-ischämische und hyperoxische Hirnverletzungen im P17-Ferret, um die komplexe Wechselwirkung zwischen längeren Entzündungen und oxidativen Hirnverletzungen bei einer Reihe von späten Frühgeborenen zu modellieren.

Zusammenfassung

Es besteht ein ständiger Bedarf an klinisch relevanten Modellen der perinatalen Infektion und Hypoxia-Ischämie (HI), in denen therapeutische Interventionen für Säuglinge mit der neurologischen Fortsetzung der Frühreife getestet werden können. Frettchen sind ideale Kandidaten für die Modellierung des frühgeborenen menschlichen Gehirns, da sie lissencephalic geboren werden und gyrencephale Gehirne postnatal entwickeln. Bei der Geburt ähnelt die Entwicklung des Frettchen-Gehirns einem 13-wöchigen menschlichen Fötus, wobei postnatale Tagessätze (P) 17 Kits als gleichwertig mit einem Säugling bei 32–36 Wochen Schwangerschaft angesehen werden. Wir beschreiben ein Verletzungsmodell im Frettchen P17, bei dem auf die Verabreichung von Lipopolysaccharid bilaterale zerebrale Ischämie, Hypoxie und Hyperoxia folgt. Dies simuliert die komplexe Wechselwirkung von längeren Entzündungen, Ischämie, Hypoxie, und oxidativen Stress in einer Reihe von Neonaten erlebt, die Hirnverletzungen entwickeln. Verletzte Tiere zeigen eine Reihe von schweren Verletzungen Schwere, mit morphologischen Veränderungen im Gehirn einschließlich Verengung von multiplen kortikalen Gyri und damit verbundenen Sulci. Verletzte Tiere zeigen auch verlangsamte Reflexentwicklung, langsamere und variablere Geschwindigkeit der Fortbewegung in einem automatisierten Laufsteg und verringerte Exploration in einem offenen Feld. Dieses Modell bietet eine Plattform, um vermeintliche Therapien für Säuglinge mit neonataler Enzephalopathie im Zusammenhang mit Entzündungen und HI zu testen, Verletzungsmechanismen zu untersuchen, die die kortikale Entwicklung beeinflussen, und Wege zu untersuchen, die Resilienz in nicht betroffene Tiere.

Einleitung

Es besteht ein ständiger Bedarf an großen Tiermodellen, die die Pathophysiologie der Frühreife und perinatalen Hypoxia-Ischämie widerspiegeln, in denen therapeutische Interventionen für Säuglinge getestet werden können. Im Jahr 2017 wurden 9,93% der 382.726 in den Vereinigten Staaten geborenen Säuglinge früh geboren, und 84% dieser Säuglinge wurden zwischen 32 und 36 Wochen der Schwangerschaft¹geboren. Bei Frühgeborenen ist eine perinatale Exposition gegenüber Infektionen oder Entzündungen häufig, bei denen die aktivierung des mütterlichen Immunsystems durch virale oder bakterielle Krankheitserreger Früharbeit auslösen kann. Postnatal sind Frühgeborene einem hohen Risiko für eine frühe oder späte Sepsis²ausgesetzt. Frühgeborene erleben auch häufig Perioden von Hypoxie, Hypotonie und Hyperoxia aufgrund ihres unreifen kardiorespiratorischen Systems, erhöhte Sauerstoffspannung in der Atmosphäre im Vergleich zu denen in der Gebärmutter erlebt, und iatrogene Expositionen. Zusätzlich, bei Frühgeborenen, antioxidative Abwehrkräfte sind unreif³ und pro-apoptotische Faktoren sind natürlich upregulated⁴. Oxidativer Stress und Zelltod führen zur Aktivierung des Immunsystems und Neuroinflammation. Diese kombinierten Faktoren werden gedacht, um zur Entwicklungs- und physiologischen Verletzlichkeit des Gehirns beitragen, und führen zu oder verschlimmern die Enzephalopathie mit schlechten Entwicklungsergebnissen bei Frühgeborenen^5,6,7.

Aufgrund der physikalischen und entwicklungsähnlichen Ähnlichkeiten, die das Frettchenhirn mit dem menschlichen Gehirn teilt, ist das Frettchen eine attraktive Spezies, bei der Hirnverletzungen^8,9,10,11,12modellieren können. Ferrets sind auch ideale Kandidaten, um das frühgeborene menschliche Gehirn zu modellieren, da sie lissencephalic geboren werden und gyrencephale Gehirne postnatal entwickeln, die ein Fenster bieten, in dem das sich entwickelnde Gehirn Beleidigungen auszusetzen ist, die diejenigen nachahmen, die von Säuglingen erlebt werden, die früh geboren wurden. Bei der Geburt ähnelt die Entwicklung des Frettchen-Gehirns einem 13-wöchigen menschlichen Fötus, wobei postnatale Tagessätze (P) 17 Kits als gleichwertig mit einem Säugling bei 32–36 Wochen Schwangerschaft¹³angesehen werden.

Unsere Gruppe hat vor kurzem ein Modell für extrem frühfristige (<28 Wochen Schwangerschaft) Hirnverletzung im P10 Frettchen veröffentlicht, indem eine entzündliche Sensibilisierung mit Escherichia coli Lipopolysaccharid (LPS) mit anschließender Exposition gegenüber Hypoxie und Hyperoxia¹²kombiniert wird. Im folgenden Protokoll beschreiben wir nun ein spätes Frühsprätermmodell im P17-Ferret, bei dem auf die LPS-Sensibilisierung bilaterale zerebrale Ischämie, Hypoxie und Hyperoxia folgt. Dies führt zu schwereren Verletzungen bei einer Teilmenge von Tieren, und genauer modelliert die komplexe Wechselwirkung von längeren Entzündungen, Ischämie, Hypoxie, und oxidativen Stress erlebt in einer Reihe von Frühgeborenen, die Hirnverletzungen entwickeln.

Protokoll

Die Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und als Teil eines vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Washington genehmigten Protokolls durchgeführt.

1. Vorbereitung und LPS-Administration

HINWEIS: Eine Zeitleiste der Verfahren finden Sie in Abbildung 1.

1. Vor dem Eingriff alle chirurgischen Instrumente und chirurgischen Vorhänge versiegeln, sterilisieren und autoklavieren. Bereiten Sie präoperative Medikamente in sterilen Durchstechflaschen vor. Berechnen Sie den Durchfluss, der erforderlich ist, um die Luft in der Hypoxie/Hyperoxia-Kammer in 8–10 min durch das Versuchsgas zu ersetzen.
2. Bereiten Sie das Lipopolysaccharid (LPS von E. coli 055:B5) in steriler Kochsaline vor, um eine Konzentration von 1 mg/ml zu ergeben. Entfernen Sie P17 Frettchen-Kits von ihren Jills. Wiegen und nummerieren Sie sie. Randomize Tiere durch Wurf und Sex zu den Kontroll- oder verletzten (oder Behandlungs-)Gruppen.
3. Mit einer 300-L-Insulinspritze 3 mg/kg LPS intraperitoneal an Kits in der Verletzungsgruppe und ein entsprechendes Volumen an sterilem Saline-Fahrzeug (3 l/g) zur Kontrolle von Tieren verabreichen.
4. Legen Sie die Tiere in einer Kammer in einem Wasserbad bei 37–40 °C, um während der chirurgischen Eingriffe eine Ziel-Rektaltemperatur von 36–37 °C zu halten.

2. Anästhesie

1. Während des Eingriffs, kontinuierlich überwachen Temperatur, Atmungsrate, und Herzfrequenz des Tieres.
2. Buprenorphin (0,05 mg/kg) 30 min subkutan vor dem chirurgischen Eingriff verabreichen. Induzieren Anästhesie in einer Mischung von 3% Isofluran mit 100% Sauerstoff ausgeglichen. Entfernen Sie das Kit aus der Induktionskammer und legen Sie es auf eine drapierte chirurgische Wasserdecke, die auf 37 °C eingestellt ist. Anästhesie auf den Nasenkegel übertragen und Isofluranspiegel auf 2–3% reduzieren.

3. Chirurgische Vorbereitung

1. Mit kleinen Tierknipsern entfernen Sie alle Haare auf dem ventralen Halsbereich. Rasieren Sie in einem rechteckigen Muster mit Sorgfalt, um zu vermeiden, die Haut zu nicken oder Rasiermesser Ausschlag zu erzeugen. Lokalanästhesie mit intradermalen Lidocain (4 mg/kg) und Bupivacain (2,5 mg/kg) auf den rasierten Bereich verabreichen.
2. Bereiten Sie den Hals durch abwechselnde Anwendung von Povidon-Jod und 70% Ethanol Peeling mit sterilen Wattestäbchen. Wiederholen Sie das Peeling so, dass Povidon-Jod und 70% Ethanol jeweils 3x abwechselnd aufgetragen werden.
3. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Abwesenheit von Zehen-Pinch-Reflex. Halten Sie das Isofluranniveau auf dem Mindestprozentsatz, der für eine chirurgische Anästhesieebene erforderlich ist. Mit sterilen Einweg-Ausschnitt-Vorhänge, die den Halsbereich aussetzen, drapieren Sie das Tier.

4. Bilaterale Carotis Artery Ligation

1. Mit einem einweg #11 Skalpellklinge, machen Sie einen 1,5 cm Mittellinienschnitt in der Mitte des Halses. Mit feinen Hämostaten und gekrümmten Zangen, stumpf nach unten auf die linke Halsschlagader sezieren. Sezieren Sie die Arterie weg vom zugehörigen neurovaskulären Bündel.
2. Mit einem Paar gekrümmter feiner Zange, passieren Sie eine Schleife 10 cm Länge der sterilen 5-0 Seidennaht unter der Arterie. Die Naht halbieren. Ligate die Arterie, indem sie beide Längen der Naht sicher binden, so dass mindestens 2 mm zwischen den Knoten. Transect die linke Halsschlagader zwischen den Nähten, wobei darauf geachtet wird, den Nerv intakt zu lassen.
3. Wiederholen Sie die Sezierpartie auf der rechten Seite. Reversibel ligate die rechte Halsschlagader mit einer einzigen sterilen 1/8 Zoll Nabelkrawatte. Schließen Sie die Wunde mit chirurgischen Hautclips.
4. Lassen Sie das Tier in einem temperaturgeregelten Wasserbad für mindestens 30 min vor Hypoxie erholen.
   HINWEIS: Wenn die Arterien nicht vollständig vom Rest des neurovaskulären Bündels isoliert sind, kann eine erhöhte Sterblichkeit vor oder während der späteren Hypoxie beobachtet werden.

5. Sequenzielle Hypoxie, Hyperoxia und Hypoxie

1. Während Hypoxie und Hyperoxia die Wasserbadetemperatur nach Bedarf ändern, um die Rektaltemperatur während der Hypoxie bei 37 °C im Sentineltier(n) aufrechtzuerhalten.
2. Legen Sie Tiere in der Verletzungsgruppe in eine luftdichte Kammer innerhalb eines Wasserbades. Kontinuierliche Überwachung der Sauerstoffkonzentration in der Kammer sowie der Rektaltemperatur in mindestens einem Sentineltier. Spülen Sie die Kammer mit befeuchtetem 9% Sauerstoff (91% Stickstoff) und halten Sie dann eine Durchflussrate von 3–5 l/min, abhängig von der Kammergröße. Sobald die Sauerstoffkonzentration in der Kammer 9% erreicht hat, weiter für 30 min.
3. Nach 30 min die Gasversorgung auf 80% befeuchteten Sauerstoff (20% Stickstoff) umstellen und der Kammer ermöglichen, die Zielkonzentration basierend auf Durchflussrate und Kammergröße zu erreichen. Fahren Sie 30 min Hyperoxia fort. Öffnen Sie die Kammer, damit sie durch Gleichgewicht mit Raumluft schneller normoxia erreichen kann.
4. Versiegeln Sie die Kammer und spülen Sie mit 9% befeuchtetem Sauerstoff. Kontinuierliche Überwachung aller Tiere visuell, beachten Sie Tiere, die Bradypnoe zeigen. Sobald die Sauerstoffkonzentration in der Kammer 9% erreicht hat, weiter für 30 min. Wenn die intrahypoxische Mortalität (Atemstillstand) bei einem der Tiere vor dem Ende der 30-min-Periode beobachtet wird, beenden Sie hypoxie sofort.

6. Umkehrung der rechten Carotis Arterie Ligation

1. Bringen Sie Tiere in den operationschirurgischen Bereich zurück und induzieren Sie Anästhesie in einer Mischung von 3% Isofluran, die mit 100% Sauerstoff ausgeglichen sind. Anästhesie auf Nasenkegel übertragen und Isofluranspiegel auf 2–3% reduzieren. Entfernen Sie die chirurgischen Wundclips und bereiten Sie den Wundbereich mit Povidon-Jod wieder vor. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Abwesenheit von Zehen-Pinch-Reflex. Halten Sie den Isoflurangehalt auf dem Mindestprozentsatz, der für eine chirurgische Anästhesieebene erforderlich ist. Mit sterilen Einweg-Ausschnitt-Vorhänge, die den Halsbereich aussetzen, drapieren Sie das Tier.
2. Identifizieren und binden Sie das Nabelband mit gekrümmten Zangen von der rechten Halsschlagader. Schließen Sie die Wunde mit chirurgischen Hautclips.

7. Recovery und Temperaturmanagement

1. Bringen Sie alle Kits für 60 min in ihre Jills zurück, für Diepflege und Genesung. Nach 60 min kehren Sie verletzte Tiere bei 37–40 °C für 6 h in die Wasserbäder zurück und passen die Wassertemperatur nach Bedarf an, um die Rektaltemperatur bei 36–37 °C zu halten. Bringen Sie Kits an ihre Jills zurück.
2. Entfernen Sie chirurgische Clips 10–14 Tage nach der Operation (P27–P31).

8. Reflexprüfung

1. Führen Sie alle Reflextests täglich von P21–P28 und mindestens 3x pro Woche von P28–P42 durch, während Sie blind gegenüber der Expositions- (oder Behandlungs-)Gruppe bleiben. Vor der Reflexprüfung Kits 1 h in eine Kammer mit Wärmeunterstützung (37 °C Wasserbad, Wärmepolster usw.) stellen. Führen Sie für jeden Test alle Tests pro Kit aus, bevor Sie das nächste Kit testen.
2. Negative Geotaxis (25°)
   1. Legen Sie eine flache Platte (16 1/2 in. x 12 in.) in einem saugfähigen Sitzschutz gegen ein Objekt gewickelt, so dass die Platte einen 25°-Winkel mit dem Tisch bildet. Legen Sie ein Kit auf das Brett anfällig und nach unten, etwa 75% des Weges nach oben das Brett.
   2. Stellen Sie sicher, dass der Körper des Kits gerade ist und dass alle vier Pfoten gegen das Brett gegriffen sind, bevor Sie es loslassen. Sobald das Kit platziert ist, beginnen Sie mit der Zeitbewertung.
   3. Zeichnen Sie die Zeit auf, zu der es dem Kit gelingt, seinen Körper um 90° relativ zu seiner Ausgangsposition zu drehen. Zeichnen Sie die Zeit auf, zu der das Kit seinen Körper um 180° dreht und einen vollen Schritt in Richtung der Oberseite des Boards macht. Führen Sie 3 Versuche an der 25°-Neigung durch, bevor Sie zum nächsten Test übergehen.
3. Negative Geotaxis (45°)
   1. Führen Sie erneut 3 Versuche des zuvor beschriebenen negativen Geotaxis-Tests durch, diesmal mit einem 45°-Winkel der Platine.
4. Klippen-Aversion
   1. Platzieren Sie eine gepolsterte Plattform etwa 1 Fuß unter der Leiste, um Verletzungen von Kits zu minimieren, wenn sie fallen.
   2. Platzieren Sie ein Kit nach und senkrecht zum Rand der Laborbank. Stellen Sie sicher, dass der Körper des Kits gerade ist, wobei seine Vorderpfoten bündig mit der Kante sind. Beginnen Sie die Zeitbewertung ab dem Zeitpunkt, an dem das Kit platziert wird. Achten Sie darauf, zwischen bewusster Bewegung weg von der Klippe und anderen spontanen Bewegungen zu unterscheiden, die kein koordiniertes Gehen beinhalten.
   3. Zeichnen Sie die Zeit auf, zu der das Kit seinen Körper von der Kante wegbewegt (definiert als das Kit, das den Körper zurückstellt, seinen Körper dreht oder seine vorderen Gliedmaßen von der Kante wegbewegt). Zeichnen Sie die Zeit auf, zu der das Kit seinen ersten Schritt in entgegengesetzter Richtung der Kante abschließt (definiert als jede Richtung oder ein Winkel, der über eine 90°-Drehung von seiner Startposition nach der Kante hinausgeht).
   4. Führen Sie 3 Klippenaversionsversuche pro Kit durch, bevor Sie zum nächsten Test übergehen.
5. Rechter Reflex
   1. Legen Sie ein Kit supine auf der Bank, halten Sie es sanft in dieser Position, bevor Sie es loslassen und gleichzeitig die Stoppuhr zu beginnen. Zeichnen Sie die Zeit auf, die sich das Kit mit allen vier Pfoten gleichzeitig flach gegen die Bank in gewichtstragenden Positionen zum Liegen bringt. Zeichnen Sie die Zeit auf, zu der das Kit einen vollen Schritt in eine beliebige Richtung macht (definiert als die Platzierung aller vier Pfoten, um Fortschritte in einer bestimmten Richtung ohne Drehen oder Ziehen des Körpers zu erzielen).
   2. Führen Sie 5 Versuche des Rechtsreflextests pro Tier durch.
   3. Nachdem jeder Satz die 5 richtigen Reflexversuche abgeschlossen hat, geben Sie den Wurf an den Jill zurück.

9. Catwalk-Tests

1. Entfernen Sie auf P42 Kits aus dem Jill. Legen Sie Kits ca. 10 min vor dem Testen in Kunststoffkäfige, damit sie sich an die Umwelt anklimatisieren können. Schalten Sie die Lichter im Testraum aus, um sicherzustellen, dass das Umgebungslicht die Laufstegfunktion nicht beeinträchtigt.
2. Erstellen Sie ein neues Experiment in der entsprechenden Software. Passen Sie die experimentellen Einstellungen so an, dass die maximale Laufzeit 10,00 s und die minimale Laufzeit nicht weniger als 1,50 s beträgt. Legen Sie die maximale Geschwindigkeitsvariation so fest, dass sie 60 % nicht überschreitet. Legen Sie eine Mindestanforderung von drei konformen Läufen für jedes Tier fest.
3. Passen Sie die Breite des Gehwegs relativ zur Größe des Tieres an, so dass es in der Lage ist, frei zu locomote, ohne die Wände zu berühren, während es schmal genug bleibt, um das Abbiegen zu verhindern. Fügen Sie mithilfe der automatischen Erkennung eine neue Erkennungseinstellung auf der Registerkarte Profile für Erkennungseinstellungen hinzu. Verwenden Sie die gleichen Erkennungseinstellungen für alle Würfe und Tiere in einem bestimmten Alter.
4. Reinigen Sie den Gehweg vor und nach jedem Tier gründlich mit einem papierarmen Papiergewebe und 70 % Ethanol. Reinigen Sie die Pfoten des Frettchens regelmäßig, um die Genauigkeit der Erkennung und Klassifizierung zu verbessern. Sobald der Gehweg und das Tier vorbereitet sind, beginnen Sie mit dem Erwerb von Versuchen.
5. Pause Erwerb, um den Laufsteg zu reinigen, wenn Fußabdrücke auf dem Glas sammeln, oder wenn Tiere Urin oder Kot passieren. Beenden Sie die Erfassung, sobald die Laufsteg-Software drei konforme Runs basierend auf den vorgegebenen Experimenteinstellungen erkannt hat.

10. Offene Feldprüfung (P42)

1. Verwenden Sie eine nicht poröse Acrylbox (55 cm x 55 cm x 40 cm hoch) mattweiß lackiert. Positionieren Sie die Kamera so, dass sie direkt über dem Kasten zentriert ist und alle vier Wände erfasst werden. Reinigen Sie die Testarena vor dem ersten Gebrauch und zwischen Tieren mit 70 % Ethanol.
2. Wählen Sie in der entsprechenden Software "Neue Vorlage" aus, und wenden Sie eine vordefinierte Vorlagean. Fahren Sie mit dem Einrichtungsverfahren fort, indem Sie sequenziell Dentumstyp: Andere auswählen. Arena-Vorlage: Offenes Feld, Quadrat; Zonenvorlage: Mitte, Rahmen, Ecken; Features zum Nachverfolgen: Mittelpunkt.
3. Öffnen Sie die Arena-Einstellungen, und greifen Sie das Hintergrundbild aus dem Kameraeingang, um sicherzustellen, dass die Oberseiten der Arenawände sichtbar sind. Kalibrieren Sie die Abmessungen der Arena mit dem Skalierungswerkzeug.
4. Passen Sie die vordefinierten Arenazonen an, indem Sie die Größe der Umrisse an die Wandzonen (NW, NE, SW, SE) und die Bodenzonen (links oben, unten oben, rechts oben, links oben, links in der Mitte, in der Mitte, in der rechten Mitte, links unten, unten, unten unten) anpassen. Überprüfen Sie die Einrichtung, um sicherzustellen, dass sich keine Zonen überlappen.
5. Öffnen Sie das Fenster "Erfassung" und drücken Sie "Akquisition starten ". Stellen Sie das Frettchen in die Mitte der Testarena, die für jeden Testgegenstand konsistent ist. Lassen Sie das Frettchen für einen Zeitraum von 5 min frei durch die Arena bewegen. Am Ende des Testzeitraums drücken Sie Stop Acquisition. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem nächsten Frettchen.
   HINWEIS: Alle Experimentatoren im Raum sollten sich so positionieren, dass sie vom Frettchen nicht beobachtbar sind und während der Testphase ruhig bleiben.

11. Fixierungsperfusion

1. Auf P42, tief anästhesisieren Kits mit 5% Isofluran. Eine Pentobarbital-Überdosierung (120–150 mg/kg i.p.) verabreichen. Sicherstellen einer tiefen Anästhesie durch mangelnde Reaktion auf Zehenstich und Verlust von Atemwegsbewegungen.
2. Übertragen Sie das Tier auf eine Dunstabzugshaube. Öffnen Sie den Thorax und klemmen Sie die absteigende Aorta mit feinen Hämostaten. Schneiden Sie das rechte Atrium. Mit einer Perfusionspumpe den linken Ventrikel mit 60 ml steriler Saline bei einer Rate von 30 ml/min durchdringen. Perfuse mit 60 ml Formalin (10% Formaldehyd) mit einer Rate von 30 ml/min.
3. Enthaupten Sie den Kadaver, und entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel mit Schere, Zange, Rongeurs und einem Spachtel. Nehmen Sie hochauflösende Fotos der dorsalen, ventralen und lateralen Aspekte jedes Gehirns auf. Post-Fix das Gehirn in Formalin für mindestens 48 h.

12. Ex-Vivo-Gehirnmessung

1. Entfernen Sie das Gehirn aus Formalin (Schritt 11.3) und legen Sie es auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit aufzunehmen.
2. Mit einem elektronischen Bremssattel, messen Sie die Höhe des Gehirns, indem Sie die Spitzen des Bremssattels an den dorsalen und ventralen Aspekten des Gehirns platzieren. Messen Sie die Länge des Gehirns, indem Sie die Spitzen des Bremssattels an der Olfaktor-Lampe und die hintere Grenze des okzipitalen Lappens platzieren. Messen Sie die Breite des Gehirns, indem Sie die Spitzen des Bremssattels auf die meisten seitlichen Teile der zeitlichen Lappen legen. Wiegen Sie das Gehirn.
3. Messen Sie die Längsspalte (vordere und hintere bis zum Kreuzbandsulcus), seitliche Sulci, suprasylvian sulci, coronal sulci, pseudosylvian sulci, ansinate sulci, cruciate sulci, presylvian sulci, lateral gyri, suprasylvian gyri, sigmoid gyri ( vorder und hinter), koronaler Gyri, ektosylvian gyri (vorder und hinter) und Orbitalgyri. Messen Sie alle Sulci vom Anfang und Ende des unterschiedlichsten Teils des entsprechenden Sulcus. Messen Sie alle Gyri aus dem breitesten Aspekt jedes entsprechenden Gyrus.
4. Messen Sie die Menge des ausgesetzten Kleinhirns, indem Sie eine Spitze des Bremssattels an der hintersten Stelle der Längsspalte platzieren und die andere Spitze des Bremssattels am hintersten Teil des Kleinhirns platzieren.
   HINWEIS: Der Frettchen-Hirnatlas, wie er in Biologie und Krankheiten des Ferret¹⁴gefunden wurde, wurde verwendet, um die ex vivo Frettchen-Gehirnmessungen zu entwickeln.

13. Brutto-Verletzungs-Scoring

1. Wenden Sie anhand der in Schritt 11.3. aufgenommenen Fotos die Bewertungskriterien in den Schritten 13.2–13.4 an, um grobe Hirnverletzungen (0–9-Skala) zu bewerten, während sie blind gegenüber Expositionsgruppen (oder Behandlungsgruppen) bleiben.
2. Bewerten Sie die Längsspalte. Wenn es normal erscheint, weisen Sie eine Punktzahl von 0 zu. Wenn es leicht verbreitert ist (ca. 2x normale Breite), aber die Erhöhung der Breite ist unvollständig entlang der Länge der Spalte, weisen Sie eine Punktzahl von 1. Wenn es mäßig erweitert ist (ungefähr 2-3x normal), weisen Sie eine Punktzahl von 2 zu. Wenn es deutlich verbreitert ist, mit einem sichtbaren Spalt >3x normale Breite entlang der meisten der Länge der Spalte, wenden Sie eine Punktzahl von 3 an.
3. Bewerten Sie den lateralen Sulci. Wenn sie eine normale Definition aufweisen, mit Trennung des lateralen Gyri und des suprasylvian gyri, weisen Sie eine Punktzahl von 0 zu. Wenn eine leichte einseitige oder bilateralreduzierte Definition von Sulcus, insbesondere im kaudalen Teil, mit minimaler Verengung von frontalen und zeitlichen Lappen relativ zu den okzipitalen Lappen beobachtet wird, weisen Sie eine Punktzahl von 1 zu.
   1. Wenn eine mäßig reduzierte Definition des Sulci beobachtet wird, mit Depression des suprasylvianischen Gyri, Verengung des koronalen und ektolästischen Gyri, und einer leichten Verengung von frontalen und zeitlichen Lappen relativ zu okzipitalen Lappen, weisen Sie eine Punktzahl von 2 zu. Wenn eine einseitige zystische Degeneration mit minimaler Veränderung der kontralateralen Hemisphäre beobachtet wird, weisen Sie eine Punktzahl von 3 zu. Wenn eine schlechte Definition des lateralen Sulci vorhanden ist, mit bilateraler zystischer oder schwerer Degeneration der okzipitalen und zeitlichen Lappen, weisen Sie eine Punktzahl von 4 zu.
4. Bewerten Sie den sichtbaren Teil des Kleinhirns. Wenn es normal erscheint, mit (<75% der Vermis und <66% der Hemisphären sichtbar, weisen Sie eine Punktzahl von 0. Wenn 75–90 % der Vermis und 66 % der Hemisphären sichtbar sind, weisen Sie eine Punktzahl von 1 zu. Wenn der größte Teil des Kleinhirns sichtbar ist und alle Vermis und 66 % der Hemisphären anzeigt, weisen Sie eine Punktzahl von 2 zu.

14. Datenanalyse

1. Weisen Sie bei Reflextestdaten Fehler mit einer Punktzahl von 61 s zu, damit sie mit Erfolgen am Ende der Zeit (60 s) verglichen werden können, jedoch mit einer schlechteren Rangfolge in der statistischen Analyse. Berechnen Sie in jedem der Reflextests eine Fläche unter der Kurve für jedes Tier im Laufe der Zeit.
2. Passen Sie Laufstegdaten an, die die Pfotengröße des Drucks durch das Gewicht des Tieres betreffen.
3. Analysieren Sie Daten mit nicht-parametrischen statistischen Methoden und beschreiben Sie Daten mithilfe des Median- und Interquartilbereichs (IQR).

Ergebnisse

Von 34 (n = 18 Männchen, n = 16 Weibchen) Tieren aus sechs Wurfen, die der Beleidigung ausgesetzt waren, starben acht Tiere (24%; n = 4 Männchen, n = 4 Weibchen) in der verletzten Gruppe während der zweiten Hypoxieperiode (n = 5), während der Temperaturverwaltung (n = 2) oder über Nacht nach der Beleidigung (n = 1). In der verletzten Gruppe wurden neun von 26 Überlebenden (35%) hatte sichtbare grobe Verletzungen. Fünf Tiere (n = 5 Männchen) hatten mittelschwere Verletzungen, und vier Tiere (n = 2 Männchen, n = 2...

Diskussion

Aufgrund der physikalischen und entwicklungsähnlichen Ähnlichkeiten zwischen dem Frettchen-Gehirn und dem menschlichen Gehirn wird das Frettchen zunehmend verwendet, um sowohl Erwachsene als auch Entwicklungsverletzungen zu modellieren. ^8,9,10,11,12. Die bisherigen Untersuchungen deuten jedoch darauf hin, dass das Frettchenhirn sowohl resistent gegen anfäng...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
80% Oxygen	Praxair
9% Oxygen	Praxair
Absorbent benchtop protector	Kimtech	7546
Automated catwalk	Noldus
Betadine surgical scrub
Bupivacaine	Patterson Veterinary	07-888-9382
Buprenorphine
Calipers	SRA Measurement Products	ME-CAL-FP-200	200 mm range, 0.01 mm resolution
Cotton Gauze Sponge	Fisher Scientific	22028556
Curved fine hemostat	Roboz	RS-7101
Curved forceps	World Precision Instruments	501215
Curved suture-tying hemostat	Roboz	RS-7111
Ethovision tracking software	Noldus
Eye Lubricant	Rugby	NDC 0536-1970-72
Ferrets (Mustela putorius furo)	Marshall Biosciences		Outbred (no specific strain)
Formalin	Fisher Scientific	SF100-4	10% (Phosphate Buffer/Certified)
Hair Clippers	Conair	GMT175N
Insulin Syringes	BD	329461	0.3 cc 3 mm 31 G
Isoflurane	Piramal	66794-017-25
Lidocaine	Patterson Veterinary	07-808-8202
LPS	List Biological	LPS Ultrapure #423
Oxygen sensor	BW Gas Alert	GAXT-X-DL-2
Pentobarbital
Plastic chamber	Tellfresh	1960	10 L; 373 x 270 x 135 mm3
Saline Solution, 0.9%	Hospira	RL-4492
Scalpel blade	Integra Miltex	297
Scalpel handle	World Precision Instruments	500236	#3, 13 cm
Sterile suture	Fine Science Tools	18020-50	Braided Silk, 5/0
Surgical clip applicator	Fine Science Tools	12020-09
Surgical clip remover	Fine Science Tools	12023-00
Surgical drapes	Medline Unidrape	VET3000
Surgical gloves	Ansell Perry Inc	5785004
Surigical clips	Fine Science Tools	12022-09
Thermometer (rectal)	YSI	Precision 4000A
Thermometer (water)	Fisher Scientific	14-648-26
Umbilical tape	Grafco	3031	Sterile
Water bath	Thermo Scientific	TSCOL19	19 L