炎症感作後期低酸素虚血性脳損傷のフェレットモデル

要約

この方法は、P17フェレットにおける炎症感作性低酸素虚血性および高酸素性脳損傷を記述し、多くの後期乳児で経験した長期炎症と酸化脳損傷との間の複雑な相互作用をモデル化する。

要約

周産期感染および低酸素虚血(HI)の臨床的に関連するモデルの継続的な必要性があり、これは、未熟児の神経学的後遺症を有する乳児の治療的介入を試験する。フェレットは、リセンスケファルク生まれで、出生後にギレンセファリック脳を発症するので、早産の人間の脳をモデル化するための理想的な候補です。出生時、フェレット脳の発達は13週のヒト胎児に似ており、出生後の日(P)17キットは32~36週の妊娠で乳児と同等であると考えられる。我々は、リポ多糖投与の後に両側性脳虚血、低酸素症、および高酸素症が続くP17フェレットにおける傷害モデルを記述する。これは、脳損傷を発症する新生児の数で経験した長期炎症、虚血、低酸素症、および酸化ストレスの複雑な相互作用をシミュレートする。負傷した動物は、複数の皮質ジャイリおよび関連するスルシの狭窄を含む脳の形態学的変化を伴う、重症傷害重症度の範囲を示す。負傷した動物はまた、反射の発達が遅く、自動キャットウォークでの移動速度が遅く、より可変的な速度を示し、オープンフィールドでの探査を減少させた。このモデルは、炎症およびHIに関連する新生児脳症を有する乳児の病理療法を試験し、皮質発達に影響を与える傷害のメカニズムを研究し、回復力を提供する経路を調査するプラットフォームを提供するプラットフォームを提供する。影響を受けない動物。

概要

乳児の治療介入をテストできる未熟児および周産期低酸素虚血の病態生理学を反映する大型動物モデルの必要性が続いている。2017年には、米国で生まれた382,726人の乳児の9.93%が早産で、そのうち84%が^妊娠1の32~36週の間に生まれました。早期産児では、感染や炎症への周産期暴露が一般的であり、ウイルスまたは細菌病原体による母親の免疫活性化が早産を開始できる。出生後、早産児は早期または遅発性敗血症^のリスクが高い。早産児はまた、未熟な心呼吸器系、子宮内で経験した人に比べて大気中の酸素張力の上昇、およびイアトロゲン暴露のために、低酸素症、低血圧、および高酸素症の期間を頻繁に経験する。さらに、早産児では、抗酸化防御は未熟^な3であり、プロアポトーシス因子は自然にアップレギュレート^される4.酸化ストレスと細胞死は、免疫系と神経炎症の活性化につながります.これらの複合因子は、脳の発達および生理学的脆弱性に寄与すると考され、早産^児5、6、7における発達不良に関連する脳症を生じるまたは悪化させる。

フェレット脳が人間の脳と共有する物理的および発達的な類似点のために、フェレットは脳損傷をモデル化する魅力的な種である^8,9,10^,11,12.フェレットはまた、早産下脳症が生まれ、出生後にギレンセファリック脳を発達させるため、早産の人間の脳をモデル化するのに理想的な候補であり、早産で生まれた乳児を模倣する侮辱に発達中の脳を露出させる窓を提供する。出生時、フェレット脳の発達は13週のヒト胎児に似ており、出生後の日(P)17キットは^妊娠13週の32〜36週で乳児と同等であると考えられる。

私たちのグループは最近、低酸素症および高酸素^症12へのその後の暴露と大腸菌リポ多糖(LPS)と炎症性感作(LPS)を組み合わせることにより、P10フェレットにおける非常に早産(<28週)脳損傷のモデルを発表した。次のプロトコルでは、LPS感作が二国間脳虚血、低酸素症、および高酸素症が続くP17フェレットの後期早期モデルについて説明します。これは、動物のサブセットでより重度の傷害をもたらし、より密接に長引く炎症、虚血、低酸素症、および脳損傷を発症する多くの早産児で経験した酸化ストレスの複雑な相互作用をモデル化する。

プロトコル

手順は、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドに従って行われ、ワシントン大学機関動物ケアと使用委員会によって承認されたプロトコルの一部として行われました。

1. 準備とLPS管理

注:手順のタイムラインについては、図 1を参照してください。

1. 処置を最初に、シール、殺菌およびオートクレーブすべての外科器具および外科ドレープ。滅菌バイアルで手術前の薬を準備します。低酸素/超オキシアチャンバー内の空気を8~10分で実験ガスに置き換えるために必要な流量を計算します。
2. 無菌生理食塩水中にリポ多糖(大腸菌055:B5からのLPS)を調製し、濃度1mg/mLを生成する。ジルからP17フェレットキットを取り外します。それらを計量し、番号を付ける。コントロールまたは負傷(または治療)グループにごみやセックスによって動物をランダム化します。
3. 300 μLインスリン注射器を使用して、LPSの3mg/kgを傷害群のキットに静脈内投与し、動物を制御するために滅菌生理食塩水車(3μL/g)の同等量を投与する。
4. 手術を通して36~37°Cの目標直腸温度を維持するために、37~40°Cの水浴内の室内に動物を入れます。

2. 麻酔

1. 処置の間、動物の温度、呼吸数および心拍数を絶えず監視する。
2. 外科手術の30分前にブプレノルフィン(0.05 mg/kg)を皮下投与する。100%酸素とバランスの取れた3%のイソフルランの混合物で麻酔を誘発する。誘導室からキットを取り出し、37°Cに設定したドレープ手術用水毛布の上にサピングを置きます。鼻コーンに麻酔を移し、アイソフルランレベルを2~3%に下げる。

3. 外科的準備

1. 小さな動物のバリカンを使用して、腹頸部領域上のすべての毛を除去します。皮膚をニックしたり、カミソリの発疹を発生させないように注意して、長方形のパターンで剃ります。皮内リドカイン (4 mg/kg) とブピバカイン (2.5 mg/kg) を使用して、剃った領域に局所麻酔を投与します。.
2. 無菌綿棒でポビドロンヨウ素と70%エタノールスクラブのアプリケーションを交互に使用することにより、首を準備します。ポビドネ-ヨウ素と70%エタノールがそれぞれ交互に3倍に塗布されるようにスクラブを繰り返します。
3. つま先ピンチ反射の欠如を介して麻酔の深さを確認します。麻酔の外科平面に必要な最小パーセンテージでアイソフルランのレベルを維持する。首の領域を露出させる無菌の使い捨てカットアウトドレープを使用して、動物をドレープ。

4. 両側頸動脈合合体

1. メスのブレードを使用 #11して、首の中央に1.5cmの中線切開を行います。微細な止血と湾曲した鉗子を使用して、左頸動脈にぶっきらぼうに解剖する。関連する神経血管束から動脈を解剖する。
2. 湾曲した微細鉗子のペアを使用して、動脈の下に無菌5-0シルク縫合糸のループ10センチの長さを渡します。縫合糸を半分に切ります。縫合糸の両方の長さをしっかりと結び、結び目の間に少なくとも2ミリメートルを残すことによって動脈をリゲートします。縫合糸の間に左頸動脈を移し、神経をそのまま残すように注意する。
3. 右側の解剖を繰り返します。可逆的に単一の無菌1/8インチの臍のネクタイで右頸動脈をリゲートする。外科的なスキンクリップで傷を閉じます。
4. 低酸素症の前に少なくとも30分間、温度調節された水浴で動物が回復することを許可します。
   注:動脈が神経血管束の残りの部分から完全に単離されていない場合、死亡率の増加は低酸素症の前または後に見られることがある。

5. 逐次性低酸素症、高酸素症、低酸素症

1. 低酸素症および高酸素症の間に、センチネル動物の37°Cの低酸素の間に直腸温度を維持するために必要に応じて水浴温度を変える。
2. 水浴内の気密室に傷害群に動物を入れます。チャンバー内の酸素濃度、ならびに少なくとも1つのセンチネル動物における直腸温度を連続的に監視する。加湿した9%の酸素(91%窒素)でチャンバーを洗い流し、チャンバーのサイズに応じて3~5 L/分の流量を維持します。チャンバー内の酸素濃度が9%に達したら、30分間続けます。
3. 30分後、ガス供給を80%加湿酸素(20%窒素)に切り替え、流量とチャンバーサイズに基づいて目標濃度に到達できるようにします。高酸素症の30分間続けます。部屋の空気と平衡化することにより、より迅速にノルモクシアに到達できるようにチャンバーを開きます。
4. チャンバーを密封し、9%加湿酸素で洗い流します。すべての動物を視覚的に継続的に監視し、徐脈を示す動物をメモします。チャンバー内の酸素濃度が9%に達したら、30分間続けます。30分の期間の終わりまでにいずれかの動物で低酸素内死亡率(呼吸停止)が見られる場合は、直ちに低酸素症を終了する。

6. 右頸動脈ライゲーションの逆転

1. 動物を手術領域に戻し、100%酸素とバランスのとれた3%のイソフルランの混合物で麻酔を誘発する。鼻コーンに麻酔を移し、アイソフルランレベルを2~3%に下げる。外科的創傷クリップを取り外し、ポビドネ・ヨウ素で創傷領域を再準備する。つま先ピンチ反射の欠如を介して麻酔の深さを確認します。麻酔の外科平面に必要な最小パーセンテージでアイソフルランのレベルを維持する。首の領域を露出させる無菌の使い捨てカットアウトドレープを使用して、動物をドレープ。
2. 湾曲した鉗子を使用して、右頸動脈から臍テープを識別し、解き放つ。外科的なスキンクリップで傷を閉じます。

7. 回復と温度管理

1. すべてのキットを60分間ジルに戻し、授乳と回復のために。60分後、負傷した動物を37~40°Cの水浴に6時間戻し、必要に応じて水温を調整し、直腸温度を36~37°Cに保ちます。キットをジルに戻します。
2. 手術後10~14日後に手術用クリップを取り外します(P27–P31)。

8. 反射テスト

1. P21-P28から毎日すべての反射検査を行い、P28-P42から週に少なくとも3倍の反射検査を行い、その間に露出(または治療)群に盲目のまま。反射試験の前に、熱補助付きのチャンバー(37°水浴、ヒートパッドなど)にキットを1時間置きます。各テストについて、次のキットをテストする前に、キットごとにすべてのトライアルを完了します。
2. 負のジオタキシス (25°)
   1. ボードがテーブルと25°の角度を形成するように、オブジェクトに対して吸収ベンチトッププロテクタにラップされたフラットボード(16 1/2 in x 12in.)を置きます。ボードの上にキットを置き、下り坂に面しており、ボードの約75%をボードの上に置きます。
   2. キットの本体がまっすぐで、4本の足がすべてボードにつかまっていてから離してください。キットが配置されるとすぐに、時間評価を開始します。
   3. キットが開始位置を基準に90°回転する時間を記録します。キットが本体を180°回転させ、ボードの上部に向かって完全な一歩を踏み出す時間を記録します。次のテストに進む前に、25°傾斜で3回の試験を行います。
3. 負のジオタキシス (45°)
   1. 前述のネガティブジオタキシステストの3回の試験を再度実行し、今回はボードを45°角度に設定します。
4. クリフ・アバージョン
   1. 落下した場合のキットの傷害を最小限に抑えるために、棚の下に1フィート付近にパッド入りのプラットフォームを配置します。
   2. ラボ ベンチの端に向き、垂直にキットを配置します。キットの本体がまっすぐで、前面の足がエッジでフラッシュされていることを確認します。キットが配置された瞬間から時間評価を開始します。崖から離れた意識的な動きと、協調歩行を伴わない他の自発的な動きを区別するように注意してください。
   3. キットがエッジからボディを離れる時間を記録します(キットがバックアップ、ボディを回転、または前肢をエッジから離して移動すると定義されます)。キットがエッジの反対方向に最初のステップを完了した時間を記録します(エッジを向いた開始位置から 90°回転を超える方向または角度として定義されます)。
   4. 次のテストに進む前に、キットごとに3つの崖の嫌悪試験を実行します。
5. 右反射
   1. キットのスフィンをベンチに置き、その位置にそっと保持してから離し、同時にストップウォッチを開始します。キットが重量を持つ位置のベンチに対して同時に平らに4つの足すべてで休息をもたらす時間を記録します。キットが任意の方向に完全なステップを取る時間を記録します(ボディの回転やドラッグなしで特定の方向に進行を達成するために4つの足すべてを配置として定義されます)。
   2. 動物1匹につき右反射試験の5回の試験を行う。
   3. すべてのキットが5つの右反射試験を完了した後、ジルにごみを返します。

9. キャットウォークテスト

1. P42 で、ジルからキットを取り外します。テストの約10分前にプラスチックケージにキットを配置し、環境に慣れることができます。周囲光がキャットウォーク機能に影響を与えないように、テストルームのライトをオフにします。
2. 関連するソフトウェアで新しい実験を作成します。最大実行時間が 10.00 s を超え、最小実行時間が 1.50 s を超えないように実験設定を調整します。動物ごとに 3 つの準拠ランの最小要件を設定します。
3. 回転を妨げるほど狭いままで壁に触れることなく自由にロコモテできるように、動物の大きさに対して歩道の幅を調整します。自動検出を使用して、[検出設定プロファイル]タブに新しい検出設定を追加します。特定の年齢のすべてのごみや動物に同じ検出設定を使用します。
4. 各動物の前後に低リント紙組織と70%エタノールで歩道を徹底的に清掃してください。フェレットの足を定期的に清掃し、検出と分類の精度を向上させます。歩道と動物が準備されたら、トライアル取得を開始します。
5. 足跡がガラスに蓄積された場合、または動物が尿や便を通過する場合は、キャットウォークをきれいにするために取得を一時停止します。キャットウォークソフトウェアが事前に決定された実験設定に基づいて3つの準拠ランを認識したら、取得を停止します。

10. オープンフィールドテスト(P42)

1. 非多孔質アクリルボックス(高さ55cm×55cm×40cm)を使用し、マットホワイトを塗装します。カメラがボックスの真上に中央に配置され、4 つの壁がすべてキャプチャされるように配置します。最初の使用前および動物間の70%エタノールで試験場をきれいにしてください。
2. 関連するソフトウェアで、[テンプレートから新規作成]を選択し、[定義済みのテンプレートを適用]を選択します。[サブジェクトの種類:その他] を順番に選択して、セットアップ手順を続行します。アリーナテンプレート:オープンフィールド、正方形。ゾーンテンプレート:センター、境界線、コーナー。追跡する機能: 中心点。
3. [アリーナ設定]を開き、カメラ入力から背景画像をつかみ、アリーナウォールの上部が表示されていることを確認します。スケール ツールを使用して、アリーナの寸法を調整します。
4. 壁ゾーン(NW、NE、SW、SE)とフロアゾーン(左上、中央トップ、右上、左中央、中央、中央、左下、中央下、右下、右下)に合わせてアウトラインのサイズを変更して、定義済みのアリーナゾーンを調整します。セットアップを検証して、ゾーンが重複していないことを確認します。
5. [取得] ウィンドウを開き、[取得の開始]をクリックします。すべての試験対象に対して一貫した方法で、テストアリーナの中心にフェレットを配置します。フェレットがアリーナ全体を5分間自由に動かします。テスト期間の終了時に、[取得の停止] を押します。次のフェレットで手順を繰り返します。
   注:部屋のすべての実験者は、フェレットによって観察不能であると自分自身を位置付け、テスト期間中は静かに保つ必要があります。

11. 固定灌流

1. P42では、5%のイソフルランでキットを深く麻酔します。ペントバルビタールの過剰摂取を投与する (120–150 mg/kg i.p.)つま先のピンチに対する反応の欠如と呼吸運動の喪失によって深い麻酔を確保します。
2. ヒュームフードに動物を転送します。胸郭を開き、細かい止血を使用して下降大胸をクランプします。右のアトリウムを切る。灌流ポンプを使用して、30 mL/分の割合で60 mL/分の割合で滅菌生理食塩水の60 mLで左心室をパーフィンスし、60 mLのホルマリン(10%ホルムアルデヒド)の割合で30 mL/分の速度でペルフューズ。
3. 死体を切り取り、はさみ、鉗子、ロンゲール、へらを使って頭蓋骨から脳を取り除きます。各脳の背面、腹部、横側の高解像度の写真を撮ります。少なくとも48時間のホルマリンで脳を後修正します。

12. Ex Vivo脳測定

1. ホルマリンから脳を取り出し(ステップ11.3)、ペーパータオルの上に置いて余分な液体を吸収します。
2. 電子キャリパーを使用して、脳の後ろおよび腹部の側面にキャリパーの先端を置くことによって、脳の高さを測定する。嗅球と後頭葉の最も後部境界にキャリパーの先端を置くことによって、脳の長さを測定します。側頭葉の最も横の部分にキャリパーの先端を置くことによって、脳の幅を測定します。脳の重さを量る。
3. 縦裂(前十四方および後部)、横スルチ、スプラシルビアンスルチ、コロナスルチ、プソイドシルベルンスルチ、アンシン酸スルチ、クルシアテスルチ、プレシルビアンスルチ、ラテシルジャイリ、スプラシルビエンギリ、シグモイドキシ(前脛骨前部および後部)、コロナジャイリ、エクトシルビエンギリ(前部および後部)、および軌道ジャイリ。対応するスルカスの最も明確な部分の最初と最後からすべてのスルシを測定します。各対応する回の最も広い側面からすべてのジャイリを測定します。
4. 長手裂の最も後部点にキャリパーの片方の先端を置き、小脳の最も後部にキャリパーのもう一方の先端を置くことによって露出する小脳の量を測定する。
   注:フェレット脳アトラスは、フェ^レット14の生物学および疾患に見られるように、ex vivoフェレット脳測定値を開発するために使用された。

13. 重傷の得点

1. ステップ11.3.で撮影した写真を使用して、ステップ13.2~13.4の採点基準を適用して、暴露(または治療)群に目がくらんだままの重度の脳損傷(0~9スケール)を評価します。
2. 縦裂を評価する。正常と表示される場合は、スコア 0 を割り当てます。穏やかに広がっているが(通常幅は約2倍)、裂け目の長さに沿って幅の増加が不完全である場合は、スコア1を割り当てます。中程度に広がっている場合(約 2 ~ 3 倍正規)、スコア 2 を割り当てます。目立つように広がった場合は、裂け目の長さの大部分に沿って、表示可能なギャップ >3x 法線幅を持つ場合は、スコア 3 を適用します。
3. 側面スルチを評価します。彼らは、横のジャイリとスプラシルシルビアンジャイリの分離で、通常の定義を示している場合は、0のスコアを割り当てます。軽度の一方的または両側的な溝の減少定義が見られる場合、特に後頭葉に対する前頭葉と側頭葉の狭窄を最小限に抑えて、後頭葉のスコアを1に割り当てる。
   1. スルシの定義が適度に減少することが見られる場合は、上シルビアン・ギリのうつ病、コロナおよびエクトシルビアン・ギリの狭窄、および後頭葉に対する前頭葉および側頭葉の軽度の狭窄を伴い、スコア2を割り当てる。片側嚢胞性変性が見られる場合は、対国間半球の変化を最小限に抑えて、スコア3を割り当てる。側側スルシの定義が不十分な場合は、後頭葉および側頭葉の両側嚢胞または重度の変性を有する、スコア4を割り当てる。
4. 小脳の目に見える部分を評価します。正常に表示される場合 (頂点の 75% と半球の <66% が表示されている場合) には、スコア 0 を割り当てます。頂点の 75 ~ 90% と半球の ≥66% が表示されている場合は、スコア 1 を割り当てます。小脳の大部分が見える場合は、すべての頂点と半球の≥66%を示し、スコア2を割り当てます。

14. データ分析

1. 反射テスト データの場合は、故障のスコアを 61 s に割り当てて、時間の終わりに成功 (60 s) と比較できますが、統計分析ではランキングが悪くなります。各反射テストで、時間の経過につれた各動物の曲線の下の面積を計算します。
2. 動物の重量によって圧力の足のサイズを含むキャットウォークデータを調整します。
3. 非パラメトリック統計法を使用してデータを分析し、中央値と四分位範囲 (IQR) を使用してデータを記述します。

結果

34匹(n=18オス、n=16雌)のうち6匹のゴミから、負傷した群の8匹の動物(24%n=4オス、n=4雌)が第2低酸素期(n=5)、温度管理中(n=2)、または侮辱後の一晩(n=1)の間に死亡した。負傷したグループでは、生存者26人中9人(35%)目に見える重傷を負った。5匹の動物(n=5オス)は中等度の傷害を有し、4匹の動物(n=2オス、n=2雌)がそれぞれ2〜5および6-9の重病理スコアとして定義される重傷を有した(図2A)...

ディスカッション

フェレット脳と人間の脳の間で共有される物理的および発達的な類似点のために、フェレットは、成人と発達脳損傷の両方をモデル化するためにますます使用されています。^{8、9、10、11、12}。しかしながら、これまでの研究は、フェレット脳が初期傷害に対して耐性を有...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
80% Oxygen	Praxair
9% Oxygen	Praxair
Absorbent benchtop protector	Kimtech	7546
Automated catwalk	Noldus
Betadine surgical scrub
Bupivacaine	Patterson Veterinary	07-888-9382
Buprenorphine
Calipers	SRA Measurement Products	ME-CAL-FP-200	200 mm range, 0.01 mm resolution
Cotton Gauze Sponge	Fisher Scientific	22028556
Curved fine hemostat	Roboz	RS-7101
Curved forceps	World Precision Instruments	501215
Curved suture-tying hemostat	Roboz	RS-7111
Ethovision tracking software	Noldus
Eye Lubricant	Rugby	NDC 0536-1970-72
Ferrets (Mustela putorius furo)	Marshall Biosciences		Outbred (no specific strain)
Formalin	Fisher Scientific	SF100-4	10% (Phosphate Buffer/Certified)
Hair Clippers	Conair	GMT175N
Insulin Syringes	BD	329461	0.3 cc 3 mm 31 G
Isoflurane	Piramal	66794-017-25
Lidocaine	Patterson Veterinary	07-808-8202
LPS	List Biological	LPS Ultrapure #423
Oxygen sensor	BW Gas Alert	GAXT-X-DL-2
Pentobarbital
Plastic chamber	Tellfresh	1960	10 L; 373 x 270 x 135 mm3
Saline Solution, 0.9%	Hospira	RL-4492
Scalpel blade	Integra Miltex	297
Scalpel handle	World Precision Instruments	500236	#3, 13 cm
Sterile suture	Fine Science Tools	18020-50	Braided Silk, 5/0
Surgical clip applicator	Fine Science Tools	12020-09
Surgical clip remover	Fine Science Tools	12023-00
Surgical drapes	Medline Unidrape	VET3000
Surgical gloves	Ansell Perry Inc	5785004
Surigical clips	Fine Science Tools	12022-09
Thermometer (rectal)	YSI	Precision 4000A
Thermometer (water)	Fisher Scientific	14-648-26
Umbilical tape	Grafco	3031	Sterile
Water bath	Thermo Scientific	TSCOL19	19 L