Um modelo de furão de inflamação sensibilizada tardia preterm-isquêmica lesão cerebral

Resumo

O método descreve inflamação sensibilizada hicóxico-isquêmica e lesão cerebral hiperoxica no furão P17 para modelar a interação complexa entre inflamação prolongada e lesão cerebral oxidativa experimentada em um número de bebês prematuros tardios.

Resumo

Há uma necessidade contínua de modelos clinicamente relevantes de infecção perinatal e hipóxia-isquemia (EI), nos quais testar intervenções terapêuticas para bebês com as sequelas neurológicas da prematuridade. Furões são candidatos ideais para modelar o cérebro humano prematuro, como eles nascem lissencefálicos e desenvolver cérebros gironcfálicos pós-natal. Ao nascer, o desenvolvimento do cérebro de furão é semelhante a um feto humano de 13 semanas, com kits pós-natais (P) 17 considerados equivalentes a uma criança de 32 a 36 semanas de gestação. Descrevemos um modelo de lesão no furão P17, onde a administração de lipopolissacarídeos é seguida por isquemia cerebral bilateral, hipóxia e hiperoxia. Isso simula a interação complexa de inflamação prolongada, isquemia, hipóxia e estresse oxidativo experimentado em vários neonatos que desenvolvem lesão cerebral. Os animais feridos exibem uma série de gravidade da lesão bruta, com alterações morfológicas no cérebro, incluindo o estreitamento de vários giros corticais e sulci associados. Animais feridos também mostram desenvolvimento reflexo retardado, velocidade mais lenta e variável de locomoção em uma passarela automatizada, e diminuição da exploração em um campo aberto. Este modelo fornece uma plataforma para testar terapias putativas para lactentes com encefalopatia neonatal associada à inflamação e Hi, mecanismos de estudo de lesões que afetam o desenvolvimento cortical e investigar caminhos que fornecem resiliência animais não afetados.

Introdução

Há uma necessidade contínua de grandes modelos animais que reflitam a fisiopatologia da prematuridade e da hipóxia-isquemia perinatal em que intervenções terapêuticas para bebês podem ser testadas. Em 2017, 9,93% dos 382.726 lactentes nascidos nos Estados Unidos nasceram prematuros e 84% desses bebês nasceram entre 32 e 36 semanas de gestação^1. Em prematuros, a exposição perinnatal à infecção ou inflamação é comum, onde a ativação imune materna devido a patógenos virais ou bacterianos pode iniciar o trabalho prematuro. Postnatalmente, os bebês prematuros estão em alto risco de sepse precoce ou de início tardio^2. Os bebês prematuros também freqüentemente experimentam períodos de hipóxia, hipotensão e hiperoxia devido ao seu sistema cardiorrespiratório imaturo, tensão elevada de oxigênio na atmosfera em relação aos experimentados no útero e exposições iagênicas. Além disso, em bebês prematuros, as defesas antioxidantes são imaturas³ e os fatores pró-apoptotice são naturalmente upregulated⁴. Estresse oxidativo e morte celular levam à ativação do sistema imunológico e neuroinflamação. Estes fatores combinados são pensados para contribuir para a vulnerabilidade do desenvolvimento e fisiofiária do cérebro, e resultar ou exacerbar a encefalopatia associada com maus resultados de desenvolvimento em bebês prematuros^5,6,7.

Devido às semelhanças físicas e de desenvolvimento que o cérebro furão compartilha com o cérebro humano, o furão é uma espécie atraente para modelar lesão cerebral^8,9,10,11,12. Furões também são candidatos ideais para modelar o cérebro humano prematuro, como eles nascem lissencefálicos e desenvolver cérebros gironcfálicos pós-natal, que fornece uma janela para expor o cérebro em desenvolvimento para insultos que imitam aqueles experimentados por bebês nascidos prematuros. Ao nascer, o desenvolvimento do cérebro de furão é semelhante a um feto humano de 13 semanas, com kits pós-parto (P) 17 considerados equivalentes a uma criança de 32 a 36 semanas de gestação¹³.

Nosso grupo publicou recentemente um modelo de lesão cerebral extremamente prematuro (<28 semanas) no furão P10, combinando sensibilização inflamatória com lipopolissacarídeos de Escherichia coli (LPS) com posterior exposição à hipóxia e hiperoxia¹². No protocolo a seguir, descrevemos agora um modelo prematuro tardio no furão P17, onde a sensibilização do LPS é seguida por isquemia cerebral bilateral, hipóxia e hiperoxia. Isso resulta em lesão mais grave em um subconjunto de animais, e mais estreitamente modela a interação complexa de inflamação prolongada, isquemia, hipóxia e estresse oxidativo experimentado em uma série de bebês prematuros que desenvolvem lesão cerebral.

Protocolo

Os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia nih para o cuidado e uso de animais de laboratório e como parte de um protocolo aprovado pela Universidade de Washington Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Administração de preparação e LPS

Nota: Consulte a Figura 1 para uma linha do tempo dos procedimentos.

1. Antes de iniciar o procedimento, selar, esterilizar e autoclave todos os instrumentos cirúrgicos e cortinas cirúrgicas. Prepare medicamentos pré-operatórios em frascos estéreis. Calcule a taxa de fluxo necessária para substituir o ar na câmara hipóxia/hiperoxia pelo gás experimental em 8-10 min.
2. Prepare o lipopolissacarídeo (LPS de E. coli 055:B5) em salina estéril para produzir uma concentração de 1 mg/mL. Remover kits de furão P17 de suas jills. Pese e o número deles. Randomize animais por lixo e sexo para os grupos de controle ou feridos (ou tratamento).
3. Usando uma seringa de insulina de 300 μL, administre 3 mg/kg de LPS intraperitoneally a kits no grupo de lesões e um volume equivalente de veículo soline estéril (3 μL/g) para controlar animais.
4. Coloque os animais em uma câmara dentro de um banho de água a 37-40 °C, a fim de manter uma temperatura retal alvo de 36-37 °C ao longo dos procedimentos cirúrgicos.

2. Anestesia

1. Durante o procedimento, monitorar continuamente a temperatura, a frequência de respiração e a frequência cardíaca do animal.
2. Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) subcutâneamente 30 min antes do procedimento cirúrgico. Induzir anestesia em uma mistura de 3% isoflurano equilibrado com 100% de oxigênio. Retire o kit da câmara de indução e coloque-o supine em um cobertor de água cirúrgica drapeado definido para 37 °C. Transfira anestesia para o cone do nariz e reduza o nível de isoflurano para 2-3%.

3. Preparação cirúrgica

1. Usando pequenos cortadores de animais remover todos os cabelos na região do pescoço ventral. Barbear em um padrão retangular com cuidado para evitar cortar a pele ou gerar erupção navalha. Administrar anestesia local à área raspada usando lidocaína intradermal (4 mg/kg) e bupivacaine (2,5 mg/kg).
2. Prepare o pescoço alternando a aplicação de povidone-iodo e 70% de etanol esfrega com cotonetes estéreis. Repita o matagal de tal forma que povidone-iodo e 70% etanol são cada 3x aplicado de forma alternada.
3. Confirmar a profundidade da anestesia por ausência de reflexo de compressão do dedo do dedo do lado. Manter o nível de isoflurano no percentual mínimo necessário para um plano cirúrgico de anestesia. Usando cortinas descartáveis estéril recortadas que expõem a região do pescoço, armar o animal.

4. Ligadura bilateral da artéria carótida

1. Com uma lâmina de bisturi de uso único #11, faça uma incisão de 1,5 cm no centro do pescoço. Usando hemostats finos e fórceps curvos, dissecar sem rodeios até a artéria carótida esquerda. Dissecar a artéria longe do pacote neurovascular associado.
2. Usando um par de fórceps finos curvos, passe um comprimento de 10 cm de sutura de seda estéril 5-0 a artéria. Corte a sutura ao meio. Ligate a artéria amarrando firmemente ambos os comprimentos da sutura, deixando pelo menos 2 milímetros entre os nós. Transect a artéria carótida esquerda entre as suturas, tomando cuidado para deixar o nervo intacto.
3. Repita a dissecação do lado direito. Ligata reversível a artéria carótida direita com um único laço umbilical estéril de 1/8 polegadas. Feche a ferida com grampos cirúrgicos da pele.
4. Permita que o animal se recupere em um banho de água temperatura-controlada para pelo menos 30 min antes da hipóxia.
   Nota: Se as artérias não estiverem totalmente isoladas do resto do feixe neurovascular, o aumento da mortalidade pode ser observado antes ou durante a hipóxia posterior.

5. Hipóxia Sequencial, Hiperoxia e Hipóxia

1. Durante a hipóxia e hiperoxia, alterar a temperatura do banho de água, conforme necessário para manter a temperatura retal durante a hipóxia em 37 °C no animal sentinela (s).
2. Coloque os animais no grupo de lesões em uma câmara hermética dentro de um banho de água. Monitore continuamente a concentração de oxigênio dentro da câmara, bem como a temperatura retal em pelo menos um animal sentinela. Lave a câmara com oxigênio umidificado de 9% (91% de nitrogênio) em seguida, mantenha uma taxa de fluxo de 3-5 L/min, dependendo do tamanho da câmara. Uma vez que a concentração de oxigênio na câmara atingiu 9%, continue por 30 min.
3. Após 30 min, troque o fornecimento de gás para 80% de oxigênio umidificado (20% de nitrogênio) e permita que a câmara atinja a concentração alvo com base na taxa de fluxo e no tamanho da câmara. Continue por 30 min de hiperoxia. Abra a câmara para permitir que ele chegue mais rapidamente à normoxia equilibrando-se com o ar da sala.
4. Selar a câmara, e lave com 9% de oxigênio umidificado. Monitore continuamente todos os animais visualmente, tomando nota dos animais que exibem bradypnea. Uma vez que a concentração de oxigênio na câmara atingiu 9%, continue por 30 min. Se a mortalidade intra-hipóxico (parada respiratória) em qualquer um dos animais é vista antes do final do período de 30 min, encerre a hipóxia imediatamente.

6. Reversão da Ligadura da Artéria Carotida Direita

1. Retorne os animais à área cirúrgica e induza a anestesia em uma mistura de 3% isoflurano equilibrada com 100% de oxigênio. Transfira anestesia para cone de nariz e reduza o nível de isoflurano para 2-3%. Retire os clipes de ferida cirúrgica e repreparar a área da ferida com povidone-iodo. Confirmar a profundidade da anestesia por ausência de reflexo de compressão do dedo do dedo do lado. Mantenha o nível de isoflurano no percentual mínimo necessário para um plano cirúrgico de anestesia. Usando cortinas descartáveis estéril recortadas que expõem a região do pescoço, armar o animal.
2. Usando fórceps curvos, identifique e desatie a fita umbilical da artéria carótida direita. Feche a ferida com grampos cirúrgicos da pele.

7. Recuperação e Gestão da Temperatura

1. Devolva todos os kits para suas jills por 60 min, para enfermagem e recuperação. Após 60 min, retorne animais feridos aos banhos de água em 37-40 °C para 6 h, ajustando a temperatura da água como necessário, a fim de manter a temperatura retal em 36-37 °C. Retorne kits para suas jills.
2. Retire clipes cirúrgicos 10-14 dias após a cirurgia (P27-P31).

8. Teste de reflexo

1. Realize todos os testes reflexos diários do P21-P28, e pelo menos 3x por semana do P28-P42, permanecendo cego ao grupo de exposição (ou tratamento). Antes do teste reflexo, coloque kits em uma câmara com assistência térmica (37 °C banho de água, almofada de calor, etc.) para 1 h. Para cada teste, complete todos os testes por kit antes de testar o próximo kit.
2. Geotáxis negativos (25°)
   1. Coloque uma placa plana (16 1/2 in. x 12 in.) embrulhada em um protetor absorvente bancada contra um objeto para que a placa forma um ângulo de 25° com a mesa. Coloque um kit na placa propensa e voltado para baixo, aproximadamente 75% do caminho até a placa.
   2. Certifique-se do corpo do kit é reto e que tem todas as quatro patas agarrado contra a placa antes de liberá-lo. Assim que o kit for colocado, comece a avaliação do tempo.
   3. Registre o tempo em que o kit consegue girar seu corpo 90° em relação à sua posição inicial. Registre o tempo em que o kit gira seu corpo 180° e dá um passo completo em direção ao topo da placa. Realize 3 ensaios na inclinação de 25° antes de passar para o próximo teste.
3. Geotáxis negativos (45°)
   1. Realize 3 ensaios do teste de geoetáxi negativo previamente descrito novamente, desta vez com a placa definida como um ângulo de 45°.
4. Aversão ao penhasco
   1. Coloque uma plataforma acolchoada em torno de 1 pé abaixo da borda para minimizar lesões de kits se eles caem.
   2. Coloque um kit voltado, e perpendicular a, a borda do banco de laboratório. Certifique-se de que o corpo do kit é reto, com suas patas dianteiras niveladas com a borda. Comece a avaliação do tempo a partir do momento em que o kit é colocado. Tome cuidado para diferenciar entre movimento consciente longe do penhasco e outros movimentos espontâneos que não envolvem caminhada coordenada.
   3. Registre o tempo em que o kit move seu corpo para longe da borda (definido como o kit de backup, virando seu corpo, ou movendo seus membros dianteiros para longe da borda). Registre o tempo em que o kit completa seu primeiro passo na direção oposta da borda (definido como qualquer direção ou ângulo após uma rotação de 90° de sua posição inicial voltada para a borda).
   4. Realize 3 testes de aversão ao penhasco por kit antes de passar para o próximo teste.
5. Reflexo de redireitamento
   1. Coloque um kit supine no banco, segurando-o suavemente nessa posição antes de liberá-lo e, simultaneamente, iniciar o cronômetro. Registre o tempo que o jogo se traz para descansar com todas as quatro patas simultaneamente planas contra o banco em posições de suporte de peso. Registre o tempo em que o kit dá um passo completo em qualquer direção (definido como a colocação de todas as quatro patas para alcançar o progresso em uma determinada direção, sem fiação ou arrastando do corpo).
   2. Realize 5 ensaios do teste reflexo de ajustamento por animal.
   3. Depois de cada kit ter completado os 5 testes reflexo de endireitamento, devolva a ninhada para a jill.

9. Teste de passarela

1. No P42, retire os kits da jill. Coloque kits em gaiolas plásticas aproximadamente 10 min antes do teste, para que eles possam se adaptar ao meio ambiente. Desligue as luzes na sala de testes para garantir que a luz ambiente não afete a função da passarela.
2. Crie um novo experimento no software relevante. Ajuste as configurações experimentais para que a duração máxima da execução não exceda 10,00 s e a duração mínima de execução não seja inferior a 1,50 s. Defina a variação máxima de velocidade para que não exceda 60%. Defina um requisito mínimo de três corridas compatíveis para cada animal.
3. Ajuste a largura da passagem em relação ao tamanho do animal para que ele seja capaz de locomoto livremente sem tocar nas paredes, permanecendo estreito o suficiente para desencorajar a viragem. Adicione uma nova configuração de detecção na guia de configurações de detecção de configurações de detecção usando detecção automática. Use as mesmas configurações de detecção para todas as ninhadas e animais em uma determinada idade.
4. Limpe completamente a passarela com um tecido de papel de baixo fiapos e 70% de etanol antes e depois de cada animal. Limpe as patas do furão regularmente para melhorar a precisão da detecção e classificação. Uma vez que a passarela e o animal são preparados, comece a aquisição experimental.
5. Pausa aquisição para limpar a passarela se pegadas se acumulam no vidro, ou se os animais passam urina ou fezes. Pare de aquisição uma vez que o software de passarela reconheceu três corridas compatíveis com base nas configurações de experimentos pré-determinados.

10. Testes de Campo Aberto (P42)

1. Use uma caixa de acrílico não porosa (55 cm x 55 cm x 40 cm de altura) pintada de branco fosco. Posicione a câmera para que ela seja centrada diretamente acima da caixa e todas as quatro paredes são capturadas. Limpe a área de testes com 70% de etanol antes do primeiro uso e entre os animais.
2. No software relevante, selecione Novo de modelo e aplique um modelo pré-definido. Continue o procedimento de configuração selecionando sequencialmente o tipo de assunto:outros; Modelo de arena:Campo aberto, quadrado; Modelo de zona:Centro, fronteira, cantos; Recursos para rastrear:Ponto central.
3. Configurações arena aberta e pegar a imagem de fundo da entrada da câmera, certificando-se de que os topos das paredes da arena são visíveis. Calibrar as dimensões da arena usando a ferramenta de escala.
4. Ajuste as zonas de arena pré-definidas redimensionando os contornos para caber nas zonas de parede (NW, NE, SW, SE) e zonas de piso (parte superior esquerda, parte superior do meio, parte superior direita, meio esquerdo, centro, meio direito, fundo esquerdo, fundo médio, fundo direito). Vava a configuração para confirmar que nenhuma zona se sobrepõe.
5. Abra a janela de aquisição e imprensa Start Aquisição. Coloque o furão no centro da arena de testes orientado de tal forma que seja consistente para cada assunto de teste. Permita que o furão se mova livremente por toda a arena por um período de 5 min. No final do período de testes, press Stop Aquisição. Repita o procedimento com o próximo furão.
   Nota: Todos os experimentadores na sala devem posicionar-se para ser inobservável pelo furão e permanecer quieto durante o período de teste.

11. Perfusão de fixação

1. Em P42, kits de anestesia profundamente com 5% isoflurano. Administrar uma overdose pentobarbital (120-150 mg/kg i.p.). Assegurar anestesia profunda por falta de resposta à pitada do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do ar e perda de movimentos respiratórios.
2. Transfira o animal para um capuz de fumaça. Abra o tórax e aperte a aorta descendente usando hemostats finos. Corte o átrio direito. Usando uma bomba de perfusão, perfunde o ventrículo esquerdo com 60 mL de salina estéril a uma taxa de 30 mL/min. Perfuse com 60 mL de formalina (10% formaldeído) a uma taxa de 30 mL/min.
3. Decapite a carcaça, e retire o cérebro do crânio usando tesouras, fórceps, rongeurs e uma espátula. Tire fotografias de alta resolução dos aspectos dorsais, ventrais e laterais de cada cérebro. Pós-corrigir o cérebro em formalina por pelo menos 48 h.

12. Ex Vivo Medição do cérebro

1. Retire o cérebro da formalina (passo 11.3) e coloque em uma toalha de papel para absorver o excesso de líquido.
2. Usando uma pinça eletrônica, medir a altura do cérebro, colocando as pontas da pinça nos aspectos dorsais e ventrais do cérebro. Medir o comprimento do cérebro, colocando as pontas do pinça no bulbo olfativo e a fronteira mais posterior do lobo occipital. Medir a largura do cérebro, colocando as pontas da pinça nas porções mais laterais dos lobos temporais. Pese o cérebro.
3. Medir a fissura longitudinal (anterior e posterior ao sulco cruzado), sulci lateral, sulci suprasylvian, sulci coronal, sulci pseudosylviano, sulci ansinato, sulci cruciate, sulci pré-sylviano, gyri lateral, gyri suprasylvian, gyri sigmoid ( anterior e posterior), gyri coronal, ectosylvian gyri (anterior e posterior), e gyri orbital. Medir todos os sulcos desde o início e o fim da porção mais distinta do sulco correspondente. Medir todos os gyri do aspecto mais amplo de cada giro correspondente.
4. Medir a quantidade de cerebelo exposto, colocando uma ponta do pinça no ponto mais posterior da fissura longitudinal e colocando a outra ponta do pinça na parte mais posterior do cerebelo.
   Nota: O atlas cerebral furão, como encontrado em Biologia e Doenças do Furão^14,foi usado para desenvolver as medições cerebrais do furão vivo ex.

13. Pontuação de Lesão Bruta

1. Usando as fotografias tiradas na etapa 11.3., aplique os critérios de pontuação nos passos 13.2-13.4 para avaliar a lesão cerebral bruta (escala 0-9), permanecendo cego à exposição (ou tratamento) grupos.
2. Avalie a fissura longitudinal. Se parecer normal, atribua uma pontuação de 0. Se for ligeiramente alargado (aproximadamente 2x largura normal), mas o aumento da largura está incompleto ao longo do comprimento da fissura, atribuir uma pontuação de 1. Se for moderadamente alargado (aproximadamente 2-3x normal), atribuir uma pontuação de 2. Se for significativamente alargado, com uma diferença visível >3x largura normal ao longo da maior parte do comprimento da fissura, aplique uma pontuação de 3.
3. Avalie os sulci laterais. Se eles mostram definição normal, com a separação dos gyri laterais e gyri suprasylvian, atribuir uma pontuação de 0. Se a definição unilateral ou bilateral suave reduzida de sulco é vista, particularmente na porção caudal, com estreitamento mínimo de lobos frontais e temporais em relação aos lobos occipitais, atribuir uma pontuação de 1.
   1. Se a definição moderadamente reduzida dos sulci é vista, com a depressão do gyri suprasylvian, estreitamento dos gyri coronais e ectosylvian, e estreitamento leve de lobos frontais e temporais em relação aos lobos occipitais, atribuir uma pontuação de 2. Se a degeneração cística unilateral é vista, com mudança mínima do hemisfério contralateral, atribuir uma pontuação de 3. Se a má definição dos sulci laterais estiver presente, com degeneração cística ou severa bilateral dos lobos occipitais e temporais, atribua uma pontuação de 4.
4. Avalie a parte visível do cerebelo. Se parecer normal, com (<75% dos vermeis e <66% dos hemisférios visíveis, atribuir uma pontuação de 0. Se 75-90% dos vermeis e ≥66% dos hemisférios são visíveis, atribuir uma pontuação de 1. Se a maior parte do cerebelo é visível, mostrando todos os vermes e ≥66% dos hemisférios, atribua uma pontuação de 2.

14. Análise de dados

1. Para dados de testes de reflexo, atribuir falhas uma pontuação de 61 s para permitir que eles sejam comparados aos sucessos no final dos tempos (60 s), mas com uma pior classificação na análise estatística. Calcule uma área a curva para cada animal ao longo do tempo em cada um dos testes reflexo.
2. Ajuste os dados da passarela que envolvem o tamanho da pata de pressão pelo peso do animal.
3. Analise dados usando métodos estatísticos não paramétricos, descrevendo dados usando a faixa mediana e interquartilada (IQR).

Resultados

Dos 34 (n = 18 machos, n = 16 fêmeas) animais de seis ninhadas expostas ao insulto, oito animais (24%; n = 4 machos, n = 4 fêmeas) no grupo lesionado morreram durante o segundo período de hipóxia (n = 5), durante o manejo da temperatura (n = 2), ou durante a noite após o insulto (n = 1). No grupo ferido, nove dos 26 sobreviventes (35%) teve ferimento bruto visível. Cinco animais (n = 5 machos) tiveram lesão moderada, e quatro animais (n = 2 machos, n = 2 fêmeas) tiveram lesão grave, definida como escores de pato...

Discussão

Devido às semelhanças físicas e de desenvolvimento compartilhadas entre o cérebro furão e o cérebro humano, o furão está sendo cada vez mais usado para modelar lesões cerebrais adultas e de desenvolvimento. ^{8,9,10,11,12.} No entanto, a pesquisa até o momento sugere que o cérebro furão é resistente à lesão inicial, bem como altamente plástico, co...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
80% Oxygen	Praxair
9% Oxygen	Praxair
Absorbent benchtop protector	Kimtech	7546
Automated catwalk	Noldus
Betadine surgical scrub
Bupivacaine	Patterson Veterinary	07-888-9382
Buprenorphine
Calipers	SRA Measurement Products	ME-CAL-FP-200	200 mm range, 0.01 mm resolution
Cotton Gauze Sponge	Fisher Scientific	22028556
Curved fine hemostat	Roboz	RS-7101
Curved forceps	World Precision Instruments	501215
Curved suture-tying hemostat	Roboz	RS-7111
Ethovision tracking software	Noldus
Eye Lubricant	Rugby	NDC 0536-1970-72
Ferrets (Mustela putorius furo)	Marshall Biosciences		Outbred (no specific strain)
Formalin	Fisher Scientific	SF100-4	10% (Phosphate Buffer/Certified)
Hair Clippers	Conair	GMT175N
Insulin Syringes	BD	329461	0.3 cc 3 mm 31 G
Isoflurane	Piramal	66794-017-25
Lidocaine	Patterson Veterinary	07-808-8202
LPS	List Biological	LPS Ultrapure #423
Oxygen sensor	BW Gas Alert	GAXT-X-DL-2
Pentobarbital
Plastic chamber	Tellfresh	1960	10 L; 373 x 270 x 135 mm3
Saline Solution, 0.9%	Hospira	RL-4492
Scalpel blade	Integra Miltex	297
Scalpel handle	World Precision Instruments	500236	#3, 13 cm
Sterile suture	Fine Science Tools	18020-50	Braided Silk, 5/0
Surgical clip applicator	Fine Science Tools	12020-09
Surgical clip remover	Fine Science Tools	12023-00
Surgical drapes	Medline Unidrape	VET3000
Surgical gloves	Ansell Perry Inc	5785004
Surigical clips	Fine Science Tools	12022-09
Thermometer (rectal)	YSI	Precision 4000A
Thermometer (water)	Fisher Scientific	14-648-26
Umbilical tape	Grafco	3031	Sterile
Water bath	Thermo Scientific	TSCOL19	19 L