金属浸出在固定金属亲和力色谱中的定量

摘要

我们提出了一种检测方法，用于对使用固定金属亲和色谱法制备的样品引入的金属进行易定量。该方法使用羟基纳普霍尔蓝色作为色度金属指示器，使用 UV-Vis 分光光度计作为探测器。

摘要

酶与从固定金属亲和色谱谱（IMAC）柱中浸出的金属的污染是酶学家的主要关切，因为IMAC树脂中使用的许多常见的二价和三价阳离子对酶有抑制作用。然而，金属浸出的程度以及各种浸出和还原试剂的影响，在很大程度上，由于缺乏使用通常可用的设备的简单和实用的过渡金属定量协议，人们不太了解生物化学实验室。为了解决这个问题，我们开发了一种协议，以快速量化使用IMAC作为净化步骤制备的样品中的金属污染量。该方法使用羟基纳普霍尔蓝色（HNB）作为样品溶液中金属阳离子含量的色度指标，而UV-Vis光谱法则根据647nm的HNB光谱变化，量化纳米摩尔范围内的金属含量。虽然溶液中的金属含量历来是使用原子吸收光谱或电感耦合等离子体技术确定的，但这些方法需要在典型的生物化学实验室范围之外进行专门的设备和培训。这里提出的方法为生物化学家提供了一种简单快捷的方法，即使用现有设备和知识在不牺牲准确性的情况下确定样品的金属含量。

引言

自Porath和同事¹创立以来，固定金属亲和色谱（IMAC）已成为一种选择方法，根据蛋白质与过渡金属离子（如Zn^{2+、Ni 2+、Cu2+}和Co^2+）粘结的能力，快速分离蛋白质。这是最常见的通过工程多异氨酸标记完成，现在是最常见的色谱纯化技术之一，用于分离重组蛋白^2。IMAC还发现了除重组蛋白纯化以外的应用，作为分离奎诺酮、四环素、氨基糖苷、大纤维和β-乳糖的一种用途，用于食品样品分析^3，并作为识别肝癌和胰腺癌的血清蛋白标记物的一个步骤^。毫不奇怪，IMAC也成为分离一些本地生物能量酶^{6，7，8，9，10}的首选方法。然而，这些纯化方法的成功实施，研究酶活性生物能量蛋白取决于是否存在从柱基质渗入渗出至渗出的可忽略的金属阳离子水平。IMAC中常用的二价金属阳离子具有已知的病理生物学意义，即使在低浓度^11，12。这些金属的生理效应在生物能量系统中最为明显，在生物能量系统中，它们可证明是细胞呼吸或光合作用的抑制剂^，其作用是13、14、15。对于大多数蛋白质类别，残余污染物金属可能会干扰蛋白质的生物功能或生物化学和生物物理技术的特征，这些问题是不可避免的。

虽然氧化条件下的金属污染水平和使用伊米达索作为乙酰胺通常低^16，但蛋白质分离在存在半胱氨酸还原剂（DTT，β-甲基苯丙胺等）或与强包剂（如组氨酸^17，18或乙烯二甲酸（EDTA））时，会导致金属污染水平高得多^19，20。同样，由于 IMAC 树脂中的金属离子经常由卡盒组协调，因此在酸性条件下进行的蛋白质洗脱也可能具有高得多的金属污染水平。溶液中的金属含量可以使用原子吸收光谱（AAS）和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）在ppb-ppt范围内的检测极限^范围21、22、23、24进行评估。不幸的是，在传统的生物化学实验室中，AAS和ICP-MS不是实际的检测手段，因为这些方法需要获得专门的设备和培训。

此前由英国人^25、26日研究过羟基苯甲酸蓝（HNB）的用途，以识别溶液中过渡金属的存在。然而，数据²⁰中存在一些内部矛盾，这些工作未能提供适当的协议。Temel等人²⁷和费雷拉等人²⁸日的研究扩大了英国人与HNB合作作为潜在金属指标的研究。然而，Temel开发了一种利用AAS进行样品分析的协议，将海布仅用作包合剂。费雷拉的研究使用563nm的HNB吸收光谱的变化，这是自由染料HNB光谱的一个区域，在pH5.7时与HNB-金属复合物的光谱严重重叠，使得测定灵敏度相当低，并造成相对较弱的金属结合亲和力^20。为了解决我们实验室中来自 IMAC 的 Ni²⁺浸出问题，我们扩展了 Brittain^25、26和 Ferreria²⁸所做的工作，以开发能够检测几种过渡金属纳米摩尔水平的易检测。我们发现，HNB将镍和其他常见的IMAC金属与亚纳米摩尔结合亲和力结合，并在PH值²⁰的较宽范围内形成1:1复合物。此处报告的测定基于这些发现，利用HNB光谱在647nm处的吸收变化进行金属定量。该测定可在生理pH范围内使用典型生物化学实验室中常见的缓冲液和仪器进行，使用金属染料复合物的色度检测和定量，以及自由染料与金属结合时吸收率的相关变化。

研究方案

1. 测试组件制备

1. 确定使用 280 nm 的光学吸收度或蛋白质定量的替代方法测定要测定的色谱分数，以确定蛋白质富集度分数。
   注:为了这项工作，我们使用了二极管阵列UV-Vis分光光度计。为了增加吞吐量，可以使用能够测量 UV-Vis 吸光度的板式读取器。
2. 制备必要的测定组件
   1. 在 pH 值介于 7 和 12 之间准备或获取 10-100 mM 缓冲液（"样品缓冲器"）。
      注:在中性或基本pHH下，常见的生化缓冲液，如Tris、HEPES、MOPS和磷酸盐，均可接受测定。三丁和分氨酸可以使用，但需要校准曲线，因为它们都实质上会促进金属离子的利用。图^例20中显示了对分氨酸的校准示例。
   2. 在样品缓冲液中使用120毫克HNB试剂制备12%无（20倍浓缩）的羟基苯甲酸蓝（HNB）分散液溶液。"
      注意:HNB暴露在眼睛上会造成严重的损伤和刺激。处理 HNB 时应使用护目，处理后应彻底清洗双手。
      注:海航主要科学试剂供应商在KCl上作为分散剂出售。因此，溶液中的实际浓度因不同制造商、批次和瓶中HNB分散剂的采用程度而异。理想情况下，在 647 nm 时，在 647 nm 处的吸光度应在库存稀释 20 倍之间。

2. 样品制备和测量

1. 准备用于数据收集的分光光度计
   1. 打开并预热 UV-Vis 分光光度计。设置分光光度计以 647 nm 收集数据。
      注:如果分光光度计允许，另外在850nm或一些其他波长收集数据，而不与染料金属和染料光谱有显著变化，用于基线校正。
   2. 使用样品缓冲液将分光光度计空白。
      注:可以使用石英或一次性塑料比色皿。石英比色皿是定量分析的首选，因为它们比一次性塑料比色皿具有更高的精度和精度。然而，塑料比色皿会阻挡紫外线，而紫外线可能存在于某些二极管阵列分光光度计的测量光束中。HNB 暴露于强烈的紫外线下会导致明显的染料降解和不必要的缓慢吸收率降低，这可与缓慢的金属结合混淆（例如，参见参考资料 20 中的图 1）。
2. 控制的准备和吸光度测量
   1. 准备一个控制溶液，每毫升总测定量包含50μL的HNB库存。为了确保所有样品的良好混合，先移液小体积，然后加入样品缓冲液，然后通过移液混合。稀释的HNB溶液应制备新鲜，但HNB库存可储存在4°C，并保护数周，不显著降解。
   2. 让控制机在室温下孵育至少3分钟。
      注:由于形成可溶性较差的金属复合物，导致平衡较慢，碱性pH值或磷酸盐存在样品可能需要更长的孵育时间。
   3. 测量并记录控制样品在 647 nm 处的吸光度。
3. 样品的制备和吸光度测量
   1. 通过将 50 μL 的 HNB 库存与 950 μL 适当稀释的蛋白质馏分与样品缓冲液混合制备测定样品。
      注:由于文献中报告的金属污染水平因洗脱条件^16、20而变化超过1000倍，因此可能需要尝试使用样品缓冲液稀释一些测定蛋白馏分（见上文步骤1.2.1），以实现测定动态范围内的吸收变化。
      注意:IMAC中使用的镍和其他金属是已知的皮肤刺激物，怀疑是致癌物质，在长时间接触后能够损害肾脏和血液。处理使用 IMAC 制备的蛋白质样品时，应使用手套和眼睛保护。
   2. 允许样品在室温下孵育至少3分钟，并在647nm处测量吸光度。
      注:就投入时间而言，测定的限制步骤是孵化步骤。本文的数据是使用每个样品之间经过仔细清洗的单个石英比色皿收集的。即使增加了海布股票的洗涤时间和准备时间，14个样品的数据收集和控制也花了大约一个半小时，因此，无需中断即可轻松完成该协议。
   3. 对要测量的每个分数重复步骤 2.3.1 和 2.3.2。
      注:如果多个比色皿将用于多个样品，则样品的制备方式应允许类似的孵育时间和暴露于环境光。

3. 金属定量

1. 确定每个样品中的金属浓度
   1. 从HNB对照647nm处找出每个样品吸收度的差异。
   2. 使用以下公式确定金属浓度（以 μM 为单位）:
      
      
      
      其中DF是测定分数的稀释因子，μAbs₆₄₇是647nm处的吸收率变化，3.65x10-2表示HNB的消光系数（±36.5 mM-1^+cm-1，见参考^20，以厘米表示）。l为比色光的光学路径（以厘米表示）。

结果

图2显示了在中性pH（黑线）处的自由HNB光谱和从MS1E3D1²⁹分离中测定为^Ni2+的代表性分数谱。与HNB控制相比，成功的测定系列应表明647nm的吸收率降低，这与在过渡金属存在的情况下形成HNB复合物相对应。在 647 nm 处的吸收率增加将表明测定失败。或者，从 647 nm 的初始吸光度降低 90% 以上，表明金属含量过高，需要测定更多稀释分数。自由 HNB 控制没有...

讨论

使用 HNB 对金属进行彩色检测提供了一种简单的方法来量化 IMAC 树脂中过渡金属离子对蛋白质污染程度。正如我们在参考文献20中所确立的，Ni²⁺与HNB结合，具有1:1的测结和与pH值一起变化的Ni-HNB复杂变化的解散常数。但是，对于所有建议的 （7-12） pH 值，复合 K_d处于子 nM 范围内。实际上，这意味着只要不存在像EDTA这样的其他强合合试剂，任何测试分数中的所有Ni²⁺都将与HNB...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2xYT broth	Fisher Scientific	BP9743-500	media for E.coli growth
HEPES, free acid	BioBasic	HB0264	alternative buffer
HisPur Ni-NTA resin	Thermo Scientific	88222
Hydroxynaphthol blue disoidum salt	Sigma-Aldrich	219916-5g
Imidazole	Fisher Scientific	O3196-500
Imidazole	BioBasic	IB0277
MOPS, free acid	BioBasic	MB0360	alternative buffer
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sodium phosphate	Fisher Scientific	S369-500	alternative buffer
Tricine	Gold Bio	T870-100
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500