Quantifizierung der Metallauslaugung in der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie

Zusammenfassung

Wir präsentieren einen Test zur einfachen Quantifizierung von Metallen, die in Proben eingeführt werden, die mit der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie hergestellt werden. Das Verfahren verwendet Hydroxynaphtholblau als farbmetrischemetallanzeige und ein UV-Vis Spektralphotometer als Detektor.

Zusammenfassung

Die Kontamination von Enzymen mit Metallen, die aus immobilisierten Metallaffinitätschromatographiesäulen (IMAC) ausgelaugt werden, bereitet Enzymologen große Sorgen, da viele der in IMAC-Harzen verwendeten di- und trivalenten Kationen eine hemmende Wirkung auf Enzyme haben. Das Ausmaß der Metallauslaugung und die Auswirkungen verschiedener elutierender und reduzierender Reagenzien sind jedoch weitgehend schlecht verstanden, da einfache und praktische Übergangsprotokolle zur Metallquantifizierung fehlen, die Geräte verwenden, die typischerweise in Biochemielabore. Um dieses Problem anzugehen, haben wir ein Protokoll entwickelt, um die Menge der Metallkontamination in Proben, die mit IMAC als Reinigungsschritt hergestellt wurden, schnell zu quantifizieren. Das Verfahren verwendet Hydroxynaphthol-Blau (HNB) als kolorimetrischen Indikator für den Metallkationsgehalt in einer Probenlösung und UV-Vis-Spektroskopie als Mittel zur Quantifizierung der metallenen Metallmenge im Nanomolar-Bereich, basierend auf der Veränderung des HNB-Spektrums bei 647 nm. Während der Metallgehalt in einer Lösung in der Vergangenheit mit Hilfe von Atomabsorptionsspektroskopie oder induktiv gekoppelten Plasmatechniken bestimmt wurde, erfordern diese Methoden spezielle Ausrüstung und Schulungen außerhalb des Rahmens eines typischen Biochemielabors. Die hier vorgeschlagene Methode bietet Biochemikern eine einfache und schnelle Möglichkeit, den Metallgehalt von Proben mit vorhandenen Geräten und Kenntnissen zu bestimmen, ohne dabei auf Genauigkeit zu verzichten.

Einleitung

Seit seiner Gründung durch Porath und seine Mitarbeiter¹ist die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) zu einer Methode der Wahl geworden, um Proteine schnell zu trennen, basierend auf ihrer Fähigkeit, sich mit Übergangsmetallionen wie Zn^2+,Ni²⁺, Cu²⁺und Co²⁺zu verbinden. Dies geschieht am häufigsten über technisch hergestellte Polyhistidin-Tags und ist heute eine der häufigsten chromatographischen Reinigungstechniken zur Isolierung rekombinanter Proteine². IMAC hat auch Anwendungen jenseits der rekombinanten Proteinreinigung gefunden, um Chinolone, Tetracycline, Aminoglykoside, Makrolide und Lactams für die Lebensmittelprobenanalyse³ zu isolieren und als einen Schritt zur Identifizierung von Blutserumproteinmarkern für Leber- und Bauchspeicheldrüsenkrebs^4,5. Es überrascht nicht, dass IMAC auch eine Methode der Wahl für die Isolierung einer Reihe von nativen Bioenergetik-Enzyme6^,7,8,9,10geworden ist. Die erfolgreiche Umsetzung dieser Reinigungsmethoden für Studien an enzymatisch aktiven bioenergetischen Proteinen hängt jedoch davon ab, dass vernachlässigbare Mengen an Metallkationen aus der Säulenmatrix in das Eluat ausgelaugt sind. Die in IMAC gebräuchlichen divalenten Metallkationen haben eine pathologische biologische Signifikanz, selbst bei niedrigen Konzentrationen^11,12. Die physiologische Wirkung dieser Metalle ist am ausgeprägtesten in bioenergetischen Systemen, wo sie sich als Inhibitoren der zellulären Atmung oder Photosynthese^13,14,15als tödlich erweisen können. Ähnliche Probleme sind für die meisten Proteinklassen unvermeidbar, bei denen Restkontaminanten metallen die biologischen Funktionen eines Proteins oder die Charakterisierung mit biochemischen und biophysikalischen Techniken beeinträchtigen können.

Während die Konzentrationen der Metallkontamination unter oxidierenden Bedingungen und der Verwendung von Imidazol als Eluant in der Regel niedrig^{sind 16}, Proteinisolationen in Gegenwart von Cystein-Reduzierenden (DTT, Mercaptoethanol, etc.) oder mit stärkeren Chelatoren wie Histidin^17,18 oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) führen zu viel höheren Konzentrationen von Metallkontamination^19,20. Da Metallionen in IMAC-Harzen häufig von Carboxylgruppen koordiniert werden, sind Proteinelutionen, die unter sauren Bedingungen durchgeführt werden, wahrscheinlich auch eine viel höhere Metallkontamination. Der Metallgehalt in Lösungen kann mit Hilfe der Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) und der induktiv gekoppelten Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) bis zu einer Nachweisgrenze im ppb-ppt-Bereich^21,22,23,24bewertet werden. Leider sind AAS und ICP-MS keine realistischen Mittel zur Detektion in einem herkömmlichen Biochemielabor, da diese Methoden den Zugang zu spezialisierter Ausrüstung und Schulung erfordern würden.

Frühere Arbeiten von Brittain^25,26 untersuchten die Verwendung von Hydroxynaphthol blau (HNB) als eine Möglichkeit, das Vorhandensein von Übergangsmetallen in Lösung zu identifizieren. Allerdings gab es mehrere interne Widersprüche in den Daten^20, und diese Arbeiten haben kein angemessenes Protokoll geboten. Studien von Temel et al.²⁷ und Ferreira et al.²⁸ erweiterten Brittains Arbeit mit HNB als potenziellem Metallindikator. Temel entwickelte jedoch ein Protokoll, das AAS für die Probenanalyse verwendet und HNB nur als Chelatbildner verwendet. Ferreiras Studie verwendete die Veränderung der HNB-Absorptionsspektren bei 563 nm, einer Region der Freifärbung HNB-Spektren, die sich stark mit den Spektren von HNB-Metallkomplexen bei pH 5,7 überschneidet, wodurch die Assayempfindlichkeit relativ gering ist und eine relativ schwache Metallbindungsaffinität²⁰ergibt. Um Probleme in unserem eigenen Labor mit Ni^{2+-Auslaugung} von IMAC zu lösen, haben wir die Arbeit von Brittain^25,26 und Ferreria²⁸ erweitert, um einen einfachen Test zu entwickeln, der nanomolaren Konzentrationen mehrerer Übergangsmetalle detektieren kann. Wir zeigten, dass HNB Nickel und andere gemeinsame für IMAC-Metalle mit subnanomolaren Bindungsaffinitäten bindet und 1:1 Komplex über einen breiten Bereich von pH-Werten²⁰bildet. Der hier berichtete Test basiert auf diesen Erkenntnissen und nutzt Absorptionsänderungen im HNB-Spektrum bei 647 nm für die Metallquantifizierung. Der Test kann im physiologischen pH-Bereich mit gemeinsamen Puffern und Instrumenten durchgeführt werden, die in einem typischen Biochemielabor gefunden werden, indem kolorimetrische Detektion und Quantifizierung von Metall-Farbstoff-Komplexen und die damit verbundene Veränderung der Absorption des Freifarbstoffs bei der Bindung an Metall verwendet wird.

Protokoll

1. Assay-Komponentenvorbereitung

1. Bestimmen Sie die chromatographischen Fraktionen, die mit optischer Absorption bei 280 nm oder alternativen Methoden der Proteinquantifizierung ermittelt werden sollen, um die proteinangereicherten Fraktionen zu identifizieren.
   HINWEIS: Für diese Arbeit haben wir ein Diodenarray UV-Vis Spektralphotometer verwendet. Um den Durchsatz zu erhöhen, kann ein Plattenleser verwendet werden, der die UV-Vis-Absorption messen kann.
2. Vorbereitung der notwendigen Assay-Komponenten
   1. Vorbereiten oder erhalten Sie 10-100 mM Puffer ("Sample Buffer") mit einem pH-Wert zwischen 7 und 12.
      HINWEIS: Häufige biochemische Puffer wie Tris, HEPES, MOPS und Phosphat bei neutralem oder grundlegendem pH-Wert sind für den Test akzeptabel. Tricin und Histidin können verwendet werden, erfordern aber Kalibrierungskurven, da beide im Wesentlichen Metallionen chelatieren. Ein Beispiel für die Kalibrierung von Histidin ist in Referenz²⁰dargestellt.
   2. Bereiten Sie eine 12% w/v (20-fach konzentrierte) Lösung der Hydroxynaphthol-Blau (HNB)-Dispersion im Probenpuffer unter Verwendung von 120 mg HNB-Reagenz für jeden aufbereiteten Milliliter Der Stammlösung vor.
      VORSICHT: Die Exposition von HNB gegenüber dem Auge kann zu schweren Schäden und Reizungen führen. Der Augenschutz sollte beim Umgang mit HNB verwendet werden und die Hände sollten nach der Handhabung gründlich gewaschen werden.
      HINWEIS: HNB wird als Dispersion auf KCl von großen Anbietern wissenschaftlicher Reagenzien verkauft. Daher variiert die tatsächliche Konzentration in lösungsweise von verschiedenen Herstellern, Chargen und wo in der Flasche die HNB-Dispersion entnommen wird. Idealerweise sollte eine Absorption zwischen 0,5-0,8 bei 647 nm nach 20-facher Verdünnung des Bestands erreicht werden.

2. Probenvorbereitung und -messung

1. Vorbereitung des Spektralphotometers für die Datenerfassung
   1. Schalten Sie das UV-Vis Spektralphotometer ein und wärmen Sie es auf. Stellen Sie das Spektralphotometer so ein, dass Daten auf 647 nm gesammelt werden.
      HINWEIS: Wenn das Spektralphotometer es zulässt, zusätzlich Daten bei 850 nm oder eine andere Wellenlänge ohne signifikante Änderungen im Zusammenhang mit den Farbmetall- und Farbstoffspektren zu sammeln, um für eine Basiskorrektur verwendet zu werden.
   2. Leeren Sie das Spektralphotometer mit dem Probenpuffer.
      HINWEIS: Es können Quarz- oder Einweg-Kunststoffküvetten verwendet werden. Quarzküvetten werden für die quantitative Analyse bevorzugt, da sie eine höhere Genauigkeit und Präzision gegenüber Einweg-Kunststoffküvetten ermöglichen. Kunststoffküvetten blockieren jedoch UV-Licht, das in den Messstrahlen einiger Dioden-Array-Spektrophotometer vorhanden sein kann. Die Exposition von HNB gegenüber intensivem UV-Licht führt zu einem spürbaren Farbabbau und einer unerwünschten langsamen Absorptionsabnahme, die mit einer langsamen Metallbindung verwechselt werden kann (siehe Abbildung 1 in Unterstützende Informationen zu Referenz 20).
2. Vorbereitungs- und Absorptionsmessung der Steuerung
   1. Bereiten Sie eine Steuerungslösung vor, die 50 L HNB-Bestand pro Milliliter Gesamttestvolumen enthält. Um eine gute Durchmischung aller Proben zu gewährleisten, pipette die kleinen Volumina zuerst fügen Sie dann den Probenpuffer gefolgt durch Mischen durch Pipettieren. Verdünnte HNB-Lösung sollte frisch zubereitet werden, aber HNB-Bestände können bei 4 °C gelagert und wochenlang ohne nennenswerte Verschlechterung vor Licht geschützt werden.
   2. Lassen Sie die Steuerung für mindestens 3 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      HINWEIS: Für Proben bei alkalischem pH-Wert oder in Gegenwart von Phosphat kann eine längere Inkubationszeit erforderlich sein, da schlecht lösliche Metallkomplexe entstehen, was zu einem langsameren Gleichgewicht führt.
   3. Messen und erfassen Sie die Absorption bei 647 nm für die Kontrollprobe.
3. Aufbereitung und Absorptionsmessung von Proben
   1. Bereiten Sie die Assay-Proben vor, indem Sie 50 l HNB-Bestand mit 950 l entsprechend verdünnten Proteinfraktionen mit dem Probenpuffer mischen.
      ANMERKUNG: Da die in der Literatur gemeldeten Metallkontaminationswerte je nach Elutionsbedingungen^16,20um den Faktor 1000 variieren, kann es notwendig sein, einige Verdünnungen der untersuchten Proteinfraktionen mit dem Probenpuffer (siehe Schritt 1.2.1 oben) auszuprobieren, um Absorptionsänderungen innerhalb des dynamischen Bereichs des Assays zu erreichen.
      VORSICHT: Nickel und andere metalle, die in IMAC verwendet werden, sind bekannt hautreizend, im Verdacht, krebserregend zu sein, und sind in der Lage, die Nieren und das Blut nach längerer Exposition zu schädigen. Handschuhe und Augenschutz sollten bei der Handhabung von Proteinproben verwendet werden, die mit IMAC hergestellt wurden.
   2. Lassen Sie die Probe für mindestens 3 min bei Raumtemperatur inkubieren und die Absorptionen bei 647 nm messen.
      HINWEIS: Der begrenzende Schritt des Assays in Bezug auf die investierte Zeit ist der Inkubationsschritt. Die Daten für dieses Papier wurden mit einer einzigen Quarzküvette gesammelt, die sorgfältig zwischen jeder Probe gewaschen wurde. Selbst mit der zusätzlichen Waschzeit und der Vorbereitung des HNB-Bestandes, der Datenerfassung für 14 Proben und der Kontrolle dauerte es etwa anderthalb Stunden und als solches kann das Protokoll ohne Unterbrechung problemlos abgeschlossen werden.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1 und 2.3.2 für jeden gemessenen Anteil.
      HINWEIS: Wenn mehrere Küvetten für mehrere Proben verwendet werden, sollten Proben so vorbereitet werden, dass eine vergleichbare Inkubationszeit und die Exposition gegenüber Umgebungslicht ermöglicht werden.

3. Metallquantifizierung

1. Bestimmung der Metallkonzentration in jeder Probe
   1. Finden Sie den Unterschied der einzelnen Probenabsorptionen bei 647 nm von der HNB-Steuerung.
   2. Bestimmen Sie die Metallkonzentration (in M) nach der folgenden Formel:
      
      
      
      wobei DF der Verdünnungsfaktor für die Assay-Fraktion ist,_ist die Absorptionsänderungbei 647 nm, 3,65x10^-2 den Aussterbekoeffizienten von HNB (=36,5 mM^-1cm^-1 siehe Referenz²⁰ für weitere Details) und l ist der optische Pfad der Küvetten in cm.

Ergebnisse

Das Spektrum der freien HNB bei neutralem pH-Wert (schwarze Linie) und repräsentative Spektren von Fraktionen, die für Ni²⁺ aus der Isolierung von MSP1E3D1²⁹ untersucht wurden, sind in Abbildung 2dargestellt. Eine erfolgreiche Assay-Serie sollte eine verminderte Absorption bei 647 nm im Vergleich zur HNB-Steuerung aufweisen, was der Bildung von HNB-Komplexen in Gegenwart eines Übergangsmetalls entspricht. Ein fehlgeschlagener Test würde durch eine Erhö...

Diskussion

Die farbmetrische Detektion von Metallen mit HNB bietet eine einfache Möglichkeit, den Grad der Proteinkontamination durch Übergangsmetallionen aus IMAC-Harzen zu quantifizieren. Wie wir in Ref. 20 festgestellt haben, bindet Ni²⁺ an HNB mit 1:1 Stoichiometrie und der Dissoziationskonstante für den Ni-HNB-Komplex mit pH-Wert. Der komplexe K_d liegt jedoch im sub-nM-Bereich für alle empfohlenen (7-12) pH-Werte. In der Praxis bedeutet dies, dass alle Ni²⁺ in allen getesteten Fraktionen an...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2xYT broth	Fisher Scientific	BP9743-500	media for E.coli growth
HEPES, free acid	BioBasic	HB0264	alternative buffer
HisPur Ni-NTA resin	Thermo Scientific	88222
Hydroxynaphthol blue disoidum salt	Sigma-Aldrich	219916-5g
Imidazole	Fisher Scientific	O3196-500
Imidazole	BioBasic	IB0277
MOPS, free acid	BioBasic	MB0360	alternative buffer
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sodium phosphate	Fisher Scientific	S369-500	alternative buffer
Tricine	Gold Bio	T870-100
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500