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요약

우리는 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 제조 된 샘플에 도입 된 금속의 쉬운 정량화를위한 분석법을 제시합니다. 이 방법은 하이드록시나프톨 블루를 비대금속 표시기로 사용하고 UV-Vis 분광광도계를 검출기로 사용합니다.

초록

고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 컬럼에서 침출된 금속으로 효소를 오염시키는 것은 IMAC 수지에 사용되는 많은 일반적인 디-및 트라이발렌트 양이온이 효소에 억제 효과를 미치기 때문에 효소 학자들에게 큰 우려를 불러옵니다. 그러나, 금속 침출의 정도와 다양한 용출 및 환원 시약의 영향은 일반적으로 사용 가능한 장비를 사용하는 간단하고 실용적인 전이 금속 정량화 프로토콜의 부재로 인해 상당 부분에서 제대로 이해되지 않습니다. 생화학 실험실. 이 문제를 해결하기 위해 당사는 정화 단계로 IMAC를 사용하여 제조된 시료의 금속 오염량을 신속하게 정량화하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 647 nm에서 HNB 스펙트럼의 변화에 기초하여, 나노 몰 범위로 존재하는 금속의 양을 정량화하는 수단으로 샘플 용액 및 UV-Vis 분광법의 금속 양이온 함량에 대한 색인식 지표로 hydroxynaphthol 블루 (HNB)를 사용합니다. 용액의 금속 함량은 역사적으로 원자 흡수 분광법 또는 유도결합 플라즈마 기술을 사용하여 결정되었지만, 이러한 방법은 일반적인 생화학 실험실의 범위를 벗어난 특수 장비 및 교육이 필요합니다. 여기에 제안 된 방법은 생명 화학사가 정확성을 희생하지 않고 기존 장비와 지식을 사용하여 샘플의 금속 함량을 결정하는 간단하고 빠른 방법을 제공합니다.

서문

Porath와 동료1에의해 그것의 개시부터, 고정화금속 선호도 크로마토그래피 (IMAC)는 Zn2+ 및Ni2+ 및Cu2+및Co2+와 같은 전이금속 이온과 결합하는 그들의 기능에 근거를 둔 단백질을 빨리 분리하는 선택의 방법이 되었습니다. 이것은 가장 일반적으로 엔지니어링 된 폴리 히스티딘 태그를 통해 수행되며 재조합 단백질 2의 격리를위한 가장 일반적인 크로마토 그래피 정제 기술 중하나입니다. IMAC는 또한 퀴놀론, 테트라사이클린, 아미노글리코시드, 마크로라이드 및 β-락탐을 식품 시료 분석3및 간 및 췌장암에 대한 혈액 혈청 단백질 마커를 식별하는 단계로서 재조합 단백질 정제를 넘어서는 응용 을 발견했다4,5. 당연히, IMAC는 또한 다수의 네이티브 바이오 에너지 효소6,7,8,9,10의격리를 위한 선택의 방법이 되었다. 그러나, 효소 활성 생체 에너지 단백질에 대한 연구를 위한 이러한 정제 방법의 성공적인 구현은 컬럼 매트릭스로부터 용출된 금속 양이온의 무시할 수 있는 수준의 존재에 의존한다. IMAC에서 일반적으로 사용되는 이원성 금속 양이온은 낮은농도11,12에서도병리학적 생물학적 유의성을 알려져 있다. 이 금속의 생리적 효과는 세포 호흡 또는 광합성의 억제제로서 치명적임을 입증 할 수있는 생체 에너지 시스템에서 가장 두드러집니다13,14,15. 잔류 오염 물질 금속이 생화학 및 생화학 적 기술로 단백질의 생물학적 기능 이나 특성 분석을 방해할 수 있는 단백질 클래스의 대부분에 대 한 유사한 문제는 피할 수 있다.

산화 조건 하에서 및 이미다졸을 용리제로 사용하는 금속 오염 수준은 일반적으로낮지만,시스테인 환원제 (DTT, β-mercaptoethanol 등) 또는 히스티딘17, 18 또는 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)10,18 또는 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 10보다 더 강한 킬레이터가 있는 상태에서 수행되는 단백질 분리는 일반적으로 낮습니다. 마찬가지로, IMAC 수지의 금속 이온은 카르복실 체에 의해 자주 조정되기 때문에 산성 조건하에서 수행되는 단백질 용출은 훨씬 더 높은 수준의 금속 오염을 가질 가능성이 높습니다. 용액의 금속 함량은 원자 흡수 분광법(AAS) 및 유도결합 플라즈마 질량 분광법(ICP-MS)을 사용하여 ppb-ppt 범위21, 22,23,24에서검출한계까지 평가될 수 있다. 불행히도, AAS 및 ICP-MS는 이러한 방법이 전문 장비 및 교육에 대한 액세스를 필요로하기 때문에 기존의 생화학 실험실에서 검출을위한 현실적인 수단이 아닙니다.

브리튼25,26에 의한 이전 작업은 용액에서 전이 금속의 존재를 식별하는 방법으로 하이드록시나프톨 블루 (HNB)의 사용을 조사했다. 그러나 데이터20에는 몇 가지 내부 모순이 있었고 이러한 작업은 적절한 프로토콜을 제공하지 못했습니다. Temel외. 27 및 페레이라 외28에 의한 연구는 잠재적 인 금속 지표로 HNB와 브리튼의 작업에 확장. 그러나 Temel은 HNB를 킬레이트화 제로만 사용하여 샘플 분석을 위해 AAS를 사용하는 프로토콜을 개발했습니다. 페레이라의 연구는 563 nm에서 HNB 흡광도 스펙트럼의 변화를 사용, pH 5.7에서 HNB 금속 복합체의 스펙트럼과 크게 겹치는 자유 염료 HNB 스펙트럼의 영역, 분석 감도상당히 낮은뿐만 아니라 상대적으로 약한 금속 결합 친화도20의결과. IMAC에서 Ni2+ 침출을 가진 우리의 자신의 실험실에 있는 문제점을 해결하기 위하여, 우리는 몇몇 전이 금속의 나노몰 수준을 검출할 수 있는 쉬운 분석분석판을 개발하기 위하여 브리튼25,26 및 Ferreria28에 의해 행해진 일을 확장했습니다. 우리는 HNB가 서브 나노 몰 결합 친화도를 가진 IMAC 금속에 대한 니켈 및 기타 일반적인 결합을 보여주었고 pH 값20의넓은 범위에 걸쳐 1:1 복합체를 형성합니다. 여기에서 보고된 분석결과는 이 사실 인정에 근거하고 금속 정량화를 위한 647 nm에 HNB 스펙트럼에 있는 흡광도 변경을 이용합니다. 이 분석은 금속 염료 복합체의 색도 검출 및 정량화 및 금속에 결합할 때 자유 염료의 흡광도의 관련 변화를 사용하여 일반적인 생화학 실험실에서 발견되는 일반적인 완충제 및 계측을 사용하여 생리학적 pH 범위에서 수행될 수 있다.

프로토콜

1. 분석 성분 준비

  1. 280 nm에서 광학 흡광도 또는 단백질 정량화의 대체 방법을 사용하여 분석할 크로마토그래피 분획을 결정하여 단백질 농축 분획을 식별합니다.
    참고 : 이 작업을 위해, 우리는 다이오드 배열 UV-Vis 분광광도계를 사용했다. 처리량을 높이기 위해 UV-Vis 흡광도를 측정할 수 있는 플레이트 리더를 사용할 수 있습니다.
  2. 필요한 분석 성분의 준비
    1. 7에서 12 사이의 pH로 10-100 mM 버퍼 ("샘플 버퍼")를 준비하거나 가져옵니다.
      참고: 중성 또는 기본 pH에서 Tris, HEPES, MOPS 및 인산염과 같은 일반적인 생화학 완충제는 모두 분석에 허용됩니다. 트리신과 히스티딘은 사용할 수 있지만 금속 이온을 실질적으로 킬레이트하기 때문에 교정 곡선이 필요합니다. 히스티딘에 대한 교정의 예는 참조20에도시되어 있습니다.
    2. 제조된 각 밀리리터의 스톡 용액에 대해 120 mg의 HNB 시약을 사용하여 샘플 버퍼에 하이드록시나프톨 블루(HNB) 분산액의 12% w/v(20배 농축) 용액을 준비합니다.
      주의: HNB를 눈에 노출하면 심각한 손상과 자극을 유발할 수 있습니다. HNB를 취급할 때는 눈 보호 기능을 사용해야 하며, 취급 후에는 손을 철저히 세척해야 합니다.
      참고 : HNB는 과학 시약의 주요 공급 업체에 의해 KCl에 분산으로 판매된다. 이와 같이, 용액의 실제 농도는 다른 제조, 배치 및 병에서 HNB 분산이 취해지는 곳에서 달라질 것이다. 이상적으로는 주식의 20 배 희석 후 647 nm에서 0.5-0.8 사이의 흡광도가 달성되어야합니다.

2. 시료 준비 및 측정

  1. 데이터 수집을 위한 분광광도계 준비
    1. UV-Vis 분광광도계를 켜고 데우십시오. 분광광도계를 설정하여 647nm에서 데이터를 수집합니다.
      참고: 분광광도계가 허용하는 경우, 염료 금속 및 염료 스펙트럼과 관련된 큰 변화 없이 850 nm 또는 기타 파장에서 데이터를 추가로 수집하여 기준선 보정에 사용할 수 있습니다.
    2. 샘플 버퍼를 사용하여 분광광도계를 비워 둡습니다.
      참고: 석영 또는 일회용 플라스틱 큐벳을 사용할 수 있습니다. 쿼츠 큐벳은 일회용 플라스틱 큐벳보다 더 높은 정확도와 정밀도를 허용하기 때문에 정량 분석에 선호됩니다. 그러나 플라스틱 큐벳은 일부 다이오드 배열 분광광도계의 측정 빔에 존재할 수 있는 UV 광을 차단합니다. 강렬한 UV 광에 HNB를 노출하면 주목할만한 염료 저하 및 느린 금속 결합과 혼동 될 수있는 원치 않는 느린 흡광도 감소를 유발합니다 (예 : 참조 지원 정보 20의 그림 1 참조).
  2. 제어의 준비 및 흡광도 측정
    1. 총 분석 부피의 밀리리터당 50 μL의 HNB 스톡을 포함하는 제어 솔루션을 준비합니다. 모든 샘플의 좋은 혼합을 보장하기 위해, 파이펫 작은 볼륨 먼저 파이펫 다음 파이펫에 의해 혼합 다음 샘플 버퍼를 추가합니다. 희석 된 HNB 용액은 신선하지만 HNB 주식은 4 °C에 저장되고 상당한 열화없이 몇 주 동안 빛으로부터 차폐 될 수 있습니다.
    2. 제어가 실온에서 최소 3분 동안 배양되도록 합니다.
      참고: 알칼리성 pH의 시료나 용해성이 떨어지는 금속 복합체의 형성으로 인해 인산염이 있는 시료에 더 긴 배양 시간이 필요할 수 있습니다.
    3. 대조군 시료에 대해 647 nm에서 흡광도를 측정하고 기록합니다.
  3. 시료의 준비 및 흡광도 측정
    1. 50 μL의 HNB 스톡을 950 μL의 적당히 희석된 단백질 분획과 샘플 버퍼로 혼합하여 분석 샘플을 준비합니다.
      참고: 문헌에 보고된 금속 오염 수준은 용출 조건16,20에따라 1000 배 이상의 요인에 의해 변화하기 때문에, 분석의 동적 범위 내에서 흡광도 변화를 달성하기 위해 샘플 버퍼(위의 단계 1.2.1 참조)를 사용하여 분석된 단백질 분획의 몇 가지 희석을 시도할 필요가 있을 수 있다.
      주의: IMAC에 사용되는 니켈 및 기타 금속은 발암성으로 의심되는 피부 자극성으로 알려져 있으며 장기간 노출 후 신장과 혈액을 손상시킬 수 있습니다. IMAC로 제조된 단백질 샘플을 취급할 때 장갑과 눈 보호 기능을 사용해야 합니다.
    2. 시료가 실온에서 최소 3분 동안 배양하고 647 nm에서 흡광도를 측정합니다.
      참고: 투자 시간 측면에서 분석의 제한 단계는 인큐베이션 단계입니다. 이 백서의 데이터는 각 샘플 간에 신중하게 세척된 단일 쿼츠 큐벳을 사용하여 수집되었습니다. HNB 스톡의 세척 시간과 준비를 추가하더라도 14개의 샘플과 제어에 대한 데이터 수집은 약 1시간 반이 걸렸으며, 따라서 중단 없이 프로토콜을 쉽게 완료할 수 있습니다.
    3. 측정될 각 분수에 대해 2.3.1 단계와 2.3.2단계를 반복합니다.
      참고: 여러 개의 큐벳이 여러 샘플에 사용되는 경우, 유사한 인큐베이션 시간과 주변 광에 노출될 수 있는 방식으로 샘플을 준비해야 합니다.

3. 금속 정량화

  1. 각 시료의 금속 농도 결정
    1. HNB 대조군으로부터 647 nm에서 각 시료 흡광도의 차이를 찾아보십시오.
    2. 아래 공식을 사용하여 금속 농도(μM)를 결정합니다.

      figure-protocol-2904

      여기서 DF는 분석 분획에 대한 희석 인자, ΔAbs647은 647 nm에서의 흡광도 변화, 3.65x10-2는 HNB의 소멸 계수를 나타낸다(θ=36.5 mM-1 ~cm-1 참조참조 20 참조) 및 l은 큐벳의 광학 경로를 cm로 나타낸다.

결과

MSP1E3D129의 절연으로부터Ni2+에 대해 분석된 중성 pH(검정선) 및 대표적인 분획 스펙트럼에서의 자유 HNB 스펙트럼은 도 2에나타내었다. 성공적인 분석 시리즈는 전이 금속이 있는 HNB 복합체의 형성에 대응하는 HNB 대조군과 비교하여 647 nm에서 감소된 흡광도를 입증해야 한다. 실패한 분석은 647 nm에서 흡광도의 증가에 의해 표시됩니다. 양자택일로, 647 ...

토론

HNB를 사용한 금속의 색도 검출은 IMAC 수지에서 전이 금속 이온에 의한 단백질 오염 정도를 정량화하는 간단한 방법을 제공합니다. Ref. 20에 확립된 바와 같이 Ni2+는 1:1 stoichiometry와 ni-HNB 복합체의 pH 변경에 대한 해리 상수로 HNB에 결합합니다. 그러나, 복합 Kd는 모든 권장(7-12) pH 값에 대한 하위 nM 범위에 있다. 실질적으로, 그것은 모든 Ni2+ 모든 테스트 된 분획에 있는 다른 ?...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

이 자료는 그랜트 MCB-1817448에 따라 국립 과학 재단에 의해 지원 작업을 기반으로 토마스 F. 및 케이트 밀러 제프리스 기념 신탁에서 수상, 뱅크 오브 아메리카, 재단 이사 및 지정된 기증자 헤이즐 소프 카먼과 조지 게이 카먼 신뢰.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2xYT brothFisher ScientificBP9743-500media for E.coli growth
HEPES, free acidBioBasicHB0264alternative buffer
HisPur Ni-NTA resinThermo Scientific88222
Hydroxynaphthol blue disoidum saltSigma-Aldrich219916-5g
ImidazoleFisher ScientificO3196-500
ImidazoleBioBasicIB0277
MOPS, free acidBioBasicMB0360alternative buffer
Sodium chlorideFisher ScientificS271-500
Sodium phosphateFisher ScientificS369-500alternative buffer
TricineGold BioT870-100
Tris baseFisher ScientificBP152-500
Triton X-100Sigma-AldrichT9284-500

참고문헌

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