Cuantificación de la lixiviación de metal en la cromatografía de afinidad de metal inmovilizada

Resumen

Presentamos un ensayo para una fácil cuantificación de metales introducidos en muestras preparadas mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas. El método utiliza el azul hidroxinaphthol como indicador de metal colorimétrico y un espectrofotómetro UV-Vis como detector.

Resumen

La contaminación de enzimas con metales lixiviados a partir de columnas de cromatografía de afinidad de metales inmovilizadas (IMAC) plantea una preocupación importante para los enzimólogos, ya que muchos de los cationes di y trivalentes comunes utilizados en las resinas IMAC tienen un efecto inhibitorio sobre las enzimas. Sin embargo, el alcance de la lixiviación de metales y el impacto de varios reactivos de elución y reducción se entienden mal en gran parte debido a la ausencia de protocolos de cuantificación de metales de transición simples y prácticos que utilizan equipos típicamente disponibles en laboratorios de bioquímica. Para abordar este problema, hemos desarrollado un protocolo para cuantificar rápidamente la cantidad de contaminación metálica en muestras preparadas utilizando IMAC como paso de purificación. El método utiliza el azul hidroxinaphthol (HNB) como indicador colorimétrico para el contenido de catión de metal en una solución de muestra y la espectroscopia UV-Vis como medio para cuantificar la cantidad de metal presente, en el rango nanomolar, basado en el cambio en el espectro HNB a 647 nm. Mientras que el contenido de metal en una solución se ha determinado históricamente utilizando espectroscopia de absorción atómica o técnicas de plasma acoplado inductivamente, estos métodos requieren equipos especializados y entrenamiento fuera del alcance de un laboratorio de bioquímica típico. El método propuesto aquí proporciona una manera sencilla y rápida para que los bioquímicos determinen el contenido de metal de las muestras utilizando el equipo y el conocimiento existentes sin sacrificar la precisión.

Introducción

Desde sus inicios por Porath y sus compañeros de trabajo¹, la cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) se ha convertido en un método de elección para separar rápidamente las proteínas en función de su capacidad de unirse con iones metálicos de transición como Zn^2+,Ni^2+,Cu²⁺y Co^2+. Esto se hace más comúnmente a través de etiquetas de polihistidina de ingeniería y ahora es una de las técnicas de purificación cromatográfica más comunes para el aislamiento de proteínas recombinantes². IMAC también ha encontrado aplicaciones más allá de la purificación de proteínas recombinantes como una forma de aislar quinolonas, tetraciclinas, aminoglucósidos, macrólidos y lactams para el análisis de muestras de alimentos³ y como un paso en la identificación de marcadores de proteínas de suero sanguíneo para cánceres de hígado y páncreas^4,5. No es de extrañar que IMAC también se haya convertido en un método de elección para el aislamiento de una serie de enzimas bioenergéticas nativas^6,7,8,9,10. Sin embargo, la implementación exitosa de estos métodos de purificación para estudios sobre proteínas bioenergéticas enzimáticamente activas depende de la presencia de niveles insignificantes de cationes metálicos lixiviados de la matriz de columna en el eluido. Los cationes metálicos divalentes comúnmente utilizados en IMAC han conocido significación biológica patológica, incluso a bajas concentraciones^11,12. El efecto fisiológico de estos metales es más pronunciado en los sistemas bioenergéticos, donde pueden resultar letales como inhibidores de la respiración celular o fotosíntesis^13,14,15. Problemas similares son inevitables para la mayoría de las clases de proteínas donde los metales contaminantes residuales pueden interferir con las funciones biológicas de una proteína o la caracterización con técnicas bioquímicas y biofísicas.

Mientras que los niveles de contaminación de metales en condiciones oxidantes y el uso de imidazol como eluyente son típicamentebajos¹⁶, los aislamientos proteicos realizados en presencia de agentes reductores de cisteína (TDT, é-mercaptoetanol, etc.) o con queladores más fuertes como la histidina^17,18 o ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) dan como resultado niveles mucho más altos de contaminación metálica^19. Del mismo modo, dado que los iones metálicos en las resinas IMAC son frecuentemente coordinados por grupos carboxílicos, también es probable que las eluciones de proteínas realizadas en condiciones ácidas tengan niveles mucho más altos de contaminación metálica. El contenido de metal en soluciones se puede evaluar utilizando espectroscopía de absorción atómica (AAS) y espectrometría de masas plasmáticas acopladas inductivamente (ICP-MS) hasta un límite de detección en el rango ppb-ppt^21,22,23,24. Desafortunadamente, AAS y ICP-MS no son medios realistas para la detección en un laboratorio de bioquímica tradicional, ya que esos métodos requerirían acceso a equipos especializados y capacitación.

Trabajo anterior de Brittain^25,26 investigó el uso de azul hidroxinaphthol (HNB) como una manera de identificar la presencia de metales de transición en solución. Sin embargo, hubo varias contradicciones internas en los datos²⁰ y esas obras no ofrecieron un protocolo adecuado. 27 y Ferreira et al.²⁸ ampliaron el trabajo de Brittain con HNB como un indicador de metal potencial. Sin embargo, Temel desarrolló un protocolo que hace uso de AAS para el análisis de muestras, utilizando HNB sólo como agente quelante. El estudio de Ferreira utilizó el cambio en los espectros de absorbancia HNB a 563 nm, una región de los espectros HNB de tinte libre que se superpone en gran medida con los espectros de complejos de metal HNB a pH 5.7, haciendo que la sensibilidad del ensayo sea bastante baja, así como dando como resultado una afinidad de unión de metales relativamente débil^20. Para abordar problemas en nuestro propio laboratorio con Ni²⁺ lixiviación de IMAC, hemos ampliado el trabajo realizado por Brittain^25,26 y Ferreria²⁸ para desarrollar un ensayo fácil capaz de detectar niveles nanomolares de varios metales de transición. Mostramos que HNB une níquel y otros comunes para los metales IMAC con afinidades de unión sub-nanomolar y forma 1:1 complejo en una amplia gama de valores de pH²⁰. El ensayo aquí indicado se basa en estos hallazgos y utiliza cambios de absorbancia en el espectro HNB a 647 nm para la cuantificación de metales. El ensayo se puede realizar en el rango de pH fisiológico utilizando tampones e instrumentación comunes que se encuentran en un laboratorio de bioquímica típico mediante la detección colorimétrica y cuantificación de complejos de tinte metálico y el cambio asociado en la absorbancia del tinte libre cuando se une al metal.

Protocolo

1. Preparación de componentes de ensayo

1. Determinar las fracciones de cromatografía que se deben ensayo utilizando absorbancia óptica a 280 nm o métodos alternativos de cuantificación de proteínas para identificar las fracciones enriquecidas con proteínas.
   NOTA: Para este trabajo, utilizamos un espectrofotómetro UV-Vis de matriz de diodos. Para aumentar el rendimiento, se puede utilizar un lector de placas capaz de medir la absorbancia UV-Vis.
2. Preparación de los componentes de ensayo necesarios
   1. Preparar u obtener un búfer de 10-100 mM ("Buffer de muestra") con un pH entre 7 y 12.
      NOTA: Los tampones bioquímicos comunes como Tris, HEPES, MOPS y fosfato a pH neutro o básico son aceptables para el ensayo. La tricina y la histidina se pueden utilizar, pero requerirán curvas de calibración, ya que ambos producen iones metálicos sustancialmente quelatos. En la referencia²⁰se muestra un ejemplo de calibración de la histidina.
   2. Preparar una solución de 12% p/v (20 veces concentrada) de dispersión azul hidroxinaftal (HNB) en el búfer de muestra utilizando 120 mg de reactivo HNB para cada mililitro de solución de stock preparada.
      ADVERTENCIA: La exposición de HNB al ojo puede causar daños graves e irritación. Se debe utilizar protección ocular al manipular HNB y las manos deben lavarse a fondo después de la manipulación.
      NOTA: HNB se vende como una dispersión en KCl por los principales proveedores de reactivos científicos. Como tal, la concentración real en solución variará de diferentes fabricantes, lotes, y donde en el frasco se toma la dispersión HNB. Idealmente, se debe lograr una absorbancia entre 0,5-0,8 a 647 nm después de una dilución de 20 veces de la población.

2. Preparación y medición de muestras

1. Preparación del espectrofotómetro para la recopilación de datos
   1. Encienda y caliente el espectrofotómetro UV-Vis. Ajuste el espectrofotómetro para recopilar datos a 647 nm.
      NOTA: Si el espectrofotómetro lo permite, recopile además datos a 850 nm, o alguna otra longitud de onda sin cambios significativos relacionados con los espectros de colorante-metal y tinte, que se utilizarán para una corrección de línea base.
   2. Enblanco el espectrofotómetro utilizando el búfer de muestra.
      NOTA: Se pueden utilizar cubetas de cuarzo o de plástico desechables. Las cubetas de cuarzo son preferidas para el análisis cuantitativo, ya que permitirán una mayor precisión y precisión sobre las cubetas de plástico desechables. Sin embargo, las cubetas de plástico bloquean la luz UV, que puede estar presente en los haces de medición de algunos espectrofotómetros de matriz de diodos. La exposición de HNB a la luz UV intensa provoca una degradación notable del tinte y una disminución de la absorción lenta no deseada que se puede confundir con la unión lenta de metales (por ejemplo, véase la Figura 1 en Información de apoyo de la referencia 20).
2. Medición de la preparación y absorbancia del control
   1. Preparar una solución de control que contenga 50 ml de hnB por mililitro de volumen total de ensayo. Para garantizar una buena mezcla de todas las muestras, pipetee primero los volúmenes pequeños y luego agregue el búfer de muestra seguido de la mezcla mediante pipeteo. La solución diluida de HNB debe prepararse fresca, pero las existencias de HNB pueden almacenarse a 4 oC y protegerse de la luz durante semanas sin una degradación significativa.
   2. Deje que el control se incubadurante durante un mínimo de 3 minutos a temperatura ambiente.
      NOTA: Puede ser necesario un tiempo de incubación más largo para las muestras a pH alcalino o en presencia de fosfato debido a la formación de complejos metálicos poco solubles, lo que resulta en un equilibrio más lento.
   3. Mida y registre la absorbancia a 647 nm para la muestra de control.
3. Medición de la preparación y absorción de muestras
   1. Preparar las muestras de ensayo mezclando 50 ml de stock de HNB con 950 ml de fracciones proteicas diluidas adecuadamente con el tampón de muestra.
      NOTA: Dado que los niveles de contaminación metálica reportados en la literatura varían según un factor de más de 1000 dependiendo de las condiciones de elución^16,20, puede ser necesario probar algunas diluciones de las fracciones de proteína ensayadas con el tampón de muestra (véase el paso 1.2.1 anterior) para lograr cambios de absorbancia dentro del rango dinámico del ensayo.
      ADVERTENCIA: El níquel y otros metales utilizados en IMAC son irritantes de la piel conocidos, se sospecha que son cancerígenos, y son capaces de dañar los riñones y la sangre después de una exposición prolongada. Se deben utilizar guantes y protección ocular al manipular muestras de proteínas preparadas con IMAC.
   2. Deje que la muestra se incuba durante un mínimo de 3 minutos a temperatura ambiente y mida las absorbancias a 647 nm.
      NOTA: El paso limitante del ensayo en términos de tiempo invertido es el paso de incubación. Los datos de este papel se recopilaron utilizando una sola cubeta de cuarzo que se lavó cuidadosamente entre cada muestra. Incluso con el tiempo de lavado añadido y la preparación del stock de HNB, la recolección de datos para 14 muestras y el control tomó aproximadamente una hora y media y como tal, el protocolo se puede completar fácilmente sin necesidad de interrupción.
   3. Repita los pasos 2.3.1 y 2.3.2 para cada fracción que se mida.
      NOTA: Si se utilizarán varias cubetas para múltiples muestras, las muestras deben prepararse de manera que permita un tiempo de incubación comparable y una exposición a la luz ambiental.

3. Cuantificación de metales

1. Determinar la concentración de metal en cada muestra
   1. Encuentre la diferencia de cada absorbancia de muestra a 647 nm del control HNB.
   2. Determinar la concentración de metales (en M) utilizando la siguiente fórmula:
      
      
      
      donde df es el factor de dilución para la fracción de ensayo, el Valor₆₄₇ es el cambio de absorbancia a 647 nm, 3.65x10^-2 representa el coeficiente de extinción de HNB (36,5 mM^-1cm^-1 ver referencia²⁰ para más detalles) y l es la trayectoria óptica de la cubeta en cm.

Resultados

El espectro de HNB libre a pH neutro (línea negra) y espectros representativos de fracciones saysaying para Ni²⁺ desde el aislamiento de MSP1E3D1²⁹ se muestran en la Figura 2. Una serie de ensayos exitosa debe demostrar una disminución de la absorbancia a 647 nm en comparación con el control HNB, que corresponde a la formación de complejos HNB en presencia de un metal de transición. Un ensayo fallido se indicaría mediante un aumento de la absorbancia ...

Discusión

La detección colorimétrica de metales mediante HNB proporciona una forma sencilla de cuantificar el grado de contaminación de proteínas mediante la transición de iones metálicos de resinas IMAC. Como establecimos en la Ref. 20, Ni^{2+ se} une a HNB con estequiometría 1:1 y la constante de disociación para los cambios complejos de Ni-HNB con pH. Sin embargo, el complejo K_d está en el rango sub-nM para todos los valores de pH recomendados (7-12). En términos prácticos, significa que todos los ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2xYT broth	Fisher Scientific	BP9743-500	media for E.coli growth
HEPES, free acid	BioBasic	HB0264	alternative buffer
HisPur Ni-NTA resin	Thermo Scientific	88222
Hydroxynaphthol blue disoidum salt	Sigma-Aldrich	219916-5g
Imidazole	Fisher Scientific	O3196-500
Imidazole	BioBasic	IB0277
MOPS, free acid	BioBasic	MB0360	alternative buffer
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sodium phosphate	Fisher Scientific	S369-500	alternative buffer
Tricine	Gold Bio	T870-100
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500