АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем асссдля для легкой количественной оценки металлов, введенных в образцы, подготовленные с использованием иммобилизованной хроматографии сродства металла. Метод использует гидроксинафтоль синий в качестве индикатора колориметрического металла и УФ-Vis спектрофотометра в качестве детектора.

Аннотация

Загрязнение ферментов металлами, выщелачиваемыми из обездвиженных металлических хроматографии (IMAC), представляет собой серьезную проблему для энзимологов, так как многие из распространенных ди-и тровалентных катионов, используемых в смолах IMAC, оказывают ингибирующее воздействие на ферменты. Однако масштабы выщелачивания металла и воздействие различных элютирующих и уменьшающихся реагентов плохо понимаются в значительной степени из-за отсутствия простых и практических протоколов количественной оценки перехода, которые используют оборудование, обычно имеющееся в лаборатории биохимии. Для решения этой проблемы мы разработали протокол для быстрой количественной оценки количества загрязнения металлом в образцах, подготовленных с использованием IMAC в качестве шага очистки. Метод использует гидроксинафтоль синий (HNB) в качестве колориметрического индикатора содержания металлических катионов в выборочном растворе и спектроскопии УФ-Виз как средство количественной оценки количества присутствуютх металла в наномолярном диапазоне, основанном на изменении спектра HNB на уровне 647 нм. В то время как содержание металла в растворе исторически определялось с помощью атомной спектроскопии поглощения или индуктивно соединенных плазменных методов, эти методы требуют специализированного оборудования и обучения вне сферы действия типичной лаборатории биохимии. Предложенный здесь метод обеспечивает простой и быстрый способ для биохимиков определить содержание металла образцов с использованием существующего оборудования и знаний без ущерба для точности.

Введение

С момента своего создания Порат и коллег1, обездвиженный хроматографии сродства металла (IMAC) стал методом выбора, чтобы быстро отделить белки на основе их способности связываться с переходными ионами металла, такими как «n2», Ni2 ,Cu2 »,и Co2 . Это чаще всего делается с помощью инженерии поли-гистидин теги и в настоящее время является одним из наиболее распространенных методов хроматографической очистки для изоляции рекомбинантных белков2. IMAC также нашел применения за рекомбинантных белков очистки как способ изолировать хинолоны, тетрациклины, аминогликозиды, макролиды, и лактамы для анализа образца пищи3 и в качестве шага в выявлении маркеров белка сыворотки крови для печени и рака поджелудочнойжелезы4. Неудивительно, что IMAC также стал методом выбора для изоляции ряда местных ферментов биоэнергетики6,7,8,9,10. Однако успешная реализация этих методов очистки для исследований на ферментативно активных биоэнергетических белках зависит от наличия незначительного уровня металлических катионов, выщелачиваемых из колонки матрицы в элюат. Divalent металлические катионы, широко используемые в IMAC, имеют известное патологическое биологическое значение, даже при низких концентрациях11,12. Физиологический эффект этих металлов наиболее выражен в биоэнергетических системах, где они могут оказаться смертельными в качестве ингибиторов клеточного дыхания или фотосинтеза13,14,15. Подобные проблемы неизбежны для большинства белковых классов, где остаточные загрязняющие металлы могут вмешиваться в биологические функции белка или характеристики с биохимическими и биофизическими методами.

В то время как уровни загрязнения металла в условиях окисления и использования имидазола в качестве элуанта, как правило,низкие16, белковые изоляции выполняются в присутствии цистеина снижения агентов (DTT, й-меркаптоэтанол и т.д.) или с сильными хелаторами, как гистидин17,18 или этилэнедиаминироватьететраацетической кислоты (EDTA) привести к гораздо выше . Аналогичным образом, поскольку ионы металла в ясных ясниках Часто координируются карбоксильными группами, эмуции белка, выполняемые в кислых условиях, также могут иметь гораздо более высокие уровни загрязнения металла. Содержание металла в растворах можно оценить с помощью атомной спектроскопии поглощения (ААС) и индуктивно соединенных плазменно-массовой спектрометрии (ICP-MS) до предела обнаружения в диапазоне ppb-ppt21,22,23,24. К сожалению, ААС и МСП-МС не являются реальнымсредством для обнаружения в традиционной лаборатории биохимии, поскольку эти методы потребуют доступа к специализированному оборудованию и обучению.

Предыдущая работа Brittain25,26 исследовалиспользование использование гидроксинафтола синего (HNB) как способ определить наличие переходных металлов в растворе. Однако в данных20 было несколько внутренних противоречий, и эти работы не дали адекватного протокола. Исследования, проведенные Temel et al.27 и Ferreira et al.28, расширили работу Бриттена с HNB в качестве потенциального металлического индикатора. Тем не менее, Темель разработал протокол, который использует AAS для анализа выборки, используя HNB только в качестве хелатирующего агента. Изучение Ferreira использовало изменение в спектре абсорбции HNB на 563 nm, зоне спектра HNB свободного красителя HNB которое перекрывает тяжело с спектрами комплексов HNB-металла на pH 5.7, делая чувствительность анализа справедливо низка, также, как приводящ к в относительно слабом сродстве связывания металла20. Для решения проблем в нашей собственной лаборатории с Выщелачивание Ni2 "от IMAC, мы расширили работу, проделанную Brittain25,26 и Ferreria28 разработать простой анализ, способный обнаруживать наномолярные уровни нескольких переходных металлов. Мы показали, что HNB связывает никель и другие общие для IMAC металлы с субнаномоллярной связывания сродства и образуют 1:1 комплекс в широком диапазоне значений рН20. Ассаи, представленный здесь, основан на этих выводах и использует абсорбционные изменения в спектре HNB на уровне 647 нм для количественной оценки металла. Анализ может быть выполнен в физиологическом диапазоне рН с использованием общих буферов и приборов, найденных в типичной лаборатории биохимии с помощью колориметрического обнаружения и количественной оценки металлоочистительных комплексов и связанных с этим изменений в абсорбции свободного красителя, когда он связывается с металлом.

протокол

1. Подготовка компонента асссе

  1. Определите фракции хроматографии, которые необходимо анализировать с помощью оптической абсорбции на уровне 280 нм или альтернативных методов количественной оценки белка для определения обогащенных белками фракций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой работы мы использовали диодный массив УФ-Вис-спектрофотометр. Для увеличения пропускной способности можно использовать считыватель пластин, способный измерять абсорбцию УФ-Виса.
  2. Подготовка необходимых компонентов ассеа
    1. Подготовка или получение буфера 10-100 мМ ("Образец буфера") с рН между 7 и 12.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общие биохимические буферы, такие как Tris, HEPES, MOPS и фосфаты при нейтральном или базовом рН, являются приемлемыми для анализов. Трицин и гистидин могут быть использованы, но потребует калибровки кривых, поскольку они оба существенно chelate ионов металла. Пример калибровки гистидина показан в справке20.
    2. Подготовьте 12% w/v (20-кратно концентрированный) раствор дисперсии гидроксинафтхола (HNB) в образец буфера с использованием 120 мг реагента HNB для каждого миллилитра готового бульонного раствора.
      ВНИМАНИЕ: Воздействие HNB на глаз может вызвать серьезные повреждения и раздражение. Защита глаз должна использоваться при обращении с HNB и руки должны быть тщательно вымыты после обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HNB продается в качестве дисперсии на KCl основными поставщиками научных реагентов. Таким образом, фактическая концентрация в растворе будет варьироваться от различных производителей, партий, и где в бутылке дисперсия HNB берется из. В идеале, абсорбция между 0,5-0,8 на 647 нм после 20-кратного разбавления запасов должно быть достигнуто.

2. Подготовка и измерение образцов

  1. Подготовка спектрофотометра для сбора данных
    1. Включите и разогрейте спектрофотометр УФ-Вис. Установите спектрофотометр для сбора данных на уровне 647 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если спектрофотометр позволяет, дополнительно собирать данные на 850 нм, или некоторые другие длины волны без значительных изменений, связанных с красителем металла и красителя спектра, которые будут использоваться для коррекции базовой линии.
    2. Пустой спектрофотометр с помощью образца буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кварц или одноразовые пластиковые кюветы могут быть использованы. Кварцевые кюветы предпочтительнее для количественного анализа, поскольку они позволят повысить точность и точность по сравнению с одноразовыми пластиковыми кюветами. Однако пластиковые кюветы блокируют ультрафиолетовый свет, который может присутствовать в измерительных лучах некоторых диодных спектрофотометров. Воздействие HNB на интенсивный ультрафиолетовый свет вызывает заметную деградацию красителя и нежелательное снижение медленного абсорбции, которое можно спутать с медленным металлическим связыванием (например, см. рисунок 1 в вспомогательной информации Справочника 20).
  2. Измерение контроля в подготовке и абсорбции
    1. Подготовьте контрольное решение, содержащее 50 л запасов HNB на миллилитр общего объема ассеа. Для обеспечения хорошего смешивания всех образцов, pipette малых объемов, а затем добавить образец буфера следуют смешивания путем pipetting. Разбавленный раствор HNB должен быть подготовлен свежим, но запасы HNB могут храниться при 4 градусах Цельсия и ограждать сяртые от света в течение нескольких недель без значительной деградации.
    2. Разрешить контроль инкубировать в течение как минимум 3 мин при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для проб щелочным рН или при наличии фосфата может потребоваться более длительное время инкубации, что приведет к более медленному уравновешению.
    3. Измерьте и запишите абсорбцию на уровне 647 нм для контрольного образца.
  3. Подготовка и абсорбция образцов
    1. Подготовьте образцы асссея, смешивая 50 л запасов HNB с 950 л соответственно разбавленных белковых фракций с образцом буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку уровни загрязнения металла, зарегистрированные в литературе, варьируются в разы более чем в 1000 в зависимости от условий elution16,20, может потребоваться попробовать несколько разбавлений анализированных белковых фракций с образцом буфера (см. шаг 1.2.1 выше) для достижения изменений абсорбции в динамическом диапазоне анализов.
      ВНИМАНИЕ: Никель и другие металлы, используемые в IMAC, известны раздражающим веществом для кожи, подозреваемым в канцерогенности и способны повредить почки и кровь после длительного воздействия. Перчатки и защита глаз следует использовать при обработке образцов белка, подготовленных с помощью IMAC.
    2. Разрешить образец инкубировать в течение как минимум 3 мин при комнатной температуре и измерить абсорбции на 647 нм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничивающим шагом проверки с точки зрения времени, вложенного является инкубационный шаг. Данные для этой бумаги были собраны с помощью одного кварцевого квета, который тщательно промывается между каждым образцом. Даже с добавлением времени стирки и подготовки запасов HNB, сбор данных по 14 пробам и контроль занимает около полутора часов, и как таковой, протокол может быть легко завершен без необходимости прерывания.
    3. Повторите шаги 2.3.1 и 2.3.2 для каждой фракции, которая будет измерена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если несколько кювет будет использоваться для нескольких образцов, образцы должны быть подготовлены таким образом, что позволяет для сопоставимого времени инкубации и воздействия окружающего света.

3. Количественная оценка металла

  1. Определение концентрации металла в каждом образце
    1. Найдите разницу в абсорбции каждого образца на уровне 647 нм от управления HNB.
    2. Определите концентрацию металла (в ММ) с помощью формулы ниже:

      figure-protocol-5928

      где DF является фактором разбавления для фракции ассеа, «Abs647 является изменение абсорбции на 647 нм, 3,65x10-2 представляет собой коэффициент вымирания HNB (No 36,5 мМ -1 см-1смсм Справка20 для более подробной информации) и l является оптическим путем cuvette в см.

Результаты

Спектр свободного HNB при нейтральном рН (черная линия) и репрезентативные спектры фракций, анализированных для Ni2 "от изоляции MSP1E3D129 показаны на рисунке 2. Успешная серия асса должна продемонстрировать снижение абсорбции на 647 нм по сравнению с контрол?...

Обсуждение

Колориметрическое обнаружение металлов с помощью HNB обеспечивает простой способ количественной оценки степени загрязнения белка переходными ионами металла из ресинов IMAC. Как мы установили в Ref. 20, Ni2' связывается с HNB с 1:1 stoichiometry и постоянной диссоциации для ni-HNB комплексных измене...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Этот материал основан на работе, поддерживаемой Национальным научным фондом при Гранте MCB-1817448 и наградой от Томаса Ф. и Кейт Миллер Джеффресс Мемориал Траст, Бэнк оф Америка, попечитель и указанный донор Хейзел Торп Карман и Джордж Гей Карман Доверять.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2xYT brothFisher ScientificBP9743-500media for E.coli growth
HEPES, free acidBioBasicHB0264alternative buffer
HisPur Ni-NTA resinThermo Scientific88222
Hydroxynaphthol blue disoidum saltSigma-Aldrich219916-5g
ImidazoleFisher ScientificO3196-500
ImidazoleBioBasicIB0277
MOPS, free acidBioBasicMB0360alternative buffer
Sodium chlorideFisher ScientificS271-500
Sodium phosphateFisher ScientificS369-500alternative buffer
TricineGold BioT870-100
Tris baseFisher ScientificBP152-500
Triton X-100Sigma-AldrichT9284-500

Ссылки

  1. Porath, J., Carlsson, J. A. N., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
  2. Block, H., et al. Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
  3. Takeda, N., Matsuoka, T., Gotoh, M. Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs. Chromatographia. 72 (1/2), 127-131 (2010).
  4. Felix, K., et al. Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia. Life sciences. 88 (5-6), 218-225 (2011).
  5. Wu, C., et al. Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: New diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (1), 55-62 (2009).
  6. Goldsmith, J. O., Boxer, S. G. Rapid isolation of bacterial photosynthetic reaction centers with an engineered poly-histidine tag. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1276 (3), 171-175 (1996).
  7. Guergova-Kuras, M., et al. Expression and one-step purification of a fully active polyhistidine-tagged cytochrome bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides. Protein Expression and Purification. 15 (3), 370-380 (1999).
  8. Mitchell, D. M., Gennis, R. B. Rapid purification of wildtype and mutant cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides by Ni(2+)-NTA affinity chromatography. FEBS Letters. 368 (1), 148-150 (1995).
  9. Tian, H., White, S., Yu, L., Yu, C. A. Evidence for the head domain movement of the rieske iron-sulfur protein in electron transfer reaction of the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 274 (11), 7146-7152 (1999).
  10. Tian, H., Yu, L., Mather, M. W., Yu, C. A. Flexibility of the neck region of the rieske iron-sulfur protein is functionally important in the cytochrome bc1 complex. Journal of Biological Chemistry. 273 (43), 27953-27959 (1998).
  11. Louie, A. Y., Meade, T. J. Metal complexes as enzyme inhibitors. Chemical Reviews. 99 (9), 2711-2734 (1999).
  12. Tamás, M. J., Sharma, S. K., Ibstedt, S., Jacobson, T., Christen, P. Heavy Metals and Metalloids As a Cause for Protein Misfolding and Aggregation. Biomolecules. 4 (1), 252-267 (2014).
  13. Gerencser, L., Maroti, P. Retardation of proton transfer caused by binding of the transition metal ion to the bacterial reaction center is due to pKa shifts of key protonatable residues. Biochemistry. 40 (6), 1850-1860 (2001).
  14. Klishin, S. S., Junge, W., Mulkidjanian, A. Y. Flash-induced turnover of the cytochrome bc1 complex in chromatophores of Rhodobacter capsulatus: binding of Zn2+ decelerates likewise the oxidation of cytochrome b, the reduction of cytochrome c1 and the voltage generation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1553 (3), 177-182 (2002).
  15. Link, T. A., von Jagow, G. Zinc ions inhibit the QP center of bovine heart mitochondrial bc1 complex by blocking a protonatable group. Journal of Biological Chemistry. 270 (42), 25001-25006 (1995).
  16. Block, H., Kubicek, J., Labahn, J., Roth, U., Schäfer, F. Production and comprehensive quality control of recombinant human Interleukin-1beta: a case study for a process development strategy. Protein Expression and Purification. 57 (2), 244-254 (2008).
  17. Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: II. Kinetics and mechanism of binding. Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22522-22531 (2010).
  18. Kokhan, O., Shinkarev, V. P., Wraight, C. A. Binding of imidazole to the heme of cytochrome c1 and inhibition of the bc1 complex from Rhodobacter sphaeroides: I. Equilibrium and modeling studies. Journal of Biological Chemistry. 285 (29), 22513-22521 (2010).
  19. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods in Enzymology. 326, 245-254 (2000).
  20. Kokhan, O., Marzolf, D. R. Detection and quantification of transition metal leaching in metal affinity chromatography with hydroxynaphthol blue. Analytical Biochemistry. 582, 113347 (2019).
  21. Doyle, C., Naser, D., Bauman, H., Rumfeldt, J., Meiering, E. Spectrophotometric method for simultaneous measurement of zinc and copper in metalloproteins using 4-(2-pyridylazo)resorcinol. Analytical Biochemistry. 579, 44-56 (2019).
  22. Furrer, J., Smith, G. S., Therrien, B., Gasser, G. . Inorganic Chemical Biology. , (2014).
  23. Hogeling, S. M., Cox, M. T., Bradshaw, R. M., Smith, D. P., Duckett, C. J. Quantification of proteins in whole blood, plasma and DBS, with element-labelled antibody detection by ICP-MS. Analytical Biochemistry. 575, 10-16 (2019).
  24. Yamasaki, S., Tsumura, A., Takaku, Y. Ultratrace Elements in Terrestrial Water as Determined by High-Resolution ICP-MS. Microchemical Journal. 49 (2), 305-318 (1994).
  25. Brittain, H. G. Complex Formation Between Hydroxy Naphthol Blue and First Row Transition Metal Cyanide Complexes. Analytical Letters. 10 (13), 1105-1113 (1977).
  26. Brittain, H. G. Binding of Transition Metal Ions by the Calcium Indicator Hydroxy Naphthol Blue. Analytical Letters. 11 (4), 355-362 (1978).
  27. Temel, N. K., Sertakan, K., Gürkan, R. Preconcentration and Determination of Trace Nickel and Cobalt in Milk-Based Samples by Ultrasound-Assisted Cloud Point Extraction Coupled with Flame Atomic Absorption Spectrometry. Biological Trace Element Research. 186 (2), 597-607 (2018).
  28. Ferreira, S. L. C., Santos, B. F., de Andrade, J. B., Costa, A. C. S. Spectrophotometric and derivative spectrophotometric determination of nickel with hydroxynaphthol blue. Microchimica Acta. 122 (1), 109-115 (1996).
  29. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size. Journal of the American Chemical Society. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  30. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Engineering, Design and Selection. 23 (11), 843-848 (2010).
  31. Bonta, M., Hegedus, B., Limbeck, A. Application of dried-droplets deposited on pre-cut filter paper disks for quantitative LA-ICP-MS imaging of biologically relevant minor and trace elements in tissue samples. Analytica Chimica Acta. 908, 54-62 (2016).
  32. Olmedo, P., et al. Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrothermal atomic absorption spectrometry. Analytica Chimica Acta. 659 (1), 60-67 (2010).
  33. Shyamal, M., et al. Highly Selective Turn-On Fluorogenic Chemosensor for Robust Quantification of Zn(II) Based on Aggregation Induced Emission Enhancement Feature. ACS Sensors. 1 (6), 739-747 (2016).
  34. Kudo, H., Yamada, K., Watanabe, D., Suzuki, K., Citterio, D. Paper-Based Analytical Device for Zinc Ion Quantification in Water Samples with Power-Free Analyte Concentration. Micromachines. 8 (4), 127 (2017).
  35. Liu, R., Zhang, P., Li, H., Zhang, C. Lab-on-cloth integrated with gravity/capillary flow chemiluminescence (GCF-CL): towards simple, inexpensive, portable, flow system for measuring trivalent chromium in water. Sensors and Actuators B: Chemical. 236 (C), 35-43 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

155HNBNi NTA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены