联合非自然氨基酸合并和点击化学为疫苗目的生产的同质糖共酶

摘要

遗传代码扩展用于在定义位点载体蛋白上引入一种非自然氨基酸，该氨基酸具有生物角功能组。生物激素功能进一步用于碳水化合物抗原的位点选择性耦合，以提供均匀糖基结合疫苗。

摘要

遗传密码扩展是将非自然氨基酸 （UAAs） 引入蛋白质以改变其特性、研究或创建新蛋白质功能或获得蛋白质结合物的有力工具。停止科登抑制，特别是琥珀色的科登抑制，已成为最流行的方法，基因引入UAA在定义的位置。此方法适用于含有生物角功能组的 UAA 的载体蛋白的制备。这种反应性手柄接下来可用于专门和有效地移植合成寡糖，以提供均匀糖结合疫苗。该协议仅限于在1:1碳水化合物哈普顿/载体蛋白比中合成糖基结合物，但可与多对生物激素功能组结合。糖球菌疫苗同质性是确保完整的物理化学特性的重要标准，因此，满足越来越多的要求苛刻的药物监管机构的建议，这是经典结合策略所未达到的标准。此外，该协议使对实际结合疫苗的结构进行微调成为可能，从而产生处理结构-免疫原性关系的工具。

引言

糖联疫苗是可用于传染病预防治疗的疫苗库的基本要素。在包括幼儿在内的广大年龄组中，它们安全、耐受和高效。它们为脑膜炎球菌、肺炎球菌或乙型流感嗜血杆菌等细胞大 增 菌引起的感染提供了^{最佳防御。}糖糖结合疫苗由纯化细菌多糖制成，形成细菌胶囊或合成寡糖，模仿这些表面表达的多糖^2，这些多糖与载体蛋白共价。载体蛋白的存在对于促进针对碳水化合物抗原3所表达的抗原决定因素的保护性体液免疫反应^至关重要。除了仔细选择和生产碳水化合物抗原外，已知对糖基结合疫苗的疗效有影响的特征是:载体蛋白的性质、结合化学（包括链接剂的性质和长度（如果使用），或糖/蛋白比^3。显然，糖与蛋白质结合的位置以及连接点的数量与免疫原性相关。迄今为止，这两个参数几乎没有被研究，因为糖结合的制备在很大程度上仍然是经验性的。它们的合成通常依赖于使用胺或碳氧酸的功能，分别，赖氨酸或阿斯巴西/谷氨酸侧链残留物存在于载体蛋白序列。这导致的不是单一的，而是糖酸结合的异质混合物。

在蛋白质中氨基酸残留物的活性、可访问性或分布上，产生更明确的糖基结合物，这些糖结合物更可靠，可以记录糖/蛋白质连接⁴的影响。通过应用蛋白甘油耦合技术，可以朝着这一目标迈出一步，这种重组过程允许在^{细胞工厂5、6}中生产受控糖^结合疫苗。然而，糖基化完全发生在D/EXNYS/T sequons内的芦笋残渣（即X是20种天然氨基酸中的任何一种），不是天然存在于载体蛋白上。

站点选择性突变，特别是纳入半胱氨酸，以利用其高度和选择性的活性出现作为替代^7，8。生产在序列中加入 UA 的载体蛋白可以为同质糖基结合疫苗制备提供更大的灵活性。超过100个UA已经开发，并进一步纳入各种蛋白质^9，10。其中许多含有生物原虫功能，通常用于进行转化后^修饰11或移植生物物理探^针12或药物^13，但非常适合与碳水化合物抗原进一步结合。Biotech¹⁴使用无细胞蛋白质合成^15，成功的例子已经声称，但根据这一策略制备糖基结合疫苗仍等待推广。

在体内策略用于生产突变载体蛋白需要一种经过改良的转化机制，包括特定的codon、识别codon的tRNA和一种氨基酸-tRNA合成酶（aaRS），它们特别催化了在tRNA上转移的UAA（图^1）16。热氨酸琥珀停止抑制是采用UAA的最广泛使用的方法之一，特别是丙丙酰-莱辛^{（PrK）17。}后者反过来可以与azido功能化碳水化合物的哈普顿反应，以提供完全定义的，均匀的糖糖酶。本手稿中，我们描述了如何合成丙丙基-L-lysine，一种携带烷基手柄的UAA，如何在细菌中翻译过程中将其整合到目标蛋白中，最后如何通过点击化学在改性蛋白质和携带亚化物功能的哈顿之间进行结合。

研究方案

1. UAA的合成:丙丙基-莱辛（PrK）

1. N α- Boc - propargyl -lysine^{的合成 18}
   1. 将 500 毫克的 Boc-L-Lys-OH（2.03 mmol）溶解在烧瓶中，将水性 1 M NaOH （5 mL） 和 THF （5 mL） 混合在烧瓶中，将烧瓶与硅隔膜混合。
   2. 在冰浴中冷却烧瓶，然后在搅拌时使用微锡林格滴（2-3 分钟）滴滴添加 158 μL 的丙丙基氯仿酸（1.62 mmol）。
   3. 将反应混合物加热至室温，继续搅拌10小时。
   4. 在冰浴中冷却50 mL二乙醚、50 mL水性1 M盐酸和60 mL乙酸乙酸乙酯溶液。
   5. 冷却冰浴中的粗反应混合物，将混合物倒入分离漏斗中。用50 mL的二乙醚提取混合物。丢弃有机层。
   6. 小心地在分离漏斗中的水相中加入水性1 M盐酸。然后用30 mL乙酸乙酸酯萃取水层两次。使用 CH_2Cl2 - 甲醇 （9:1） 作为吸水剂，通过 TLC 验证有机相中是否存在 N-Boc-Propargyl-lysine。
   7. 在 MgSO 4 上干燥组合_的有机层，过滤掉固相，在旋转蒸发器上降低压力下将滤液浓缩。
   8. 溶解脱盐氯仿（CDCl^{3）中原油N α-Boc-Propargyl-lysine}的样品，并在^1HNMR下控制其特性。
      注意:提取可能导致压力积聚。经常释放任何压力积聚。
2. 非自然氨基酸蛋白酶-L-莱辛（PrK）的合成
   1. 在^{装有隔膜的圆形}底部烧瓶中引入 N- boc - α - propargyl -lysine。
   2. 将4 mL无水二氯甲烷（CH₂Cl_2）加入砷下的烧^{瓶，溶解N α-Boc-propargyl-lysine。}
   3. 搅拌时，使用注射器滴滴加入4 mL的三氟乙酸（TFA）。
   4. 在RT搅拌反应混合物1小时，使用CH 2 Cl_2-甲醇_（9:1）作为吸水剂，通过TLC监测反应。
   5. 在减压下浓缩反应混合物。
   6. 将二乙醚加入粗残留物中，并在4°C下孵育1小时，以沉淀PrK。在较高规模下工作时，如果PrK未完全沉淀，则三角沉淀，并根据需要延长孵育时间。
   7. 在玻璃玻璃上以白色固体的形式过滤PrK。
   8. 在 D 2 O 中溶解 PrK_的等分。然后进行 NMR 分析，以控制其特性和纯度。
   9. 为进一步使用，将非自然氨基酸PrK溶解在蒸馏水中，最终浓度为100 mM，并在-20°C下储存为1 mL等分。

2. 生产由PrK改性改性重组蛋白

1. 质粒制备
   1. 构造一个表达质粒（pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-H），其中包含目标成熟的肺炎球菌表面阿登辛A（pPsa）基因（pET24d-mPsaA-WT），然后是烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶序列， 通过克隆pET24d质粒的BamHI 和 XhoI 限制位点之间的插入。这将介绍他的₆ 标签在蛋白质的C术语。使用传统的站点定向诱变技术，用琥珀色的 codon （TAG） 替换 Lysine-32 的鳕子。
   2. 构造第二个表达质粒（pEVOL-MmPylRS），其中包含两个副本的基因编码的火热酶-tRNA合成酶从 甲 烷诺西亚纳迷宫（MmPylRS）和基因编码的相应^tRNAPyr， 如^{前面描述的19。}使用这种专门设计的质粒载体，pEVOL，有效地结合万种病。
      注:详细的质粒信息在补充文件1 中描述。
2. 质粒共转化为表达应变
   1. 在冰上解冻100μL的化学能力 大肠杆菌 BL21（DE3）5分钟。
   2. 将每个质粒的1μL（每个质粒50-100纳克）加入到细胞中，在冰上孵育30分钟。
   3. 将 1.5 mL 微管与解冻的称职细胞一起，在 42 °C 的培养箱中移动 45 秒，然后将其移回冰中 2 分钟。
   4. 加入900μL的LB介质，在37°C下在摇动下孵育1小时，以允许抗生素表达。然后用25微克/mL的卡那霉素和30微克/mL的氯霉素将细菌盘到LB agar上。允许在37°C下过夜生长细菌。
3. 使用PrK修饰的蛋白质的表达
   1. 用抗生素（25微克/mL的卡那霉素和30微克/mL的氯霉素）在5 mL的LB介质中接种单个共转化菌落。在37°C下孵育过夜，并摇动。
   2. 将原培养子（5 mL）稀释成含有抗生素的500 mL，0.02%的L-arabinose和不自然的氨基酸PrK的1 mM，并在37°C下孵育24小时，并摇动。通过并行执行没有 PrK 的培养，包括负对，通过执行含有 wt 蛋白的克隆的培养，包括负对。
   3. 500 mL 培养介质中为 5 mL 的 Aliquot 5 mL，离心机为 5，000 x g ， 离心机 10 分钟。丢弃上一液，将颗粒冷冻在-20°C。 通过离心从剩余的495 mL中收获细胞，在5，000 x g下10 分钟。丢弃上一液，将颗粒冷冻在-20°C。
4. 通过SDS-PAGE和西式 Blot 分析，分析 5 mL 培养样品中的粗细胞提取物
   1. 将 5 mL 细胞颗粒重新放入 250 μL 的解液缓冲液（50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO 4、150 mM NaCl、pH 8、5 mM imidazole、0.2 mM PMSF）中，并将其转移到 1.5 mL 微管中。
   2. 通过冷冻液氮中的管，在42°C的浴池中解冻细胞，以高速旋转30s。重复此步骤 3 次。
   3. 以 17，000 x g 的离 心 样品 10 分钟，以消除细胞碎片。
   4. 服用10μL的上流液，加入5μL水和5μL的负载缓冲液（布罗莫酚蓝色、SDS、β-甲醇）。。在100°C下加热样品5分钟，并进行SDS-PAGE和西线分析。
5. 使用镍-NTA珠子通过重力流台亲和力色谱进行蛋白质纯化
   1. 将细胞颗粒（从 495 mL 培养物）重新填充到 20 mL 的解解缓冲液中（50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO 4，150 mM NaCl，pH 8，5 mM imidazole，0.2 m PMSF）。
   2. 将5 μL的DNase I（1mg/mL）和500μL的解酶（50毫克/mL）加入到悬浮液中，并在30分钟内在37°C下将悬浮液孵育为37°C，允许乳解。
   3. 在5分钟内对细胞进行声波化（周期为5 s-5 s，振幅为50%）然后在 20，000 x g 下离心去除细胞 碎屑 30 分钟，然后在 0.45 μm 过滤器上过滤。
   4. 将 Ni-NTA 树脂加入悬浮液（500 μL，用于 500 mL 的细胞培养），并在 4°C 下轻轻混合 1 小时。
   5. 将悬浮液倒入聚丙烯柱中，并收集未绑定分数。
   6. 用含有 50 mM Na₂HPO 4 /NaH 2 PO_4、150 mM NaCl、 10 mM imidazole 的洗涤缓冲液清洗树脂。用 5 mL 洗涤缓冲液（50 mM Na 2 HPO₄/NaH₂PO_4、150mM NaCl、20 mM imidazole）第二次清洗树脂。收集洗涤分数。
   7. 用 1 mL 洗脱缓冲液（50 mM Na₂HPO 4 /NaH₂PO₄， 150 mM NaCl， 300 mM imidazole） 来洗出他标记的蛋白质。重复此步骤 4 次，并收集所有洗脱分数。
   8. 在 12% 丙烯酰胺凝胶上分析 SDS-PAGE 的粗晶酸盐和 7 个纯化分数。
   9. 使用透析膜（切断MW 6000-8000 Da）将含有纯 His 标记蛋白的馏分与 1 L 的 TEV 蛋白酶缓冲液（50 mM Tris-HCl，0.5 mM EDTA，pH 8）进行一夜透析。测量蛋白质浓度在280纳米，摩尔灭绝系数为37 360厘米^{-1 +M-1}和分子量34.14 kDa为mPsa。

3. TEV蛋白酶消化去除组蛋白标签

1. 将蛋白质样品收集到50 mL管中，并在浓度为2mg/mL时加入TEV缓冲液（50 mM Tris HCl，0.5 mM EDTA，pH 8），高达1 mL。
   注:浓度可能因先前结果而异。我们测试的蛋白质浓度在典型的2-3毫克/mL范围内。
2. 加入100μL的TEV蛋白酶（加入1μL含有10单位的TEV蛋白酶，用于20μg的蛋白质消化）。
3. 加入 50 μL 的 0.1 M 二次醇 （DTT）。
4. 配有 TEV 缓冲器（50 mM Tris HCl，0.5 mM EDTA，pH 8），高达 5 mL。
5. 在4°C下孵育，剧烈摇晃。
   注:如果消化不彻底，加入更多的TEV蛋白酶，孵育时间更长或在高达30°C的高温下孵育。
6. 使用透析膜（截止 6000-8000 Da）对磷酸盐缓冲液（50 mM Na 2 HPO 4 HPO₄/NaH₂PO 4，150 mM NaCl，5 mM imidazole），在_4°C下通宵去除 EDTA。
7. 为了消除TEV蛋白酶和未消化的蛋白质，用Ni-NTA珠子孵育混合物，并在4°C下轻轻混合1小时。
8. 将悬浮液倒入聚丙烯柱中。收集未绑定分数，用 5 mL 洗涤缓冲液洗柱（50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO_4，150 mM NaCl， 10 mM imidazole）
   注:感兴趣的蛋白质应在未绑定和洗涤分数中回收。
9. 通过添加5 mL洗脱缓冲液（50 mM Na 2 HPO 4 /NaH₂PO_4，150mM NaCl，300 mM imidazole），将TEV蛋白酶和未消化蛋白加入。检查280 nm的蛋白质含量分数，并通过SDS-PAGE分析。
10. 通过将未消化的蛋白质加载到 SDS PAGE 上，以控制，检查消化效率。
11. 在4°C下用透析膜（切断6000-8000 Da）将消化的蛋白质对1L的点击缓冲液（50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO 4，pH8）进行通宵透析，以去除伊米达佐，并交换缓冲液， 并测量蛋白质浓度在280 nm与摩尔灭绝系数和分子量的mPsaA（37 360厘米^-1+M-1和MW 34.14 kDa）。

4. 对非自然氨基酸蛋白酶的可访问性和点击化学功能的评估

注: 使用 Presolski 等人²⁰ 所述的点击化学协议，将 mpsa 与 6-六氯氟辛 - 阿齐德结合。

1. 以57.8μM浓度为57.8μM的PrK突变蛋白为432.5μL，放入2 mL微管中。
   注:烷基最低浓度为2μM。如果蛋白质浓度较低，则用离心浓缩物浓缩，或通过增加阿齐德/烷基摩尔比来平衡反应。
2. 加入 10 μL 的 5 mM 6-六氯氟化素-阿齐德，然后在 20 mM 处加入 2.5 μL 的 CuSO₄ 溶液，在 50 mM（库存溶液浓度）处添加 7.5 μL 的 Tris（苯二甲酰胺）胺 （THPTA）。
   1. 加入25μL水性100 mM氨基瓜尼丁盐酸。
   2. 加入25μL的20毫克/mL，一种临时制备的抗酸钠水溶液。
   3. 关闭管子，通过反转混合几次，在室温下孵育2小时。
   4. 加入 50 μL 的 0.5 M EDTA，停止反应。
   5. 服用15μL的反应混合物，并把它放在一个微管，加入5μL的加载缓冲液（溴酚蓝色，SDS，β-美甲乙醇），在100°C加热混合物5分钟，然后加载到12%丙烯酰胺凝胶。迁移后，在 312 nm 的紫外光下在凝胶上可视化荧光结合。

5. 通过单击化学将mPsa与阿齐多功能化碳水化合物抗原（Pn14TS-N_3）结合

1. 耦合
   1. 将 432.5 μL 的 PrK 突变蛋白在 57.8 μM 下放入 2 mL 微管中。
   2. 在水中加入 10 μL 5 mM Pn14TS-N₃^21， 然后在 20 mM 处加入 2.5 μL 的 CuSO₄ 溶液预混，在 50 mM 时加入 7.5 μL 的 THPTA。
      注:Pn14TS-N₃的合成，一种四糖， 一 种模仿肺炎链球菌血清型14大帽多糖，已描述在参考21。从理论上讲，任何含有亚兹德功能的碳水化合物抗原都可以使用。
   3. 加入25μL的100 mM氨基瓜尼丁盐酸。
   4. 加入25μL的20mg/mL，临时制备的抗酸钠水溶液。
   5. 关闭管子，通过反转几次混合，并在2小时内在RT中孵育。
   6. 加入 50 μL 的 0.5 M EDTA，停止反应。
   7. 采集 15 μL 样品，然后通过 SDS-PAGE 进行分析。
2. 糖联聚气的凝胶过滤纯化
   1. 通过将其应用于一个石排的排干琼糖柱（15 x 600 床尺寸，3，000-70，000 分馏范围）来净化糖气，用 100 mM PBS 缓冲液进行平衡，pH 7.3 在 0.8 mL/min 流量下检测为 280 nm。
   2. 收集含有糖联酸的馏分。
      注:对于长期储存，将糖分液对1L的_{H 2}O两次2小时，然后用透析膜（切断Mw 6000-8000 Da）在4°C过夜，然后冷冻干燥，将糖结合储存在-80°C。

结果

在这个项目中，使用琥珀色停止抑制策略编写了一种均匀糖基结合疫苗，在定义的地点引入 UAA（图1）。肺炎球菌表面阿得辛 A 被选为载体蛋白莫伊蒂。这种蛋白质是高度保存和表达所有菌株肺炎链球菌^22。它是高度免疫原性，以前用作载体的肺炎球菌疫苗配方^21，23。作为概念的证...

讨论

现场定向诱变是一个直接的策略，将特定的氨基酸纳入一种蛋白质的固定位置，这种蛋白质仍然几乎不用，目的是准备糖基结合疫苗^{7，8，14。}基于20种天然氨基酸方法的经典突变是高效的，因为不需要修改翻译机械。半胱氨酸突变通常针对进一步探索独特的硫醇反应，无论是直接还是分两步（例如，在它修改成去氢碱中...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AIM (autoinductif medium)	Formedium	AIMLB0210	Solid powder
Boc-Lys-OH	Alfa-Aesar	H63859	Solid powder
BL21(DE3)	Merck Novagen	69450	E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin	Machery Nagel	Protino	Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH	this study		same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT	this study		pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid	gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)		plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate	Sigma-Aldrich	460923	Liquid
Sonicator	Thermo Fisher	FB120-220