ワクチン用非天然アミノ酸組み合わせとクリック化学を組み合わせた均質なグリココンジュゲート

要約

遺伝的コード拡張は、定義された部位のキャリアタンパク質に対角関数群を持つ非天然アミノ酸の導入に適用される。この二元性機能は、均質なグリココンジュゲートワクチンを提供するために、炭水化物抗原の部位選択的結合に対してさらに使用される。

要約

遺伝子コードの拡張は、非天然アミノ酸(UAA)をタンパク質に導入してその特性を改変したり、新しいタンパク質機能を研究または作成したり、タンパク質コンジュゲートにアクセスしたりするための強力なツールです。停止コドン抑制、特にアンバーコドン抑制は、定義された位置でUAAを遺伝的に導入する最も一般的な方法として出現した。この方法論は、本明細書において、生体直交性官能基を収容するUAAを含む担体タンパク質の調製に適用される。この反応性ハンドルは、次に、合成オリゴ糖ハプテンを特異的かつ効率的に移植し、均質なグリココンジュゲートワクチンを提供するために使用することができる。このプロトコルは、1:1炭水化物ハプテン/キャリアタンパク質比におけるグリココンジュゲートの合成に限定されるが、多数の二元性官能基のペアに適している。グリココンジュゲートワクチンの均質性は、完全な物理化学的特徴付けを確実にする重要な基準であり、それにより、より厳しい薬物規制機関の勧告を満たし、古典的な共役戦略によって満たされていない基準である。さらに、このプロトコルは、実際のコンジュゲートワクチンの構造を細かく調整することを可能にし、構造と免疫原性の関係に対処するためのツールを生み出す。

概要

グリココンジュゲートワクチンは、感染症の予防治療に利用できるワクチンの必要不可欠な要素です。彼らは、若い幼児を含む広範な年齢層で安全で、十分に許容され、効率的です。それらは、髄膜炎球菌、肺炎球菌またはインフルエンザ菌b^型のようなカプチオ細菌によって引き起こされる感染症に対する最適な防御を提供する。グリココンジュゲートワクチンは、これらの表面発現多糖を模倣する細菌または合成オリゴ糖のカプセルを形成する精製された細菌多糖類^から作られており、これはキャリアタンパク質に共有結合しています。キャリアタンパク質の存在は、炭水化物抗原³によって発現される抗原決定基に対する保護的な体液性免疫応答を促進するために不可欠である。糖質抗原の慎重な選択および産生とは別に、糖コンジュゲートワクチンの有効性に影響を及ぼすのが知られている特徴は、キャリアタンパク質の性質、結合化学(使用する場合はリンカーの性質および長さを含む)、または糖類/タンパク質比³である。明らかに、糖類がタンパク質に結合する位置と接続ポイントの数は免疫原性に関連しています。現在までに、これらの2つのパラメータは、グリココンジュゲートの調製が主に経験的なままであるため、ほとんど研究されていません。これらの合成は、通常、それぞれ、リジンまたはアスパラギン酸/グルタミン酸の機能の使用に依存する、キャリアタンパク質配列上に存在する。これは単一ではなく、グリココンジュゲートの異種混合物につながります。

タンパク質中のアミノ酸残基の反応性、入手可能性または分布に関する遊びは、糖類/タンパク質結合性の効果を文書化するためにより信頼性の高い、より定義された糖コンジュゲートを生じさせる^4。この目標に向けた一歩は、細胞工場^5,6における制御されたグリコジュゲートワクチンの製造を可能にする組換えプロセスであるタンパク質グリカンカップリング技術^を適用することによって達成することができる。しかし、グリコシル化は、D/EXNYS/Tセクオン内のアスパラギン残基(Xは20種類の天然アミノ酸のうち任意である)でのみ行われ、キャリアタンパク質には自然に存在しません。

選択的突然変異誘発、特にシステインを組み込んで高度かつ選択的な反応性を利用する部位は、代替^7,8として出現する。UAAを配列に組み込んだキャリアタンパク質の製造は、均質なグリココンジュゲートワクチン調製に対してさらに柔軟性を提供することができます。100以上のUAAが開発され、さらに様々なタンパク質^9、10に組み込まれています。それらの多くは、翻訳後修飾¹¹を行うために通常使用される生体直交機能を含むか、生物物理学的プローブ¹²または薬物¹³を移植するが、炭水化物抗原とのさらなる結合のための理想的なハンドルである。成功例は、無細胞タンパク質合成¹⁵を用いてBiotech¹⁴によって主張されているが、この戦略に従うグリココンジュゲートワクチンの調製は依然として普及するのを待っている。

変異キャリアタンパク質の産生のためのin vivo戦略の適用には、特定のコドン、コドンを認識するtRNA、およびtRNA上のUAAの伝達を特異的に触媒するアミノアシルtRNA合成酵素(aaRS)を含む改変翻訳機械が必要である(図1)^16。ピロリシンアンバーストップコドン抑制は、UAA、特にプロピルジルリジン(PrK)17を組み込むために最も広く使用される方法の^一つである。後者は、アジド機能化炭水化物ハプテンと反応して、完全に定義された均質なグリココンジュゲートを提供することができます。本稿では、アルキンハンドルを持つUAAであるプロパルギルL-リジンを合成する方法、細菌中での翻訳中に標的タンパク質に組み込む方法、そして最後に、修飾タンパク質と、クリックケミストリーを用いたアジド関数を担うハプテンとの結合を行う方法について述べています。

プロトコル

1. UAAの合成:プロパジルリジン(PrK)

1. ^{N α}の合成 -ボック-プロピルジル-リジン¹⁸
   1. 水性1M NaOH(5mL)とTHF(5mL)をフラスコに混合して500mgのボック-L-Lys-OH(2.03ミリモル)を溶かし、フラスコにシリコン中隔を合わせます。
   2. 氷浴でフラスコを冷やし、攪拌しながらマイクロシリンジを使用して158 μLのプロパーギルクロロホルメート(1.62 mmol)ドロップワイズ(2〜3分)を加えます。
   3. 反応混合物を室温まで温め、10時間撹拌を続ける。
   4. 50 mLのジエチルエーテル、水性1M塩酸50mL、氷浴中の酢酸エチル60 mLの冷却液。
   5. 粗反応混合物を氷浴で冷却し、混合物を分離漏斗に注ぎます。50 mLのジエチルエーテルで混合物を抽出する。有機層を破棄します。
   6. 分離漏斗の水相に1M塩酸水を慎重に添加する。次に、酢酸エチル30mLを用いて水層を2回抽出する。LLCを溶出物として_CH2Cl2-メタノール(9:1)を用いて有機相におけるN-Boc-プロピルジルリジンの存在を確認する。
   7. 結合した有機層をMgSO₄上で乾燥させ、固相を濾過し、回転エバポレーターに減圧で濾過液を濃縮する。
   8. 粗油性N α-Boc-プロピルジルリジンのサンプルを重水素クロロホルム(CDCl3)に溶解し、その同一性を^1HNMRで制御する。
      注意:抽出は圧力の蓄積をもたらす可能性があります。圧力の蓄積を頻繁に解放する。
2. 非天然アミノ酸プロパージル-L-リジンの合成 (PrK)
   1. 中隔を備えた丸底フラスコにN α-Boc-プロパギルリジンを導入する。
   2. アルゴンのフラスコに4mLの無水ジクロロメタン_(CH2Cl2)を加えて^{N α-Boc-}プロパーギルリジンを溶解する。
   3. 4 mLのトリフルオロ酢酸(TFA)を攪拌しながら注射器を使用して滴下します。
   4. RTで1時間反応混合物を攪拌し、溶出物として_CH2Cl2-メタノール(9:1)を使用してTLCによる反応を監視する。
   5. 反応混合物を減圧下で濃縮する。
   6. ジエチルエーテルを粗残渣に加え、4°Cで1時間インキュベートしてPrKを沈殿させます。より高いスケールで作業する場合、PrKが完全に沈殿していない場合は、それを沈殿させ、必要に応じてインキュベーション時間を延長する。
   7. フリットガラスの白い固体の形でPrKをフィルターします。
   8. D2 OでPrKのアリコートを溶解する。その後、NMR分析を行い、そのアイデンティティと純度を制御します。
   9. さらに使用するために、蒸留水中の不天然アミノ酸PrKを100mMの最終濃度で溶解し、1mLアリコートとして-20°Cで保存する。

2. PrKによって修飾された組換えタンパク質の製造

1. プラスミド製剤
   1. 標的成熟性肺炎球菌表面接着A(mPsaA)遺伝子を含む発現プラスミド(pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHHHH)を構築する(pPAA)遺伝子(p ET24d-mPsaA-WT)に続いて、pET24dプラスミドの BamHI および XhoI 制限部位の間に挿入物をクローニングすることにより、たばこエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ配列が続いた。これは、タンパク質のC末語でHis₆ タグを導入します。リジン-32のコドンをアンバーコドン(TAG)に置き換え、従来の部位特異的突然変異誘発技術を使用する。
   2. 第2の発現プラスミド(pEVOL-MmPylRS)を構築し、前^{に述べたように、}メタノサルシナ・マゼジ(MmPylRS)からピロリシル-tRNA合成酵素をコードする遺伝子の2つのコピーを含む。UAA の効率的な組み込みのために、この特別に設計されたプラスミド ベクター pEVOL を使用します。
      注: 詳細なプラスミド情報は 補足ファイル 1で説明されています。
2. 発現株へのプラスミドの共変
   1. 化学的に有能な エシェリヒア・コリ BL21(DE3)の100 μLアリコートを氷上で5分間解凍します。
   2. 各プラスミド(各50〜100 ng)の1μLを細胞に加え、氷上で30分間インキュベートします。
   3. 解凍したコンピテントセルを42°Cのインキュベーターで45mの間、1.5 mLマイクロチューブに移し、2分間氷に戻します。
   4. LB培地900μLを加え、37°Cで1時間振るためてインキュベートし、抗生物質の発現を可能にします。その後、25 μg/mLのカナマイシンとクロラムフェニコール 30 μg/mL で、細菌を LB 寒天にプレートします。37°Cで一晩細菌の増殖を可能にする。
3. PrKで修飾されたタンパク質の発現
   1. 抗生物質(25 μg/mLのカナマイシンおよびクロラムフェニコールの30 μg/mL)を用いてLB培地5 mLで単一の共形化コロニーを接種する。37°Cで一晩、振盪を行ってインキュベートする。
   2. 一次培養液(5mL)を抗生物質を含む自動誘導培地500mL、L-アラビノースの0.02%、非天然アミノ酸PrKの1mMに希釈し、37°Cで24時間振るとインキュベートします。は、PrKを伴わない培養を平行に行うことにより陰性対照を含み、かつ、wtタンパク質を含むクローンの培養を行うことにより陽性対照を行う。
   3. アリコート 5 mL の培養培地と遠心分離機 5,000 x gで 10 分間 .上清を捨て、ペレットを-20°Cで凍らせます。 残りの495 mLから5,000 x gで10分間遠心分離して細胞を収穫する。上清を捨て、ペレットを-20°Cで凍らせます。
4. SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析による5mL培養サンプルからの粗細胞抽出物の分析
   1. 5 mLの細胞ペレットを250 μLのリシスバッファー(50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO 4、150 mM NaCl、pH 8、5 mM イミダゾール、0.2 mM PMSF)に再懸濁し、1.5 mL マイクロチューブに移します。
   2. 液体窒素でチューブを凍結し、42°C浴中で解凍し、30sの高速で渦を流して細胞をライスする。この手順を 3 回繰り返します。
   3. 遠心分離機サンプルは17,000 x g で10分間、細胞の破片を除去します。
   4. 上清の10 μLを取り、5 μLの水と5 μLの負荷バッファー(ブロモフェノールブルー、SDS、βメルカプトエタノール)を加えます。サンプルを100°Cで5分間加熱し、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を行います。
5. ニッケルNTAビーズを用いた重力フローベンチアフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製
   1. 細胞ペレット(495 mL培養から)を20 mLのリシスバッファー(50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO 4、150 mM NaCl、pH 8、5 mM イミダゾール、0.2 mM PMSF)に再懸濁します。
   2. DNase I(1 mg/mL)5 μL(1 mg/mL)と500 μLのリソザイム(50 mg/mL)を懸濁液に加え、30分間に37°Cで懸濁液をインキュベートしてリシスを可能にします。
   3. 5分(5 s-5 sのサイクル、振幅50%)の間に細胞を超音波処理するそして、30分間の20,000 x g で遠心分離によって細胞の破片を取り除き、その後0.45 μmフィルターでろ過します。
   4. サスペンションにNi-NTA樹脂(500mLの細胞培養用500μL)を加え、4°Cで1時間軽く混ぜます。
   5. ポリプロピレンカラムに懸濁液を注ぎ、非結合分画を収集します。
   6. 樹脂を洗浄バッファーの 10 mL 50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO 4、150 mM NaCl、10 mM イミダゾールを含む洗浄バッファーで洗浄します。洗浄バッファー(50 mM Na₂HPO 4 /NaH₂PO_4、150mM NaCl、20 mM イミダゾール)で2回目の洗浄を行います。洗浄画分を収集します。
   7. 溶出バッファーの 1 mL でタグ付きタンパク質をエルテ (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO_4,150 mM NaCl, 300 mM イミダゾール).このステップを4回繰り返し、すべての溶出分数を収集します。
   8. 粗なライセートと、12%アクリルアミドゲル上のSDS-PAGEによる7つの精製分率を分析します。
   9. 純粋なHisタグ付きタンパク質を含む分数を組み合わせ、透析膜(カットオフMW 6000-8000 Da)を使用して、TEVプロテアーゼバッファー(50 mM Tris-HCl、0.5 mM EDTA、pH 8)の1 Lに対して透析します。280 nmのタンパク質濃度を、モルの吸光係数37 360 cm^-1の M -1、mPsaA の分子量 34.14 kDa で測定します。

3. TEVプロテアーゼ消化によるヒスチジンタグの除去

1. タンパク質サンプルを50 mLチューブに集め、2mg/mLの濃度で最大1 mLのTEVバッファー(50 mMトリスHCl、0.5 mM EDTA、pH8)を加えます。
   注: 濃度は以前の結果によって異なる場合があります。我々がテストしたタンパク質濃度は典型的な2-3 mg/mLの範囲にある。
2. TEVプロテアーゼを100μL加えます(TEVプロテアーゼ10単位を含む1μLを加え、20μgのタンパク質を消化します)。
3. 0.1 Mジチオスレイトール(DTT)の50 μLを加えます。
4. TEV バッファー (50 mM トリス HCl、0.5 mM EDTA、pH 8) を 5 mL まで完備。
5. ゆっくりと揺れで4°Cで一晩インキュベートします。
   注:消化が完了しない場合は、TEVプロテアーゼを追加し、より長い時間または30°Cまでの高温でインキュベートしてください。
6. 消化されたタンパク質を透析して、リン酸緩衝液(50 mM Na₂HPO 4/NaH_2PO4、150mM NaCl、5 mMイミダゾール)に対して透析膜(カットオフ6000-8000 Da)を使用して、一晩で4°CでEDTAを除去します。
7. TEVプロテアーゼと未消化タンパク質を排除するには、Ni-NTAビーズと混合をインキュベートし、4°Cで1時間軽く混ぜます。
8. 懸濁液をポリプロピレンカラムに注ぎます。非結合分数を収集し、洗浄バッファーの5 mLでカラムを洗浄する(50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO 4、150 mM NaCl、10 mMイミダゾール)
   注:関心のあるタンパク質は、束縛されていない部分と洗浄分数で回収する必要があります。
9. 5 mLの溶出バッファー(50 mM Na₂HPO 4 /NaH₂PO_4、150mM NaCl、300 mM イミダゾール)をカラムに加えてTEVプロテアーゼと未消化タンパク質をエルプします。280 nmでのタンパク質の内容物の分数とSDS-PAGE分析で確認してください。
10. 消化されたサンプルを未消化タンパク質をコントロールとして SDS PAGE にロードして、消化の効率を確認します。
11. 消化したタンパク質を1 Lのクリックバッファー(50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO 4,pH8)で透析膜(カットオフ6000-8000 Da)で一晩4°Cで消化したタンパク質に透析し、バッファーを交換するだけでなく、 mPsaAのモル消光係数と分子量を有する280 nmのタンパク質濃度を測定します(37 360 cm^-1のM-1およびMW 34.14 kDa)。

4. 非天然アミノ酸プロピルジルリジンのアクセシビリティとクリック化学機能の評価

注:6ヘキサクロロフルオレセインアジドとmpPsaAを結合する、プレソルスキーら²⁰ で説明したプロトコルをクリック化学のために使用して。

1. 57.8 μMの濃度でPrK変異タンパク質を432.5 μLに取り込み、2 mLマイクロチューブに取り込みます。
   注意:アルキンの最低濃度は2μMで許容されます。タンパク質濃度が低い場合は、遠心濃縮器で濃縮するか、アジド/アルキンモル比を増加させることによって反応のバランスを優先します。
2. 5 mM 6-六角クロロ-フルオロセインアジドの10 μLを加え、20 mMで2.5 μLの CuSO₄ 溶液を、トリス(ベンジルトリアゾリルメチル)アミン(THPTA)の7.5 μLに50 mM(ストック液濃度)でプレミックスします。
   1. 水性100mMのアミノグアニジン塩酸塩を25μL加えます。
   2. 20 mg/mL の 25 μL を、アスコルビン酸ナトリウムの水溶液を調製した25 mg/mL を加えます。
   3. チューブを閉じ、数回反転して混ぜ、室温で2時間インキュベートします。
   4. 0.5 M EDTAの50 μLを加えて反応を止めてください。
   5. 反応混合物を15μLとし、マイクロチューブに入れ、5μLのローディングバッファー(ブロモフェノールブルー、SDS、βメルカプトエタノール)を加え、100°Cで5分間加熱し、12%アクリルアミドゲルに浸します。移動後、312 nmのUV光下でゲル上の蛍光コンジュゲートを可視化します。

5. アジド機能化炭水化物抗原(Pn14TS-N₃₎によるmPsaAの結合

1. 結合
   1. PrK変異タンパク質432.5 μLを57.8 μMで2 mLマイクロチューブに取り込む。
   2. 水に5 mM Pn14TS-N-N₂₁の10 μLを加え、20 mMで2.5 μLのCuSO₄溶液を、THPTAの7.5 μLで50mMでプレミックスします。
      注:Pn14TS-N3の合成は、肺炎球菌血清型14を模倣した四糖を表す多糖類を参照21に記載されている。理論的には、アジド機能を含む任意の炭水化物抗原が使用できる。
   3. 25 μLの100 mMアミノグアニジン塩酸塩を加えます。
   4. 25 μLの20 mg/mLを加えて、アスコルビン酸ナトリウムの水溶液を繰り返し調製した。
   5. チューブを閉じ、数回反転して混ぜ、2時間の間にRTでインキュベートする。
   6. 0.5 M EDTAの50 μLを加えて反応を止めてください。
   7. 15 μLのサンプルを取り、SDS-PAGE で分析します。
2. グリココンジュゲートのゲル濾過精製
   1. グリココンジュゲートを立体排除アガロースカラム(15 x 600床寸法、3,000-70,000分画範囲)に塗布し、100mM PBSバッファーで平衡化し、pH 7.3を0.8 mL/分流で280nmで検出します。
   2. グリココンジュゲートを含む分画を収集する。
      注:長期保存のために、グリコジュゲートを1 Lに対して2時間2回、透析膜(カットオフMw 6000-8000 Da)を使用して4°Cで一晩で透析し、次いで凍結乾燥し、糖コンジュゲートを-80°Cに保存します。

結果

本プロジェクトでは、アンバーストップコドン抑制戦略を用いて均質なグリコジュゲートワクチンを作成し、定義された部位でUAAを導入した(図1)。気球状表面接着Aは、キャリアタンパク質部分として選択した。このタンパク質は高度に保存され、肺炎球菌²²のすべての株によって発現される。それは免疫原性が高く、以?...

ディスカッション

部位特異的変異誘発は、グリココンジュゲートワクチン^7、8、14を調製することを目的としてほとんど使用されていないタンパク質の定義された位置に特定のアミノ酸を組み込むための簡単な戦略である。20の天然アミノ酸アプローチに基づく古典的な変異生成は翻訳機械の変更が要求されないので非常に効率的である。シ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AIM (autoinductif medium)	Formedium	AIMLB0210	Solid powder
Boc-Lys-OH	Alfa-Aesar	H63859	Solid powder
BL21(DE3)	Merck Novagen	69450	E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin	Machery Nagel	Protino	Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH	this study		same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT	this study		pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid	gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)		plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate	Sigma-Aldrich	460923	Liquid
Sonicator	Thermo Fisher	FB120-220