JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הרחבת קוד גנטי מוחלת על הקדמה של חומצת אמינו לא טבעית הנושאת קבוצה פונקציונלית ביורטוגונלית על חלבון נשא באתר מוגדר. הפונקציה biorthogonal משמש עוד יותר עבור צימוד סלקטיבי האתר של אנטיגן פחמימות כדי לספק חיסון גליקוקוג'וג'וגייט הומוגני.

Abstract

הרחבת קוד גנטי היא כלי רב עוצמה כדי להכניס חומצות אמינו לא טבעיות (כטב"מים) לתוך חלבונים כדי לשנות את המאפיינים שלהם, ללמוד או ליצור פונקציות חלבון חדשות או יש גישה ליחידות חלבון. להפסיק דיכוי קודון, במיוחד דיכוי codon ענבר, התגלה כשיטה הפופולרית ביותר להציג גנטית UAAs בעמדות מוגדרות. מתודולוגיה זו מיושמת בזאת על הכנת חלבון נשא המכיל UAA מחסה קבוצה פונקציונלית bioorthogonal. ידית תגובתית זו יכולה לשמש לאחר מכן כדי להשתיל באופן ספציפי ויעיל אוליגוסכריד hapten סינתטי כדי לספק חיסון גליקוקוג'וג'גייט הומוגני. הפרוטוקול מוגבל לסינתזה של גליקוקוגייטים ביחס חלבון 1:1 פחמימות/נשא, אך ניתן לחוות זוגות רבים של קבוצות תפקודיות ביו-לוגוניות. הומוגניות חיסון Glycocococonjugate הוא קריטריון חשוב כדי להבטיח אפיון פיזיקו-כימי מלא, ובכך, סיפוק יותר ויותר תובעני יותר המלצות הסוכנות הרגולטורית סמים, קריטריון אשר לא נענה על ידי אסטרטגיות התייחדות קלאסיות. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר לכוונן היטב את המבנה של החיסון ההתייחדות בפועל, מה שמוליך כלים לטיפול ביחסים בין מבנה לחיסונים.

Introduction

חיסוני גליקוקו-קו-גייט הם מרכיבים חיוניים של ארסנל החיסון הזמין לטיפול מונע במחלות זיהומיות. הם בטוחים, נסבלים היטב ויעילים בקבוצת גיל רחבה כולל תינוקות צעירים. הם מספקים את ההגנה האופטימלית מפני זיהומים הנגרמת על ידי חיידקים ממוססים כמו מנינגוקוקוס, פנאומוקקוס או שפעת המופילוס סוג b1. חיסוני גליקוקוקוג'וג'גייט עשויים מפוליסכרידים חיידקיים מטוהרים הקוביות של חיידקים או אוליגוסכרידים סינתטיים המחקים את הפוליסכרידיםהמבוטאים עלפני השטח 2 , המקושרים באופן קובלנטי לחלבון מוביל. הנוכחות של חלבון נשא חיוני כדי לקדם תגובות חיסוניות הומוריסטיות מגן מכוון נגד הקובע האנטיגני שהביע אנטיגנים פחמימות3. מלבד בחירה קפדנית וייצור של אנטיגן פחמימות, התכונות ידועות להפעיל השפעה על היעילות של חיסון גליקוקונג'וגייט הם: טבעו של חלבון המוביל, הכימיה ההתייחדות (כולל אופי ואורך המקשר אם נעשה שימוש), או יחס saccharide / חלבון3. מן הסתם, התנוחות שבהן ה-saccharide מודבק לחלבון, כמו גם מספר נקודות הקישוריות רלוונטיות לחיסונים. עד כה, שני פרמטרים אלה כמעט ולא נחקרו כי הכנת גליקוקוגייטים נשאר בעיקר אמפירי. הסינתזה שלהם מסתמכת בדרך כלל על השימוש בפונקציות חומצה קרבוקסילית או קארבוקסילית של, בהתאמה, ליזאין או אספרטית / גלוטמית חומצה בצד שרשרת שאריות הנוכחי על רצף חלבון המוביל. זה מוביל לא לתערובת הטרוגנית של גליקוקו-ג'וגייט.

משחק על תגובתיות, נגישות או התפלגות של שאריות חומצת אמינו בחלבון יוצר גליקוקוגטים מוגדרים יותר כי הם אמינים יותר לתעד את ההשפעה של קישוריות saccharide / חלבון4. צעד קדימה לקראת מטרה זו ניתן להשיג על ידי יישום טכנולוגיית צימוד גליקן חלבון, תהליך רקומביננטי המאפשר ייצור של חיסונים גליקוגט מבוקר במפעלי תאים5,6. עם זאת, גליקוסילציה מתרחשת באופן בלעדי במשקעים אספראג'ין בתוך D / EXNYS / T sequons (לפיה X הוא כל מתוך 20 חומצות אמינו טבעיות), לא קיים באופן טבעי על חלבוני המוביל.

אתר מוטגנזה סלקטיבית ובמיוחד התאגדות של ציסטאין כדי לנצל את תגובתיותם מאוד סלקטיבית מופיעהכאלטרנטיבה 7,8. ייצור חלבוני נשא המשלבים כטב"מים ברצף שלהם יכול להציע גמישות רבה עוד יותר להכנת חיסון גליקו-conjugate הומוגני. יותר מ 100 כטב"מים פותחו ושילבו עוד יותר חלבוניםשונים 9,10. רבים מהם מכילים פונקציות bioorthogonal משמש בדרך כלל לבצע שינוייםתרגום פוסט 11 או להשתיל בדיקותביופיזיות 12 או תרופות 13 אבל שהם ידיות אידיאליות להתייחדות נוספת עם אנטיגנים פחמימות. דוגמאות מוצלחות כבר טענו על ידי ביוטכנולוגיה14 באמצעות סינתזת חלבון ללאתאים 15 אבל הכנת חיסונים גליקוגייט על פי אסטרטגיה זו עדיין מחכה להיות פופולרי.

יישום של אסטרטגיית vivo לייצור של חלבון נשא מוטציה צריך מכונות תרגום שונה הכולל codon ספציפי, tRNA זיהוי קודון סינתזה אמינואציל-tRNA (aaRS) אשר במיוחד מקטע את העברת UAA על tRNA (איור 1)16. דיכוי הענבר pyrrolysine להפסיק קודון היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לשלב UAA, במיוחד propargyl-ליסין (PrK)17. האחרון יכול בתורו להגיב עם הפטנים פחמימות פונקציונליאזידו לספק מוגדר באופן מלא, גליקוגטים הומוגניים. בכתב היד הנוכחי אנו מתארים כיצד לסנתז את propargyl-L-ליסין, UAA נושא ידית alkyne, איך לשלב אותו לתוך חלבון היעד במהלך התרגום שלה בחיידק ולבסוף איך לבצע התייחדות בין החלבון שונה hapten נושא פונקציה אזיד באמצעות כימיה לחץ.

Protocol

1. סינתזה של UAA: פרופארג'י-לייסין (PrK)

  1. סינתזה של Nα-Boc-propargyl-ליסין18
    1. להמיס 500 מ"ג של Boc-L-Lys-OH (2.03 mmol) בתערובת של מים 1 M NaOH (5 מ"ל) ו THF (5 מ"ל) במבחנות ולה להתאים את הבקבוקון עם מחיצה סיליקון.
    2. מצננים את הבקבוקון באמבט קרח ולאחר מכן מוסיפים 158 μL של פרופארג'י כלורופורם (1.62 מ"מ) תוך כדי ערבוב.
    3. מחממים את תערובת התגובה לטמפרטורת החדר וממשיכים לערבב במשך 10 שעות.
    4. לקרר פתרונות של 50 מ"ל של אתר diethyl, 50 מ"ל של חומצה הידרוכלורית 1 M מים ו 60 מ"ל של אצטט אתיל באמבט קרח.
    5. מצננים את תערובת התגובה הגולמית באמבט קרח ויוצקים את התערובת למשפך הפרדה. לחלץ את התערובת עם 50 מ"ל של אתר diethyl. השליכו את השכבה האורגנית.
    6. בזהירות להוסיף חומצה הידרוכלורית 1 M מים לשלב המים במשפך ההפרדה. לאחר מכן לחלץ את השכבה המכך פעמיים באמצעות 30 מ"ל של אצטט אתיל. ודא את הנוכחות של N-Boc-propargyl-ליסין בשלב האורגני על ידי TLC באמצעות CH2Cl2-מתנול (9:1) כמו eluent.
    7. יבשו את השכבות האורגניות המשולבות מעל MgSO 4 ,מסנניםאת השלב המוצק ומרכזים את הסינון תחת לחץ מופחת על אידוי סיבובי.
    8. להמיס מדגם של הנפט הגולמי Nα-Boc-propargyl-ליסין בכלורופורם deuterated (CDCl3) ולשלוטבזהותו על ידי 1H NMR.
      התראה: החילוץ עלול לגרום להצטברות של לחץ. לשחרר כל הצטברות לחץ לעתים קרובות.
  2. סינתזה של חומצת אמינו לא טבעית propargyl-L-לייסין (PrK)
    1. הציגו α-Boc-propargyl-ליציןבמבחנות תחתית עגולה המצוידת במחיצת החלקה.
    2. להוסיף 4 מ"ל של דיכלורומטאן anhydrous (CH2Cl2)לבקבוקון תחת ארגון כדי להמיסאת N α-Boc-propargyl-ליצין.
    3. להוסיף 4 מ"ל של חומצה trifluoroacetic (TFA) dropwise באמצעות מזרק תוך כדי ערבוב.
    4. מערבבים את תערובת התגובה במשך שעה אחת ב RT. לפקח על התגובה על ידי TLC באמצעות CH2Cl2-מתנול (9:1) כמו eluent.
    5. לרכז את תערובת התגובה תחת לחץ מופחת.
    6. הוסף אתר diethyl למשקע הגולמי ותדגרה אותו ב 4 ° C עבור 1 שעות כדי לזרז את PrK. בעת עבודה בקנה מידה גבוה יותר, אם PrK אינו מזרז לחלוטין, triturate כדי לזרז אותו ולהאריך את זמן הדגירה במידת הצורך.
    7. מסננים את ה-PRK בצורה של מוצק לבן על מנוצת.
    8. לפזר את האליקוט של PRK ב D2O. לאחר מכן לבצע ניתוחי NMR כדי לשלוט בזהותו ובטוהרה.
    9. לשימוש נוסף, להמיס את חומצת אמינו לא טבעי PrK במים מזוקקים בריכוז סופי של 100 mM ולאחסן ב -20 ° C כמו 1 מ"ל aliquots.

2. ייצור החלבון רקומביננטי שונה על ידי PrK

  1. הכנת פלסמיד
    1. לבנות ביטוי פלסמיד (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH) המכיל את היעד בוגר פנאומוקוקוק משטח דבק A (mPsaA) גן (mPsaA) (pET24d-mPsaA-WT) ואחריו רצף protease וירוס Etch טבק (TEV) על ידי שיבוט ההוספה בין BamHI ואתרי הגבלת XhoI של pET24d plasmid. זה יציג את תג6 שלו ב C-terminus של החלבון. החלף את קודון ליסין-32 בענבר קודון (TAG), תוך שימוש בטכניקה קונבנציונלית של מוטגנזה בבימוי האתר.
    2. לבנות ביטוי שני plasmid (pEVOL-MmPylRS) המכיל שני עותקים של קידוד הגן עבור סינתזה pyrrolysyl-tRNA מ Methanosarcina mazei (MmPylRS) ואת קידוד הגן עבור tRNAPyr המתאים כפי שתוארקודם לכן 19. השתמש בווקטור פלסמיד שתוכנן במיוחד, pEVOL, לשילוב יעיל של כטב"מים.
      הערה: מידע plasmids מפורט מתואר בקובץ משלים 1.
  2. טרנספורמציה של פלסמידים לזן הביטוי
    1. להפשיר 100 μL aliquot של Escherichia כשיר כימית קולי BL21 (DE3) על קרח במשך 5 דקות.
    2. מוסיפים 1 μL של כל פלסמיד (50-100 ng של כל אחד) לתוך התאים דגירה במשך 30 דקות על קרח.
    3. להעביר את microtube 1.5 מ"ל עם תאים מוסמכים הפשיר באינקובטור ב 42 ° C עבור 45 s ולאחר מכן להעביר אותו בחזרה לקרח במשך 2 דקות.
    4. להוסיף 900 μL של LB בינוני דגירה תחת רועד במשך 1 שעה ב 37 ° C כדי לאפשר ביטוי אנטיביוטי. ואז לצלחת החיידקים על LB אגר עם 25 μg / מ"ל של kanamycin ו 30 μg / מ"ל של כלוראמפניקול. לאפשר צמיחת חיידקים בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
  3. ביטוי של חלבונים ששונו עם PrK
    1. לחסן מושבה אחת ב-5 מ"ל של LB בינוני עם אנטיביוטיקה (25 μg/mL של kanamycin ו 30 μg/ mL של כלוראמפניקול). דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות.
    2. לדלל את התרבות העיקרית (5 מ"ל) לתוך 500 מ"ל של מדיום אינדוקציה אוטומטית המכיל אנטיביוטיקה, 0.02% של L-arabinose ו 1 mM של חומצת אמינו לא טבעי PrK דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות עם טלטול. כלול שליטה שלילית על ידי ביצוע התרבות ללא PrK במקביל ושליטה חיובית על ידי ביצוע התרבות של שיבוט המכיל את החלבון wt.
    3. Aliquot 5 מ"ל מתוך 500 mL תרבות בינונית צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 5,000 x g. השליכו את הסופרנטנט והקפיאו את הכדור ב-20 מעלות צלזיוס. תאי קציר מ 495 מ"ל הנותרים על ידי צנטריפוגציה במשך 10 דקות ב 5,000 x g. השליכו את הסופרנטנט והקפיאו את הכדור ב-20 מעלות צלזיוס.
  4. נתח תמציות תאים גולמיים מדגימות תרבות 5 מ"ל על-ידי SDS-PAGE וניתוח כתם מערבי
    1. Resuspend 5 מ"ל כדורי תא לתוך 250 μL של מאגר lysis (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0.2 mM PMSF) ולהעביר אותו לתוך microtube 1.5 מ"ל.
    2. תאי Lyse על ידי הקפאת הצינורות בחנקן נוזלי, הפשרתם באמבט 42 מעלות צלזיוס ומערבולת במהירות גבוהה במשך 30 שניות. חזור על שלב זה 3 פעמים.
    3. דגימות צנטריפוגה ב 17,000 x g עבור 10 דקות כדי לחסל פסולת תא.
    4. קח 10 μL של supernatant ולהוסיף 5 μL של מים ו 5 μL של מאגר טעינה (ברומונול כחול, SDS, β-mercaptoethanol). מחממים את הדגימות למשך 5 דקות ב-100 מעלות צלזיוס ומבצעים ניתוחי SDS-PAGE ו-Western Blot.
  5. טיהור חלבונים על ידי כרומטוגרפיה של זיקה בספסל זרימת הכבידה באמצעות חרוזי ניקל-NTA
    1. תולה מחדש את כדורי התא (מתרבות 495 מ"ל) ל-20 מ"ל של מאגר ליסיס (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0.2 mM PMSF).
    2. להוסיף 5 μL של DNase I (1 מ"ג / מ"ל) ו 500 μL של ליזוזים (50 מ"ג / מ"ל) לתוך המתלים ולאפשר lysis על ידי דגירה ב 37 ° C במהלך 30 דקות.
    3. Sonicate התאים במהלך 5 דקות (מחזורים של 5 s-5 s, משרעת 50%) ולאחר מכן להסיר את פסולת התא על ידי צנטריפוגציה ב 20,000 x g עבור 30 דקות ואחריו סינון על 0.45 μm מסנן.
    4. הוסף שרף Ni-NTA להשעיה (500 μL עבור 500 מ"ל של תרבות התא) ולערבב בעדינות ב 4 ° C עבור 1 שעה.
    5. יוצקים את המתלים לעמודת פוליפרופילן ואספו את השבר הלא מאוגד.
    6. לשטוף את השף עם 10 מ"ל של מאגר כביסה המכיל 50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4,150 mM NaCl, 10 mm imidazole. לשטוף את השף בפעם השנייה עם 5 מ"ל של מאגר כביסה (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4,150 mM NaCl, 20 mM imidazole). לאסוף את שברים לשטוף.
    7. להגביר את החלבון מתויג שלו עם 1 מ"ל של מאגר חוגר אלגנטיות (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4,150 mM NaCl, 300 mM imidazole). חזור על שלב זה 4 פעמים ולאסוף את כל השברים ההתכלה.
    8. נתחו את הליוס הגולמי, כמו גם את 7 שברי הטיהור על ידי SDS-PAGE על ג'ל אקרילאמיד של 12%.
    9. שלב את השברים המכילים חלבון מתויג טהור שלו דיאליזה אותו מול 1 L של מאגר protease TEV (50 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8) לילה באמצעות קרום דיאליזה (חיתוך MW 6000-8000 Da). למדוד את ריכוז החלבון ב 280 nm עם מקדם הכחדה טוחנת של 37 360 ס"מ-1∙M -1 ומשקל מולקולרי של 34.14 kDa עבור mPsaA.

3. הסרת תג היסטידין על ידי TEV עיכול פרוטאז

  1. לאסוף את דגימת החלבון לתוך צינור 50 מ"ל ולהוסיף מאגר TEV (50 mM Tris HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8) עד 1 מ"ל בריכוז של 2 מ"ג / מ"ל.
    הערה: הריכוז עשוי להשתנות בהתאם לתוצאות קודמות. ריכוזי חלבון שבדקנו נמצאים בטווח טיפוסי של 2-3 מ"ג/מ"ל.
  2. להוסיף 100 μL של Protease TEV (להוסיף 1 μL המכיל 10 יחידות של Protease TEV עבור 20 μg של חלבון לעיכול).
  3. הוסף 50 μL של 0.1 M dithiothreitol (DTT).
  4. מושלם עם מאגר TEV (50 מ', טריס HCl, 0.5 מ"מ EDTA, pH 8) עד 5 מ"ל.
  5. דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס עם רעידות איטיות.
    הערה: אם העיכול לא הושלם, הוסף פרוטאז TEV נוסף, דגירה לזמן ארוך יותר או בטמפרטורה גבוהה יותר עד 30 °C.
  6. דיאליזה החלבון המעוכל כדי להסיר EDTA ב 4 ° C לילה באמצעות קרום דיאליזה (לחתוך 6000-8000 Da) נגד מאגר פוספט (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4, 150 mM NaCl, 5 mM imidazole).
  7. כדי לחסל את פרוטאז TEV ואת החלבון הלא מעוכל, דגירה את התערובת עם חרוזי Ni-NTA ולערבב בעדינות במשך 1 שעה ב 4 ° C.
  8. יוצקים את המתלים לעמודת פוליפרופילן. לאסוף את השבר הלא מאוגד ולשטוף את העמודה עם 5 מ"ל של מאגר כביסה (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4,150 mM NaCl, 10 mM imidazole)
    הערה: יש לשחזר את החלבון של עניין בשברים הלא מאוגדים ושברים כביסה.
  9. התיז את פרוטאז TEV ואת החלבון הלא מזוקק על ידי הוספת 5 מ"ל של מאגר חוגר חומוס (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 150 mM NaCl, 300 mM imidazole) בעמודה. בדוק את השברים עבור תכולת חלבון ב 280 נארם ועל ידי ניתוח SDS-PAGE.
  10. בדוק את יעילות העיכול על-ידי טעינת דגימות מעוכלות בדף SDS עם החלבון הלא מעוכל כשליטה.
  11. דיאליזה החלבון המעוכל נגד 1 L של מאגר לחץ (50 mM Na2HPO4/ NaH2PO4, pH8) ב 4 ° C לילה עם קרום דיאליזה (לחתוך 6000-8000 Da) כדי להסיר imidazole, כמו גם להחליף את המאגר, למדוד את ריכוז החלבון ב 280 נה"מ עם מקדם הכחדה טוחנת ומשקל מולקולרי של MPsaA (37 360 ס"מ-1∙M -1 ו MW 34.14 kDa).

4. הערכה של הנגישות והפונקציונליות של חומצת אמינו לא טבעית propargyl-ליסין עבור כימיה לחץ

הערה: להזדהות עם 6-hexachloro-fluorescein-azide באמצעות הפרוטוקול המתואר על ידי פרסולסקי ואח'. 20 עבור כימיה לחץ.

  1. קח 432.5 μL של חלבון מוטציה PrK בריכוז של 57.8 μM לתוך microtube 2 מ"ל.
    הערה: ריכוז מינימלי של 2 μM של alkyne מקובל. אם ריכוז החלבון נמוך יותר, לרכז אותו עם ריכוז צנטריפוגלי או להעדיף את האיזון של התגובה על ידי הגדלת יחס אזיד / אלקין טוחנת.
  2. להוסיף 10 μL של 5 mM 6-hexachloro-פלואורסין-אזיד ולאחר מכן להוסיף premix של 2.5 μL של תמיסת CuSO4 ב 20 mM ו 7.5 μL של Tris (benzyltriazolylmethyl)אמין (THPTA) ב 50 mM (ריכוזי פתרונות מניות).
    1. להוסיף 25 μL של 100 m aminoguanidine הידרוכלוריד.
    2. להוסיף 25 μL של 20 מ"ג / מ"ל תמיסה מים מוכנה extemporaneously של נתרן ascorbate.
    3. סוגרים את הצינור, מערבבים על ידי היפוך מספר פעמים ותו לא בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות.
    4. לעצור את התגובה על ידי הוספת 50 μL של 0.5 M EDTA.
    5. קח 15 μL של תערובת התגובה ולשים אותו microtube, להוסיף 5 μL של מאגר טעינה (כחול ברומופנול, SDS, β-mercaptoethanol), לחמם את התערובת ב 100 ° C במשך 5 דקות, ולאחר מכן לטעון אותו לתוך 12% ג'ל אקרילאמיד. לאחר הנדידה, לדמיין את הפלואורסצנט להצטייד על הג'ל תחת אור UV ב 312 מילינר.

5. התייחדות של mPsaA עם אנטיגן פחמימות פונקציונלי אזידו (Pn14TS-N3)על ידי כימיה לחץ

  1. צימוד
    1. קח 432.5 μL של חלבון מוטציה PrK ב 57.8 μM לתוך 2 מ"ל microtube.
    2. להוסיף 10 μL של 5 mM Pn14TS-N321 במים ולאחר מכן להוסיף premix של 2.5 μL של פתרון CuSO4 ב 20 mM ו 7.5 μL של THPTA ב 50 mM.
      הערה: סינתזה של Pn14TS-N3, טטראסכריד המחקה את דלקת הריאות סטרפטוקוקוס 14 פוליסכריד capsular, תוארה בהתייחסות 21. תיאורטית, ניתן להשתמש בכל אנטיגן פחמימות המכיל פונקציית אזיד.
    3. להוסיף 25 μL של 100 mM אמינוגואנידין הידרוכלוריד.
    4. להוסיף 25 μL של 20 מ"ג / מ"ל מוכן extemporaneously תמיסה מים של נתרן ascorbate.
    5. סגור את הצינור, לערבב על ידי היפוך מספר פעמים דגירה ב RT במהלך 2 שעות.
    6. לעצור את התגובה על ידי הוספת 50 μL של 0.5 M EDTA.
    7. קח 15 μL של דגימות ולנתח על ידי SDS-PAGE.
  2. סינון ג'ל של גליקוקוג'וג'גייט
    1. לטהר את גליקוקו-ג'וגייט על-ידי החלתו על עמודת agarose של הדרה סטרית (15 x 600 ממדי מיטה, טווח שברים של 3,000-70,000), עם חיץ PBS של 100 מ"ר, pH 7.3 בזרימה של 0.8 מ"ל/דקה עם זיהוי במהירות של 280 00 00 00 00 00 00 00:00.
    2. אסוף את השברים המכילים את הגיקו-קו-ג'וגייט.
      הערה: עבור אחסון ממושך, דיאליזה גליקוקוג'גייט נגד 1 L של H2O פעמיים עבור 2 שעות ולאחר מכן לילה ב 4 ° C באמצעות קרום דיאליזה (לחתוך Mw 6000-8000 Da), לאחר מכן להקפיא יבש ולאחסן את גליקוקוג'וגייט ב -80 °C.

תוצאות

בפרויקט זה, הוכנה חיסון הומוגני גליקוקונג'וג'גייט באמצעות אסטרטגיית דיכוי הענבר להפסיק codon כדי להציג UAA באתר מוגדר (איור 1). דבק פני השטח Pneumoccocal A נבחר כחלבון המוביל moiety. חלבון זה הוא מאוד שמר ומובע על ידי כל הזנים של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס22.

Discussion

Mutagenesis באתר היא אסטרטגיה פשוטה לשלב חומצות אמינו ספציפיות בעמדה מוגדרת של חלבון אשר נשאר בקושי בשימוש במטרה להכין חיסונים גליקונג'וגייט7,8,14. מוטגנזה קלאסית המבוססת על 20 גישת חומצות אמינו טבעיות יעילה מאוד מאחר שלא נדרש שינוי במכונות התרג...

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

E.C. מודה בהכרת תודה על התמיכה הכספית של La Région Pays de la Loire (תוכנית פארי Scientifique "BioSynProt"), במיוחד מלגת דוקטורט ל-T.V. אנו גם מכירים ד"ר רוברט B. Quast (INRA UMR0792, CNRS UMR5504, LISBP, טולוז, צרפת) עבור ייעוץ טכני יקר שלו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AIM (autoinductif medium)FormediumAIMLB0210Solid powder
Boc-Lys-OHAlfa-AesarH63859Solid powder
BL21(DE3)Merck Novagen69450E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resinMachery NagelProtinoNi-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHHthis studysame as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WTthis studypET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmidgift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformateSigma-Aldrich460923Liquid
SonicatorThermo FisherFB120-220

References

  1. Rappuoli, R. Glycoconjugate vaccines: Principles and mechanisms. Science Translational Medicine. 10 (456), (2018).
  2. Verez-Bencomo, V., et al. A synthetic conjugate polysaccharide vaccine against Haemophilus influenzae type b. Science (New York, N.Y). 305 (5683), 522-525 (2004).
  3. Berti, F., Adamo, R. Antimicrobial glycoconjugate vaccines: an overview of classic and modern approaches for protein modification. Chemical Society Reviews. 47 (24), 9015-9025 (2018).
  4. Stefanetti, G., et al. Sugar-Protein Connectivity Impacts on the Immunogenicity of Site-Selective Salmonella O-Antigen Glycoconjugate Vaccines. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 54 (45), 13198-13203 (2015).
  5. Kay, E., Cuccui, J., Wren, B. W. Recent advances in the production of recombinant glycoconjugate vaccines. NPJ Vaccines. 4, 16 (2019).
  6. Ma, Z., Zhang, H., Wang, P. G., Liu, X. W., Chen, M. Peptide adjacent to glycosylation sites impacts immunogenicity of glycoconjugate vaccine. Oncotarget. 9 (1), 75-82 (2018).
  7. Grayson, E. J., Bernardes, G. J. L., Chalker, J. M., Boutureira, O., Koeppe, J. R., Davis, B. G. A coordinated synthesis and conjugation strategy for the preparation of homogeneous glycoconjugate vaccine candidates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 50 (18), 4127-4132 (2011).
  8. Pillot, A., et al. Site-Specific Conjugation for Fully Controlled Glycoconjugate Vaccine Preparation. Frontiers in Chemistry. , (2019).
  9. Neumann-Staubitz, P., Neumann, H. The use of unnatural amino acids to study and engineer protein function. Current Opinion in Structural Biology. 38, 119-128 (2016).
  10. Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chemical Science. 6 (1), 50-69 (2015).
  11. Chen, H., Venkat, S., McGuire, P., Gan, Q., Fan, C. Recent Development of Genetic Code Expansion for Posttranslational Modification Studies. Molecules (Basel, Switzerland). 23 (7), (2018).
  12. Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-Specifically Labeled Immunoconjugates for Molecular Imaging--Part 2: Peptide Tags and Unnatural Amino Acids. Molecular imaging and biology: MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 18 (2), 153-165 (2016).
  13. Kularatne, S. A., et al. A CXCR4-targeted site-specific antibody-drug conjugate. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 53 (44), 11863-11867 (2014).
  14. . Patent US20180333484 Polypeptide-Antigen Conjugates with Non-Natural Amino Acids Available from: https://patentscope.wipo.int/search/en/detail.jsf?docId=US233548973&recNum=65&docAn=15859251&queryString=(GBS) (2018)
  15. Quast, R. B., Mrusek, D., Hoffmeister, C., Sonnabend, A., Kubick, S. Cotranslational incorporation of non-standard amino acids using cell-free protein synthesis. FEBS letters. 589 (15), 1703-1712 (2015).
  16. Wang, L. Engineering the Genetic Code in Cells and Animals: Biological Considerations and Impacts. Accounts of Chemical Research. 50 (11), 2767-2775 (2017).
  17. Brabham, R., Fascione, M. A. Pyrrolysine Amber Stop-Codon Suppression: Development and Applications. Chembiochem: A European Journal of Chemical Biology. 18 (20), 1973-1983 (2017).
  18. . Genetic Encoding of a Non-Canonical Amino Acid for the Generation of Antibody-Drug Conjugates Through a Fast Bioorthogonal Reaction Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Genetic+Encoding+of+a+Non-Canonical+Amino+Acid+for+the+Generation+of+Antibody-Drug+Conjugates+Through+a+Fast+Bioorthogonal+Reaction (2019)
  19. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).
  20. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  21. Prasanna, M., et al. Semisynthetic glycoconjugate based on dual role protein/PsaA as a pneumococcal vaccine. European Journal of Pharmaceutical Sciences: Official Journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 129, 31-41 (2019).
  22. Morrison, K. E., et al. Confirmation of psaA in all 90 serotypes of Streptococcus pneumoniae by PCR and potential of this assay for identification and diagnosis. Journal of Clinical Microbiology. 38 (1), 434-437 (2000).
  23. Lin, H., Lin, Z., Meng, C., Huang, J., Guo, Y. Preparation and immunogenicity of capsular polysaccharide-surface adhesin A (PsaA) conjugate of Streptococcuspneumoniae. Immunobiology. 215 (7), 545-550 (2010).
  24. Safari, D., et al. Identification of the smallest structure capable of evoking opsonophagocytic antibodies against Streptococcus pneumoniae type 14. Infection and Immunity. 76 (10), 4615-4623 (2008).
  25. Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. Expanding the genetic code for biological studies. Chemistry & Biology. 16 (3), 323-336 (2009).
  26. Lawrence, M. C., Pilling, P. A., Epa, V. C., Berry, A. M., Ogunniyi, A. D., Paton, J. C. The crystal structure of pneumococcal surface antigen PsaA reveals a metal-binding site and a novel structure for a putative ABC-type binding protein. Structure (London, England: 1993). 6 (12), 1553-1561 (1998).
  27. Wright, T. H., Davis, B. G. Post-translational mutagenesis for installation of natural and unnatural amino acid side chains into recombinant proteins. Nature Protocols. 12 (10), 2243-2250 (2017).
  28. Dadová, J., Galan, S. R., Davis, B. G. Synthesis of modified proteins via functionalization of dehydroalanine. Current Opinion in Chemical Biology. 46, 71-81 (2018).
  29. Worst, E. G., et al. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. Journal of Visualized Experiments. (114), (2016).
  30. Carboni, F., et al. GBS type III oligosaccharides containing a minimal protective epitope can be turned into effective vaccines by multivalent presentation. The Journal of Infectious Diseases. , (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

166

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved