Glycoconjugate homogéneo producido por la incorporación combinada de aminoácidos antinaturales y la química de clics para fines de vacunas

Resumen

La expansión del código genético se aplica para la introducción de un aminoácido antinatural que lleva un grupo funcional biorthogonal en una proteína portadora en un sitio definido. La función biorthogonal se utiliza además para el acoplamiento selectivo del sitio de un antígeno de carbohidratos para proporcionar una vacuna de glucoconjugado homogénea.

Resumen

La expansión del código genético es una poderosa herramienta para introducir aminoácidos antinaturales (UAAs) en proteínas para modificar sus características, estudiar o crear nuevas funciones proteicas o tener acceso a conjugados proteicos. Detener la supresión del codón, en particular la supresión del codón de ámbar, ha surgido como el método más popular para introducir genéticamente uaas en posiciones definidas. Esta metodología se aplica en este documento a la preparación de una proteína portadora que contiene una UAA que alberga un grupo funcional bioortohogonal. Este mango reactivo se puede utilizar a continuación para injertar de forma específica y eficiente un hapten sintético de oligosacárido para proporcionar una vacuna de glicoconjugado homogénea. El protocolo se limita a la síntesis de glucoconjugados en una proporción de proteína de hapten/portador de carbohidratos 1:1, pero susceptible a numerosos pares de grupos funcionales biorthogonales. La homogeneidad de la vacuna glucococonjugada es un criterio importante para garantizar una caracterización fisicoquímica completa, satisfaciendo así las recomendaciones cada vez más exigentes de los organismos reguladores de medicamentos, un criterio que no se cumple con las estrategias clásicas de conjugación. Además, este protocolo permite ajustar con precisión la estructura de la vacuna conjugada real, dando lugar a herramientas para abordar las relaciones estructura-inmunogenicidad.

Introducción

Las vacunas contra el glicoconjugado son elementos esenciales del arsenal de vacunas disponible para el tratamiento profiláctico de enfermedades infecciosas. Son seguros, bien tolerados y eficientes en un amplio grupo de edad, incluidos los bebés pequeños. Proporcionan la defensa óptima contra las infecciones causadas por bacterias capsuladas como meningococo, neumococo o Haemophilus influenzae tipo b¹. Las vacunas glucococonjugate están hechas de polisacáridos bacterianos purificados que forman las cápsulas de bacterias o oligosacáridos sintéticos que imitan estos polisacáridos expresados en superficie^2,que están covalentemente vinculados a una proteína portadora. La presencia de una proteína portadora es esencial para promover respuestas inmunitarias humorales protectoras dirigidas contra el determinante antigénico expresado por los antígenos de carbohidratos^3. Aparte de una cuidadosa selección y producción del antígeno de carbohidratos, las características que se sabe que ejercen una influencia en la eficacia de una vacuna glucoconjugada son: la naturaleza de la proteína portadora, la química de conjugación (incluyendo la naturaleza y la longitud del vinculador si se utiliza), o la relación sacárido/proteína³. Obviamente, las posiciones en las que el sacárido se conjuga con la proteína, así como el número de puntos de conectividad son relevantes para la inmunogenicidad. Hasta la fecha, estos dos parámetros apenas se han estudiado porque la preparación de los glicoconjugados sigue siendo en gran medida empírica. Su síntesis generalmente se basa en el uso de funciones de amina o ácido carboxílico de, respectivamente, residuos de cadena lateral de lisina o ácido aspártico/glutámico presentes en la secuencia de proteína portadora. Esto no conduce a una sola sino a una mezcla heterogénea de glicoconjugados.

Jugar con la reactividad, accesibilidad o distribución de los residuos de aminoácidos en la proteína da lugar a glucoconjugados más definidos que son más fiables para documentar el efecto de la conectividad de sacárido/proteína⁴. Un paso adelante hacia este objetivo se puede lograr mediante la aplicación de la tecnología de acoplamiento de glicano proteico, un proceso recombinante que permite la producción de vacunas de glucoconjugado controlado en fábricas celulares^5,6. Sin embargo, la glicosilación tiene lugar exclusivamente en un residuo de asparagina dentro de las secuoyas D/EXNYS/T (en la que X es cualquiera de los 20 aminoácidos naturales), no presente naturalmente en las proteínas portadoras.

La mutagénesis selectiva del sitio y, en^particular,la incorporación de cisteínas para explotar su alta y selectiva reactividad aparece como alternativa^7,8. La producción de proteínas portadoras que incorporan UAAs en su secuencia puede ofrecer aún más flexibilidad para la preparación homogénea de vacunas con glucoconjugado. Más de 100 UAAs han sido desarrolladas e incorporadas en diversas proteínas^9,10. Muchos de ellos contienen funciones bioortohogonales generalmente utilizadas para llevar a cabo modificaciones posteriores a la traducción¹¹ o para injertar sondas biofísicas¹² o fármacos¹³ pero que son mangos ideales para una conjugación adicional con antígenos de carbohidratos. Biotech¹⁴ ha reclamado ejemplos exitosos utilizando la síntesis de proteínas libres de células^15, pero la preparación de vacunas de glucoconjugado de acuerdo con esta estrategia todavía espera a popularizarse.

La aplicación de la estrategia in vivo para la producción de proteína portadora mutada necesita una maquinaria traslacional modificada que incluya un codón específico, un ARN que reconozca el codón y un aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) que cataliza específicamente la transferencia de la UAA en el ARN (Figura 1)¹⁶. La supresión del codón de detención de ámbar pirro lisina es uno de los métodos más utilizados para incorporar UAA, en particular la propargyl-lisina (PrK)¹⁷. Este último a su vez puede reaccionar con haptens de carbohidratos azido-funcionalizados para proporcionar glucococonjugados homogéneos y totalmente definidos. En el presente manuscrito describimos cómo sintetizar el propargyl-L-lisina, un UAA que lleva un mango de alquina, cómo incorporarlo a una proteína diana durante su traducción en una bacteria y finalmente cómo realizar la conjugación entre la proteína modificada y un hapten que lleva una función de azide utilizando la química de clics.

Protocolo

1. Síntesis de la UAA: propargil-lisina (PrK)

1. Síntesis de ^{N α}-Boc-propargyl-lisina¹⁸
   1. Disolver 500 mg de Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) en una mezcla de 1 M NaOH (5 ml) y THF (5 ml) en un matraz y colocar el matraz con un tabique de silicio.
   2. Enfríe el matraz en un baño de hielo y luego agregue 158 l de cloroformato propargilo (1,62 mmol) por gota (durante un período de 2-3 minutos) utilizando una microsyringe durante la agitación.
   3. Calentar la mezcla de reacción a temperatura ambiente y continuar revolviendo durante 10 h.
   4. Enfríe las soluciones de 50 ml de éter dietílico, 50 ml de ácido clorhídrico acuoso de 1 M y 60 ml de acetato de etilo en un baño de hielo.
   5. Enfríe la mezcla de reacción bruta en un baño de hielo y vierta la mezcla en un embudo de separación. Extraiga la mezcla con 50 ml de éter dietílico. Deseche la capa orgánica.
   6. Añadir con precaución el ácido clorhídrico acuoso de 1 M a la fase acuosa en el embudo de separación. Luego extraiga la capa acuosa dos veces usando 30 ml de acetato de etilo. Verificar la presencia de N-Boc-propargyl-lisina en la fase orgánica por TLC usando CH₂Cl₂-metanol (9:1) como eluyente.
   7. Secar las capas orgánicas combinadas sobre MgSO_4,filtrar la fase sólida y concentrar el filtrado bajo presión reducida en un evaporador rotatorio.
   8. Disolver una muestra del ^{N α}-Boc-propargyl-lisine en cloroformo deuterado (CDCl₃₎y controlar su identidad por ¹H NMR.
      ADVERTENCIA: La extracción puede resultar en una acumulación de presión. Libere cualquier acumulación de presión con frecuencia.
2. Síntesis del aminoácido antinatural propargyl-L-lisina (PrK)
   1. Introducir N^α-Boc-propargyl-lisina en un matraz de fondo redondo equipado con un tabique.
   2. Añadir 4 ml de diclorometano anhidro (CH₂Cl₂) al matraz bajo el argón para disolver el N^α-Boc-propargyl-lisine.
   3. Añadir 4 ml de ácido trifluoroacético (TFA) por gotas utilizando una jeringa durante la agitación.
   4. Revuelva la mezcla de reacción durante 1 h en RT. Monitoree la reacción por TLC usando CH₂Cl₂-metanol (9:1) como eluyente.
   5. Concentrar la mezcla de reacción bajo presión reducida.
   6. Añadir éter de dietil al residuo crudo e incubarlo a 4oC durante 1 h para precipitar el PrK. Cuando se trabaja a mayor escala, si el PrK no está completamente precipitado, triturar para precipitarlo y extender el tiempo de incubación si es necesario.
   7. Filtrar el PrK en forma de un sólido blanco en un vidrio frito.
   8. Disolver una alícuota del PrK en D₂O. A continuación, realice análisis de RMN para controlar su identidad y pureza.
   9. Para su uso posterior, disolver el aminoácido antinatural PrK en agua destilada a una concentración final de 100 mM y almacenar a -20 oC como 1 ml de alícuotas.

2. Producción de la proteína recombinante modificada por PrK

1. Preparación de Plásmido
   1. Construir un plásmido de expresión (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH) que contenga el gen de adhesina de superficie neumocócica madura objetivo A (mPsaA) (mPsaA) pET24d-mPsaA-WT) seguido de una secuencia de proteasa del virus de la fuerza del tabaco (TEV) clonando la plaquita entre los sitios de restricción BamHI y XhoI del plásmido pET24d. Esto introducirá una etiqueta De₆ en el C-terminus de la proteína. Sustituya el codón de lisina-32 por el codón ámbar (TAG), utilizando la técnica convencional de mutagénesis dirigida por el sitio.
   2. Construir un plásmido de segunda expresión (pEVOL-MmPylRS) que contenga dos copias del gen codificación para la sintetasa pirrolysyl-tRNA de Methanosarcina mazei (MmPylRS) y la codificación genética para el tRNA^Pyr correspondiente como se describió anteriormente¹⁹. Utilice este vector plásmido especialmente diseñado, pEVOL, para la incorporación eficiente de UAAs.
      NOTA: La información detallada de plásmidos se describe en el archivo suplementario 1.
2. Co-transformación de plásmidos en la cepa de expresión
   1. Descongelar una alícuota de 100 l de Escherichia coli BL21(DE3) químicamente competente sobre hielo durante 5 min.
   2. Añadir 1 l de cada plásmido (50-100 ng de cada una) en las células e incubar durante 30 minutos sobre hielo.
   3. Transfiera el microtubo de 1,5 ml con las células competentes descongeladas en una incubadora a 42oC durante 45 s y luego muévalo de nuevo al hielo durante 2 min.
   4. Añadir 900 l de medio LB e incubar bajo agitación durante 1 h a 37oC para permitir la expresión de antibióticos. A continuación, encama las bacterias en el agar LB con 25 g/ml de kanamicina y 30 g/ml de cloramphenicol. Permita el crecimiento de bacterias durante la noche a 37 oC.
3. Expresión de proteínas modificadas con PrK
   1. Inocular una sola colonia co-transformada en 5 ml de medio LB con antibióticos (25 g/ml de kanamicina y 30 g/ml de cloramphenicol). Incubar durante la noche a 37oC con temblor.
   2. Diluir el cultivo primario (5 ml) en 500 ml de medio de autoinducción que contiene antibióticos, 0,02% de L-arabinosa y 1 mM del aminoácido antinatural PrK e incubarlo a 37 oC durante 24 h con temblor. Incluya un control negativo realizando la cultura sin PrK en paralelo y un control positivo realizando la cultura de un clon que contiene la proteína wt.
   3. Alícuota 5 ml del medio de cultivo de 500 ml y centrífuga durante 10 min a 5.000 x g. Deseche el sobrenadante y congele el pellet a -20 oC. Cosechar células de los 495 ml restantes por centrifugación durante 10 min a 5.000 x g. Deseche el sobrenadante y congele el pellet a -20 oC.
4. Analizar extractos de células brutas de las muestras de cultivo de 5 ml mediante SDS-PAGE y el análisis western Blot
   1. Resuspender pellets de células de 5 ml en 250 ml de tampón de lisia (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazol, 0,2 mM PMSF) y transferirlo a un microtube de 1,5 mL.
   2. Lyse cells mediante la congelación de los tubos en nitrógeno líquido, descongelar en un baño de 42 oC y vórtices a alta velocidad durante 30 s. Repita este paso 3 veces.
   3. Centrifugar muestras a 17.000 x g durante 10 min para eliminar los desechos celulares.
   4. Tome 10 l del sobrenadante y añada 5 ml de agua y 5 ml de tampón de carga (azul bromofenol, SDS, β-mercaptoetanol). Calentar las muestras durante 5 min a 100 oC y realizar análisis SDS-PAGE y western Blot.
5. Purificación de proteínas por cromatografía de afinidad de banco de flujo de gravedad utilizando cuentas de níquel-NTA
   1. Resuspender los gránulos celulares (del cultivo de 495 ml) en 20 ml de tampón de lisia (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazol, 0,2 mM PMSF).
   2. Añadir 5 l de DNase I (1 mg/ml) y 500 l de lesozima (50 mg/ml) en la suspensión y permitir la lelisis incubando la suspensión a 37oC durante 30 min.
   3. Sonicar las células durante 5 min (ciclos de 5 s-5 s, amplitud 50%) y luego retirar los desechos celulares por centrifugación a 20.000 x g durante 30 min seguido de filtración en el filtro de 0,45 m.
   4. Añadir resina Ni-NTA a la suspensión (500 ml para 500 ml de cultivo celular) y mezclar suavemente a 4 oC durante 1 h.
   5. Vierta la suspensión en una columna de polipropileno y recoja la fracción sin enlazar.
   6. Lavar la resina con 10 ml de tampón de lavado que contiene 50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol. Lavar la resina por segunda vez con 5 ml de tampón de lavado (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 20 mM imidazol). Recoger las fracciones de lavado.
   7. Eluir la proteína etiquetada con 1 ml de tampón de elución (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 300 mM imidazol). Repita este paso 4 veces y recopile todas las fracciones de elución.
   8. Analizar el analizado crudo, así como las 7 fracciones de purificación de SDS-PAGE en un gel de acrilamida del 12%.
   9. Combine las fracciones que contienen proteína pura su-etiquetada y dialícela contra 1 L de Tampón de proteasa TEV (50 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8) durante la noche mediante el uso de una membrana de diálisis (corte MW 6000-8000 Da). Mida la concentración de la proteína a 280 nm con un coeficiente de extinción molar de 37 360 cm^-1m^-1 y un peso molecular de 34,14 kDa para mPsaA.

3. Eliminación de la etiqueta de histidina por digestión proteasa TEV

1. Recoger la muestra de proteína en un tubo de 50 ml y añadir tampón TEV (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) hasta 1 ml a una concentración de 2 mg/ml.
   NOTA: La concentración puede variar según los resultados anteriores. Las concentraciones de proteínas que hemos probado se encuentran en un rango típico de 2-3 mg/ml.
2. Añadir 100 l de proteasa de TEV (añadir 1 l que contenga 10 unidades de TEV proteasa para 20 g de proteína a digerir).
3. Añadir 50 l de 0,1 M ditiothreitol (TDT).
4. Completo con buffer TEV (50 mM Tris HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8) hasta 5 mL.
5. Incubar durante la noche a 4oC con agitación lenta.
   NOTA: Si la digestión no está completa, añadir más PROteasa TEV, incubar durante más tiempo o a una temperatura más alta hasta 30 oC.
6. Dialíza la proteína digerida para eliminar el EDTA a 4oC durante la noche mediante el uso de una membrana de diálisis (corte 6000-8000 Da) contra tampón de fosfato (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 5 mM illomidale).
7. Para eliminar la proteasa TEV y la proteína no digerido, incubar la mezcla con perlas de Ni-NTA y mezclar suavemente durante 1 h a 4oC.
8. Vierta la suspensión en una columna de polipropileno. Recoger la fracción sin enlazar y lavar la columna con 5 ml de tampón de lavado (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol)
   NOTA: La proteína de interés debe recuperarse en las fracciones sin ataduras y de lavado.
9. Eluir la proteasa TEV y la proteína no digerido añadiendo 5 ml de tampón de elución (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 300 mM imidazol) en la columna. Compruebe las fracciones en busca de contenido proteico a 280 nm y mediante el análisis SDS-PAGE.
10. Compruebe la eficiencia de la digestión cargando muestras digeridas en una SDS PAGE con la proteína no digerida como control.
11. Dialíza la proteína digerida contra 1 L de tampón de clic (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH8) a 4oC durante la noche con una membrana de diálisis (corte 6000-8000 Da) para eliminar el imidazol, así como para cambiar el tampón, y medir la concentración de la proteína a 280 nm con coeficiente de extinción molar y peso molecular de mPsaA (37 360 cm^-1m^-1 y MW 34,14 kDa).

4. Evaluación de la accesibilidad y funcionalidad de propargyl-lisina de aminoácidos antinaturales para la química de clics

NOTA: Conjugar el mPsaA con 6-hexacloro-fluoresceína-azida utilizando el protocolo descrito por Presolski et al.²⁰ para la química de clics.

1. Tomar 432,5 ml de proteína mutada por PrK a una concentración de 57,8 m en un microtubo de 2 ml.
   NOTA: Se puede observar una concentración mínima de 2 m de alquina. Si la concentración de proteína es menor, consúltela con un concentrador centrífugo o favorezca el equilibrio de la reacción aumentando la proporción de molares de azida/alquina.
2. Añadir 10 l de 5 mM 6-hexacloro-fluoresceína-azida y luego añadir una premezcla de 2,5 l de solución de CuSO₄ a 20 mM y 7,5 l de Tris (benzyltriazolylmethyl)amina (THPTA) a 50 mM (concentraciones de soluciones de stock).
   1. Añadir 25 l de clorhidrato de aminoguanidina acuoso de 100 mM.
   2. Añadir 25 l de 20 mg/ml una solución acuosa preparada extemporáneamente de ascorbato sódico.
   3. Cierre el tubo, mezcle invirtiendo varias veces e incubar a temperatura ambiente durante 2 h.
   4. Detenga la reacción añadiendo 50 l de 0,5 M EDTA.
   5. Tomar 15 l de la mezcla de reacción y ponerlo un microtubo, añadir 5 l de tampón de carga (azul de bromofenol, SDS, β-mercaptoetanol), calentar la mezcla a 100 oC durante 5 min, y luego cargarlo en un gel de acrilamida al 12%. Después de la migración, visualice el conjugado fluorescente en el gel bajo luz UV a 312 nm.

5. Conjugación de mPsaA con un antígeno de carbohidratos azido-funcionalizado (Pn14TS-N₃) por clic en química

1. Acoplamiento
   1. Tomar 432,5 ml de proteína mutada por PrK a 57,8 oM en un microtubo de 2 ml.
   2. Añadir 10 l de 5 mM Pn14TS-N₃²¹ en agua y luego añadir una premezcla de 2,5 l de solución de CuSO₄ a 20 mM y 7,5 l de THPTA a 50 mM.
      NOTA: En la referencia 21 se ha descrito la síntesis de Pn14TS-N₃, un tetrasacárido que imita el polisacárido capsular Streptococcus pneumoniae. Teóricamente, se puede utilizar cualquier antígeno de carbohidratos que contenga una función de azida.
   3. Añadir 25 l de clorhidrato de aminoguanidina de 100 mM.
   4. Añadir 25 l de 20 mg/ml de solución acuosa preparada extemporáneamente de ascorbato sódico.
   5. Cierre el tubo, mezcle invirtiendo varias veces e incubar a RT durante 2 h.
   6. Detenga la reacción añadiendo 50 l de 0,5 M EDTA.
   7. Tomar 15 l de muestras y analizar por SDS-PAGE.
2. Purificación de filtración de gel del glicoconjugado
   1. Purificar el glucoconjugado aplicándolo a una columna de agarosa de exclusión esterica (15 x 600 dimensiones de lecho, 3.000-70.000 rango de fraccionamiento), equilibrado con 100 mM de tampón PBS, pH 7.3 a un flujo de 0,8 ml/min con detección a 280 nm.
   2. Recoger las fracciones que contienen el glucoconjugado.
      NOTA: Para un almacenamiento prolongado, marque el glucoconjugado contra 1 L de H₂O dos veces durante 2 h y luego durante la noche a 4 oC utilizando membrana de diálisis (corte Mw 6000-8000 Da), luego seque y almacene el glicoconjugado a -80 oC.

Resultados

En este proyecto, se preparó una vacuna homogénea de glucoconjugado utilizando la estrategia de supresión de codón de parada de ámbar para introducir una UAA en un sitio definido (Figura 1). La adhesina de superficie neumocoica A fue seleccionada como la mitad de la proteína portadora. Esta proteína es altamente conservada y expresada por todas las cepas de Streptococcus pneumoniae²². Es altamente inmunogénico y anteri...

Discusión

La mutagénesis dirigida por el sitio es una estrategia sencilla para incorporar aminoácidos específicos en una posición definida de una proteína que apenas se utiliza con el objetivo de preparar vacunas de glicoconjugado^7,8,14. La mutagénesis clásica basada en el enfoque de 20 aminoácidos naturales es altamente eficiente ya que no se requiere ninguna modificación de la maquinaria de traducción. Las mutaciones de la cis...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AIM (autoinductif medium)	Formedium	AIMLB0210	Solid powder
Boc-Lys-OH	Alfa-Aesar	H63859	Solid powder
BL21(DE3)	Merck Novagen	69450	E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin	Machery Nagel	Protino	Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH	this study		same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT	this study		pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid	gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)		plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate	Sigma-Aldrich	460923	Liquid
Sonicator	Thermo Fisher	FB120-220