Glicoconjugate homogêneo produzido por incorporação combinada de aminoácidos não naturais e click-química para fins de vacina

Resumo

A expansão do código genético é aplicada para a introdução de um aminoácido não natural com um grupo funcional biorthogonal em uma proteína portadora em um local definido. A função biorthogonal é ainda utilizada para o acoplamento seletivo local de um antígeno de carboidratos para fornecer uma vacina glicoconjugar homogênea.

Resumo

A expansão do código genético é uma ferramenta poderosa para introduzir aminoácidos não naturais (UAAs) em proteínas para modificar suas características, estudar ou criar novas funções proteicas ou ter acesso a conjugados proteicos. A supressão do códon stop, em particular a supressão do codon âmbar, emergiu como o método mais popular para introduzir geneticamente UAAs em posições definidas. Esta metodologia está aqui aplicada à preparação de uma proteína portadora contendo um UAA abrigando um grupo funcional bioortogonal. Esta alça reativa pode ser usada em seguida para enxertar especificamente e eficientemente um oligossacarídeo sintético hapten para fornecer uma vacina glicoconjugate homogênea. O protocolo limita-se à síntese de glicoconjugados em uma relação de proteína de 1:1 carboidratos hapten/portador, mas ameniz a numerosos pares de grupos funcionais biorthogonais. A homogeneidade da vacina Glicococonjugate é um critério importante para garantir a caracterização física-química completa, satisfazendo, assim, as recomendações cada vez mais exigentes da agência reguladora de medicamentos, critério não atendido pelas estratégias clássicas de conjugação. Além disso, este protocolo permite afinar finamente a estrutura da vacina conjugada real, dando origem a ferramentas para lidar com as relações estrutura-imunogenicidade.

Introdução

As vacinas glicoconjugate são elementos essenciais do arsenal vacinal disponível para o tratamento profilático de doenças infecciosas. Eles são seguros, bem tolerados e eficientes em uma faixa etária ampla, incluindo bebês jovens. Eles fornecem a defesa ideal contra infecções causadas por bactérias capsuladas como meningococcus, pneumococcus ou Haemophilus influenzae tipo b¹. As vacinas glicococonjugate são feitas de polissacarídeos bacterianos purificados que formam as cápsulas de bactérias ou oligossacarídeos sintéticos que imitam esses polissacarídeos expressos na superfície^2,que estão covalentemente ligados a uma proteína portadora. A presença de uma proteína portadora é essencial para promover respostas imunes humorais protetoras dirigidas contra o determinante antigênico expresso pelos antígenos de carboidratos³. Além de uma cuidadosa seleção e produção do antígeno de carboidratos, as características conhecidas por exercer influência sobre a eficácia de uma vacina glicoconjugate são: a natureza da proteína portadora, a química de conjugação (incluindo a natureza e o comprimento da ligação, se utilizada), ou a razão sacarídeo/proteína³. Obviamente, as posições em que o sacarídeo é conjugado à proteína, bem como o número de pontos de conectividade são relevantes para a imunogenicidade. Até o momento, esses dois parâmetros dificilmente foram estudados porque a preparação dos glicoconjugados permanece em grande parte empírica. Sua síntese geralmente se baseia no uso de funções de ácido ami ou carboxílico de, respectivamente, resíduos de lise ou ácido aspartic/glutamico presentes na sequência proteica portadora. Isso não leva a uma única, mas a uma mistura heterogênea de glicoconjugados.

Brincar com a reatividade, acessibilidade ou distribuição dos resíduos de aminoácidos na proteína dá origem a glicoconjugados mais definidos que são mais confiáveis para documentar o efeito da conectividade sacarídeo/proteína⁴. Um avanço nesse sentido pode ser alcançado com a aplicação da tecnologia de acoplamento de proteínas glican, um processo recombinante que permite a produção de vacinas gentificas de glicoconjugate nas fábricas de células^5,6. No entanto, a glicosylação ocorre exclusivamente em um resíduo de asparagine dentro de sequons D/EXNYS/T (pelo qual X é qualquer um dos 20 aminoácidos naturais), não naturalmente presente nas proteínas portadoras.

Mutagênese seletiva do local e, em particular, incorporação de cisteínas para explorar sua reatividade altamente e seletiva aparece como uma alternativa^7,8. A produção de proteínas portadoras que incorporam UAAs em sua sequência pode oferecer ainda mais flexibilidade para a preparação homogênea da vacina glicoconjugate. Mais de 100 UAAs foram desenvolvidos e incorporados em várias proteínas^9,10. Muitos deles contêm funções bioortogonais geralmente usadas para realizar modificações pós-translacionais¹¹ ou para enxertar sondas biofísicas¹² ou drogas^13, mas que são alças ideais para posterior conjugação com antígenos de carboidratos. Exemplos bem-sucedidos foram reivindicados pela Biotech¹⁴ usando a síntese de proteínas livres de células^15, mas a preparação de vacinas de glicoconjugate de acordo com essa estratégia ainda espera se popularizar.

A aplicação da estratégia in vivo para a produção de proteína transportadora mutada precisa de uma máquina translacional modificada que inclua um códon específico, um tRNA reconhecendo o códon e uma sithetase aminoacyl-tRNA (aaRS) que catalisa especificamente a transferência do UAA no tRNA (Figura 1)¹⁶. A supressão do codon de parada âmbar pirrolise é um dos métodos mais utilizados para incorporar UAA, em particular a propargyl-lysine (PrK)¹⁷. Este último, por sua vez, pode reagir com haptens de carboidratos azido-funcionalizados para fornecer glicococonjugados totalmente definidos e homogêneos. No presente manuscrito descrevemos como sintetizar a propargyl-L-lysine, uma UAA carregando uma alça de alkyne, como incorporá-la em uma proteína alvo durante sua tradução em uma bactéria e, finalmente, como realizar a conjugação entre a proteína modificada e um hapten carregando uma função de azida usando a química do clique.

Protocolo

1. Síntese do UAA: propargyl-lysine (PrK)

1. Síntese de N^α-Boc-propargyl-lysine¹⁸
   1. Dissolva 500 mg de Boc-L-Lys-OH (2,03 mmol) em uma mistura de aquoso 1 M NaOH (5 mL) e THF (5 mL) em um frasco e encaixe o frasco com um septo de silício.
   2. Esfrie o frasco em um banho de gelo e adicione 158 μL de clorofórmio propargyl (1,62 mmol) dropwise (durante um período de 2-3 minutos) usando uma microsinga durante a agitação.
   3. Aqueça a mistura de reação à temperatura ambiente e continue mexendo por 10h.
   4. Esfrie as soluções de 50 mL de éter dietil, 50 mL de ácido clorídrico aquoso de 1 M e 60 mL de acetato de etila em um banho de gelo.
   5. Esfrie a mistura de reação bruta em um banho de gelo e despeje a mistura em um funil de separação. Extrair a mistura com 50 mL de éter dietil. Descarte a camada orgânica.
   6. Adicione cautelosamente ácido clorídrico de 1 M à fase aquosa do funil de separação. Em seguida, extraia a camada aquosa duas vezes usando 30 mL de acetato de etila. Verifique a presença de N-Boc-propargyl-lysine na fase orgânica por TLC usando CH₂Cl₂-metanol (9:1) como eluente.
   7. Seque as camadas orgânicas combinadas sobre o MgSO_4,filtre a fase sólida e concentre o filtrado sob pressão reduzida em um evaporador rotativo.
   8. Dissolva uma amostra do petróleo bruto N^α-Boc-propargyl-lysine em clorofórmio deuterado (CDCl₃) e controle sua identidade por ¹H NMR.
      ATENÇÃO: A extração pode resultar em um acúmulo de pressão. Libere qualquer acúmulo de pressão com frequência.
2. Síntese do aminoácido não natural propargyl-L-lisina (PrK)
   1. Introduza n^α-Boc-propargyl-lysine em um frasco fundo redondo equipado com um septo.
   2. Adicione 4 mL de diclorometano anidro (CH₂Cl₂) ao frasco sob argônio para dissolver o N^α-Boc-propargyl-lysine.
   3. Adicione 4 mL de ácido trifluoroacético (TFA) dropwise usando uma seringa durante a agitação.
   4. Mexa a mistura de reação por 1 h no RT. Monitore a reação do TLC usando CH₂Cl₂-metanol (9:1) como eluente.
   5. Concentre a mistura de reação sob pressão reduzida.
   6. Adicione éter dietil ao resíduo bruto e incuba-o a 4 °C por 1h para precipitar o PrK. Ao trabalhar em maior escala, se o PrK não estiver completamente precipitado, triturar para precipitar-lo e estender o tempo de incubação, se necessário.
   7. Filtre o PrK na forma de um sólido branco em um vidro frito.
   8. Dissolva uma alíquota do PrK em D₂O. Em seguida, realize análises de RMN para controlar sua identidade e pureza.
   9. Para uso posterior, dissolva o aminoácido não natural PrK em água destilada em uma concentração final de 100 mM e armazene a -20 °C como alíquotas de 1 mL.

2. Produção da proteína recombinante modificada pela PrK

1. Preparação plasmid
   1. Construa uma expressão plasmid (pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH) que contém o gene de adesivo de superfície pneumocócica amadurecido alvo A (mPsaA) (pET24d-mPsaA-WT) seguido por uma sequência de protease do Vírus do Etch de Tabaco (TEV) clonando a inserção entre os locais de restrição BamHI e XhoI do plasmídeo pET24d. Isso introduzirá uma tag₆ no C-terminus da proteína. Substitua o códo de lysina-32 pelo códon âmbar (TAG), utilizando a técnica convencional de mutagênese dirigida ao local.
   2. Construa uma segunda expressão plasmid (pEVOL-MmPylRS) contendo duas cópias da codificação genética para a sintetase pirrolysyl-tRNA de Methanosarcina mazei (MmPylRS) e a codificação genética para o tRNA^Pyr correspondente como descrito anteriormente¹⁹. Use este vetor plasmídeo especialmente projetado, pEVOL, para incorporação eficiente de UAAs.
      NOTA: As informações detalhadas dos plasmídeos estão descritas no Arquivo Suplementar 1.
2. Co-transformação de plasmídeos na tensão de expressão
   1. Descongele uma alíquota de 100 μL de Escherichia coli BL21(DE3) quimicamente competente no gelo por 5 minutos.
   2. Adicione 1 μL de cada plasmídeo (50-100 ng de cada) nas células e incubar por 30 minutos no gelo.
   3. Transfira o microtubo de 1,5 mL com as células competentes descongeladas em uma incubadora a 42 °C por 45 s e depois mova-o de volta para o gelo por 2 minutos.
   4. Adicione 900 μL de meio LB e incubar sob agitação por 1h a 37 °C para permitir a expressão de antibióticos. Em seguida, coloque as bactérias no ágar LB com 25 μg/mL de kanamicina e 30 μg/mL de clororamfenicol. Permitir o crescimento das bactérias durante a noite a 37 °C.
3. Expressão de proteínas modificadas com PrK
   1. Inocular uma única colônia co-transformada em 5 mL de meio LB com antibióticos (25 μg/mL de kanamicina e 30 μg/mL de clorofenicol). Incubar durante a noite a 37 °C com agitação.
   2. Diluir a cultura primária (5 mL) em 500 mL de meio de autoindução contendo antibióticos, 0,02% de L-arabinose e 1 mM do aminoácido não natural PrK e incuba-lo a 37 °C por 24 h com agitação. Inclua um controle negativo realizando a cultura sem PrK em paralelo e um controle positivo realizando a cultura de um clone contendo a proteína wt.
   3. Alíquota de 5 mL do meio de cultura de 500 mL e centrífuga por 10 min a 5.000 x g. Descarte o supernatante e congele a pelota a -20 °C. Células de colheita dos 495 mL restantes por centrifugação por 10 min a 5.000 x g. Descarte o supernatante e congele a pelota a -20 °C.
4. Analise extratos de células brutas das amostras de cultura de 5 mL por SDS-PAGE e análise de blot ocidental
   1. Resuspende 5 mL de pelotas de células em 250 μL de tampão de lise (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazol, 0,2 mM PMSF) e transfira-o para um microtubo de 1,5 mL.
   2. Células de lise congelando os tubos em nitrogênio líquido, descongelando-os em um banho de 42 °C e vórtices em alta velocidade para 30 s. Repita este passo 3 vezes.
   3. Centrífuga amostras a 17.000 x g por 10 minutos para eliminar detritos celulares.
   4. Pegue 10 μL do supernasal e adicione 5 μL de água e 5 μL de tampão de carregamento (azul bromofenol, SDS, β-mercaptoethanol). Aqueça as amostras por 5 min a 100 °C e realize análises de SDS-PAGE e Western Blot.
5. Purificação de proteínas por cromatografia de afinidade fluxo de gravidade usando contas de níquel-NTA
   1. Resuspenncie as pelotas de célula (da cultura de 495 mL) em 20 mL de tampão de lise (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 8, 5 mM imidazole, 0,2 mM PMSF).
   2. Adicione 5 μL de DNase I (1 mg/mL) e 500 μL de lysozyme (50 mg/mL) na suspensão e permita a lise incubando a suspensão a 37 °C durante 30 min.
   3. Sonicar as células durante 5 min (ciclos de 5 s-5 s, amplitude 50%) e, em seguida, remova os detritos celulares por centrifugação a 20.000 x g por 30 min seguido de filtragem no filtro de 0,45 μm.
   4. Adicione resina Ni-NTA à suspensão (500 μL para 500 mL de cultura celular) e misture suavemente a 4 °C por 1h.
   5. Despeje a suspensão em uma coluna de polipropileno e colete a fração não ligada.
   6. Lave a resina com 10 mL de tampão de lavagem contendo 50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole. Lave a resina uma segunda vez com 5 mL de tampão de lavagem (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 20 mM imidazole). Pegue as frações de lavagem.
   7. Elute a proteína sua marcada com 1 mL de tampão de elução (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 300 mM imidazol). Repita esta etapa 4 vezes e colete todas as frações de elução.
   8. Analise o liseto bruto, bem como as 7 frações de purificação por SDS-PAGE em um gel de acrilamida de 12%.
   9. Combine as frações contendo proteína pura sua marcada e dialise-a contra 1 L de tampão de protease TEV (50 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) durante a noite usando uma membrana de diálise (MW 6000-8000 Da). Meça a concentração da proteína a 280 nm com um coeficiente de extinção molar de 37 360 cm^-1∙M^-1 e um peso molecular de 34,14 kDa para mPsaA.

3. Remoção da tag histidina pela digestão protease TEV

1. Colete a amostra de proteína em um tubo de 50 mL e adicione tampão TEV (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) até 1 mL a uma concentração de 2 mg/mL.
   NOTA: A concentração pode variar de acordo com os resultados anteriores. As concentrações proteicas que testamos estão em uma faixa típica de 2-3 mg/mL.
2. Adicione 100 μL de protease TEV (adicione 1 μL contendo 10 unidades de protease TEV por 20 μg de proteína para digerir).
3. Adicione 50 μL de 0,1 M dithiothreitol (DTT).
4. Completo com tampão TEV (50 mM Tris HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) até 5 mL.
5. Incubar durante a noite a 4 °C com agitação lenta.
   NOTA: Se a digestão não estiver completa, adicione mais protease TEV, incubar por mais tempo ou em temperaturas mais altas até 30 °C.
6. Dique a proteína digerida para remover EDTA a 4 °C durante a noite usando uma membrana de diálise (corte 6000-8000 Da) contra tampão de fosfato (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 5 mM imidazole).
7. Para eliminar a protease TEV e a proteína não digerida, incubar a mistura com contas Ni-NTA e misturar suavemente por 1h a 4 °C.
8. Despeje a suspensão em uma coluna de polipropileno. Colete a fração desvinculada e lave a coluna com 5 mL de tampão de lavagem (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole)
   NOTA: A proteína de interesse deve ser recuperada nas frações desvinculada e de lavagem.
9. Elute o protease TEV e a proteína não digerida adicionando 5 mL de tampão de elução (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 300 mM imidazole) na coluna. Verifique as frações de conteúdo de proteínas em 280 nm e pela análise SDS-PAGE.
10. Verifique a eficiência da digestão carregando amostras digeridas em uma PÁGINA de SDS com a proteína não digerida como controle.
11. Dialise a proteína digerida contra 1 L de tampão de clique (50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH8) a 4 °C durante a noite com uma membrana de diálise (corte 6000-8000 Da) para remover imidazol, bem como para trocar o buffer, e medir a concentração da proteína a 280 nm com coeficiente de extinção molar e peso molecular de mPsaA (37 360 cm^-1∙M^-1 e MW 34,14 kDa).

4. Avaliação da acessibilidade e funcionalidade de propargyl-lisina de aminoácidos não naturais para química de cliques

NOTA: Conjugar o mPsaA com 6-hexachloro-fluoresceíno-azide usando o protocolo descrito por Presolski et al.²⁰ para química de cliques.

1. Tome 432,5 μL de proteína mutada prk a uma concentração de 57,8 μM em um microtubo de 2 mL.
   NOTA: É aceitável uma concentração mínima de 2 μM de alkyne. Se a concentração de proteína for menor, concentre-a com um concentrador centrífuga ou favoreça o equilíbrio da reação aumentando a razão molar azide/alkyne.
2. Adicione 10 μL de 5 mM 6-hexachloro-fluoresceíno-azide e, em seguida, adicione uma precex de 2,5 μL de solução CuSO₄ a 20 mM e 7,5 μL de Tris (benzyltriazolylme)amine (THPTA) a 50 mM (concentrações de soluções de estoque).
   1. Adicione 25 μL de aquoso 100 mM de hidrocloreto de aminoguanidina.
   2. Adicione 25 μL de 20 mg/mL uma solução aquosa extemporâneamente preparada de ascorbato de sódio.
   3. Feche o tubo, misture invertendo várias vezes e incubando à temperatura ambiente por 2h.
   4. Pare a reação adicionando 50 μL de 0,5 M EDTA.
   5. Pegue 15 μL da mistura de reação e coloque-a como um microtubo, adicione 5 μL de tampão de carregamento (azul bromofenol, SDS, β-mercaptoetanol), aqueça a mistura a 100 °C por 5 min e, em seguida, carregue-a em um gel de acrilamida de 12%. Após a migração, visualize o conjugado fluorescente no gel sob luz UV a 312 nm.

5. Conjugação de mPsaA com antígeno de carboidratos funcionalizado azido (Pn14TS-N₃) por química de clique

1. Acoplamento
   1. Tome 432,5 μL de proteína mutada por PrK a 57,8 μM em um microtubo de 2 mL.
   2. Adicione 10 μL de 5 mM Pn14TS-N₃²¹ na água e adicione uma precárxe de 2,5 μL de solução CuSO₄ a 20 mM e 7,5 μL de THPTA a 50 mM.
      NOTA: A síntese de Pn14TS-N₃, um tetrassacarídeo imitando o sorotipo 14 capsular de Estreptococos pneumoniae 14, foi descrita na referência 21. Teoricamente, qualquer antígeno de carboidratos contendo uma função de azida pode ser usado.
   3. Adicione 25 μL de 100 mM de cloridrato de aminoguanidina.
   4. Adicione 25 μL de 20 mg/mL solução aquosamente preparada de ascorbate de sódio.
   5. Feche o tubo, misture invertendo várias vezes e incubar em RT durante 2 h.
   6. Pare a reação adicionando 50 μL de 0,5 M EDTA.
   7. Pegue 15 μL de amostras e analise por SDS-PAGE.
2. Purificação de filtragem de gel do glicoconjugate
   1. Purifique o glicoconjugate aplicando-o a uma coluna de exclusão estérica (15 x 600 dimensões de leito, 3.000-70.000 fracionamento), equilibrado com tampão PBS de 100 mM, pH 7.3 em um fluxo de 0,8 mL/min com detecção a 280 nm.
   2. Recolher as frações que contêm o glicoconjugado.
      NOTA: Para armazenamento prolongado, diálise o glicoconjugado contra 1 L de H 2 O duas_vezespor 2h e depois durante a noite a 4 °C usando membrana de diálise (Mw 6000-8000 Da), depois congele-se e armazene o glicoconjugue a -80 °C.

Resultados

Neste projeto, foi preparada uma vacina glicoconjugate homogênea utilizando-se a estratégia de supressão do códon de parada âmbar para introduzir um UAA em local definido(Figura 1). A adesivo de superfície pneumoccocal A foi selecionada como a moiety proteção portadora. Esta proteína é altamente conservada e expressa por todas as cepas de Streptococcus pneumoniae²². É altamente imunogênico e previamente utilizado c...

Discussão

Mutagênese dirigida ao local é uma estratégia simples para incorporar aminoácidos específicos em uma posição definida de uma proteína que permanece mal utilizada com o objetivo de preparar vacinas glicoconjugar^7,8,14. Mutagênese clássica baseada na abordagem de 20 aminoácidos naturais é altamente eficiente, uma vez que nenhuma modificação da máquina de tradução é necessária. Mutações de cisteína geralmente ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AIM (autoinductif medium)	Formedium	AIMLB0210	Solid powder
Boc-Lys-OH	Alfa-Aesar	H63859	Solid powder
BL21(DE3)	Merck Novagen	69450	E. coli str. B, F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)
Dialysis membrane
DNAseI
Filter 0.45 µm
L-arabinose
lysozyme
Ni-NTA resin	Machery Nagel	Protino	Ni-NTA beads in suspension into 20% ethanol
Pall centrifugal device
pET24d-mPsaAK32TAG-ENLYFQ-HHHHHH	this study		same as pET24d-mPsaA-WT but with a K32TAG mutation in the mPsaA gene
pET24d-mPsaA-WT	this study		pET24d plasmide with the Wt mPsaA gene cloned between the BamHI and XhoI restriction sites with a TEV protease sequence followed by a His6 tag at the C-terminal end of mPsaA gene and carrying the Kanamycine resistance gene
pEVOL plasmid	gift fromEdward Lemke EMBL (ref 19)		plasmide with p15A origin, two copies of MmPylRS (one under GlnS promoter and one under pAra promoter), one copy of the tRNACUA under the ProK promoter, the chloramphenicol resistance gene
Propargyl chloroformate	Sigma-Aldrich	460923	Liquid
Sonicator	Thermo Fisher	FB120-220