胶质母细胞瘤的3D球形模型

摘要

在这里，我们描述了一种容易使用的胶质细胞瘤入侵测定。这种测定适用于胶质母细胞瘤干细胞。还介绍了斐济宏，用于轻松量化入侵、移徙和扩散。

摘要

二维（2D）细胞培养物在体内肿瘤生长不令人满意地模仿。因此，开发了三维（3D）培养球形模型。这些模型在神经肿瘤学领域可能特别重要。事实上，脑肿瘤有侵入健康大脑环境的倾向。我们在这里描述了一个理想的3D胶质母细胞瘤球体为基础的测定，我们开发研究肿瘤入侵。我们提供所有技术细节和分析工具，以成功执行此测定。

引言

在大多数使用原细胞系或商业上可用的细胞系的研究中，在塑料表面作为单层培养物生长的细胞上进行检测。在 2D 中管理单元格培养表示缺点，因为它不模仿体内 3D 细胞环境。在2D培养物中，整个细胞表面与介质直接接触，改变细胞生长，改变药物可用性。此外，非生理塑料表面触发细胞分化^1。为克服这些困难，我们开发了三维文化模型。它们具有模仿肿瘤²的多细胞架构和异质性的优点，因此可被视为实体肿瘤³的更相关的模型。球类复杂的形态有助于更好地评价药物渗透和抗药性^4。球体中的肿瘤异质性影响氧和营养的扩散，以及对药理剂的反应（图1A）。当球体尺寸达到300μm时，氧气的扩散会改变，在球体中心引起缺氧环境（图1A，C）。代谢物也较少穿透细胞层和补偿代谢反应发生^5。当球形的直径增加时，可以观察到坏死核，进一步模仿许多固体癌症中发现的特征，包括恶性脑癌胶质细胞瘤^{（GBM）6。}

文献^77、88报道了胶质细胞瘤的几种2D或3D入侵测定。二维测定主要用于研究在薄矩阵层或博伊登腔室测定⁹中水平平面上的入侵。三维检测用经典的胶质细胞系¹⁰来描述3D球形培养。更复杂的变异表现为对抗培养中肿瘤球类对脑器官的入侵^11。然而，开发一种易于利用和可重复的检测对于任何实验室都仍然很重要。我们开发了一种协议，从患者样本中产生胶质细胞瘤干细胞样细胞。这些检测的量化易于管理，只需要开放访问的在线软件。简单地说，肿瘤片被切成小块，酶消化。从消化中提取的单细胞在神经基础培养基中培养。4-7天后，球形结构自发形成。在小鼠模型中植入颅内后，它们形成肿瘤，表现出一个被伪细胞包围的坏死核^12。这与 GBM 患者的特征非常相似。

在本文中，我们描述了我们根据确定数量的细胞生产球体以确保可重复性的协议。两种补充基质可用于此目的:母质和胶原蛋白 I 型，Matrigel 富含生长因子，并模仿细胞连接和迁移所需的哺乳动物基膜。另一方面，胶原蛋白I型，一种基质的结构元素，是最常见的纤维外细胞基质，用于细胞入侵测定。在这里，我们通过执行迁移和增殖测定来说明我们的 GBM 球形模型。分析不仅在固定的时间点进行，而且通过实时成像监测球体扩张和细胞运动。此外，还进行了电子显微镜的可视化形态细节。

研究方案

所有患者均获得书面同意（根据当地道德委员会的规定，从挪威卑尔根的豪克兰医院获得）。我们的协议遵循我们机构人类研究伦理委员会的准则。

1. 生成均匀大小的肿瘤球体

注:干细胞在神经基础培养中培养，补充B27补充剂、肝素、FGF-2、青霉素和链霉素，如前文^第12条所述。这些细胞在培养中自发地形成球体。

1. 用5 mL磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗肿瘤细胞，并在 37°C 下用 0.5-1 mL 分离酶（参见材料表）孵育细胞 5 分钟。
2. 用4-4.5 mL PBS清洗，并添加10 mL的完整生长介质（完整的神经基础介质，cNBM）。
3. 使用带锥盘蓝色和细胞计数室幻灯片的自动计数技术对单元格进行计数。
4. 要生成 100 个球类，每个球体有 10⁴个细胞（根据首选尺寸），在 NBM 的 8 mL 中混合 10^{个 6}个细胞，将 2 mL 的 2% 甲基纤维素混合。
5. 将悬浮液转移到无菌系统容器，用多通道移液器将 100 μL/井分配到 96 井圆形底板上。
6. 在37°C、5%CO₂和 95% 湿度下孵育板。大小相等的球体将形成，可在3-4天后使用。

2. 三维实验

1. 增殖
   1. 制备
      1. 悬浮抑制剂（例如，如图4A所示的罗酮）和100 μL介质中的化学物质，并添加到每口井中100μL的介质中（即每口井一个球体）。
      2. 在37°C、5%CO₂和95%湿度下孵育板。
   2. 图像采集和分析
      1. 在明亮场使用视频显微镜拍照，在 T₀和以下时间创建一系列条件。
      2. 使用斐济手动或半自动方式分析图片。要手动执行此操作，使用徒手选择工具在球形核心周围绘制一个圆圈，并测量每个球形的面积。要以半自动方式分析图像，请使用补充文档 1中显示的仅 //核心区域的宏。
2. 入侵
   1. 制备
      1. 以1mg/mL最终浓度、1倍PBS、0.023xV_胶原蛋白、1 M氢氧化钠和无菌H₂O.将溶液孵育在冰上30分钟，在冰管中制备胶原蛋白基质。I型胶原蛋白最终浓度为1mg/mL。
      2. 从 500 μL 管中的圆底孔板收集球体，用 200 μL 1x PBS 洗涤 2 倍。
      3. 将球体小心地移入胶原蛋白基质的100μL中，并插入正常96孔板中的井中心。
      4. 在37°C下孵化胶原蛋白凝胶30分钟，然后在凝胶顶部加入cNBM。在此步骤中，可以将抑制剂或活化剂（例如，如图 4B、4C所示的氯化氢）添加到介质中。
   2. 图像采集和分析
      1. 胶原蛋白加入后24小时使用明场模式的视频显微镜依次拍照。
      2. 使用斐济手动或半自动方式分析图片。要手动执行此操作，使用徒手选择工具围绕球形的球芯和球形总面积绘制，并通过减去核心区域的总面积来测量每个球形的侵入面积。要以半自动方式分析图像，请使用补充文档 1中所示的宏来确定入侵区域。
3. 迁移
   1. 制备
      1. 在 37 °C 下，在 NBM 中涂覆 6 孔板（0.2 毫克/mL），30 分钟，然后取出母体，加入 2 mL 的 cNBM。
      2. 将球体从圆底孔板转移到6孔板的50μLcNBM中。
      3. 在37°C下孵育板，等待30分钟，让球体粘附。
      4. 孵育24小时后，用10纳克/mL的Hoechst染色，并在37°C孵育30分钟。
   2. 图像采集和分析
      1. 在明亮场使用视频显微镜获取图像。405 nm 激光用于可视化 Hoechst 染色。
      2. 使用斐济软件分析图片并运行补充文档 1中所示的宏。
         注:触摸井底或完全去除上清液会损害球体。对于胶原蛋白I型凝胶的处理，保持凝胶在冰上，以避免胶原蛋白聚合，不要添加酸性成分，因为pH值的变化会影响凝胶的紧凑性，并移液细胞迅速进入胶原蛋白，以防止细胞死亡和凝胶降解。

3. 斐济宏

注:斐济是在公共领域开发的图像分析程序，它允许宏的开发以加快图像分析。手动分析也是可能的，但这是一个缓慢的过程，可能会引入偏差。图像可以通过软件中的拖放导入，并通过 ROI 管理器工具插件进行量化。本研究中使用的过程如下:

1. 打开宏窗口:插件 |宏 |交互式口译员。
2. 复制并粘贴以下经过调整的紫色循环。保留紫色句子并添加感兴趣的绿色句子（补充文件 1）。
3. 要分析整个系列，请调整特定定量的红色参数，并使用宏运行宏 |运行宏或按Ctrl_R。
4. 检查并在必要时手动调整感兴趣的区域 （ROI）。

4. 球形电子显微镜

注:以下步骤中的大多数必须在化学罩中完成。

1. 固定步骤
   1. 用切割移液器尖端收集球体，将其放入 1.5 mL 管中，用 0.1 M 磷酸盐缓冲液 （PB） 洗涤 1x。
   2. 在 0.1 M PB 中将球体在 4°C 下固定在 2% 谷醛/2% 的甲醛 （PFA） 中过夜。
   3. 在 0.1 M PB 中用 1% PFA 的解决方案替换固定解决方案，然后进行样品制备。
2. 样品制备
   1. 将球形转移到滤网中，放入玻璃杯中，以避免球体损坏。
   2. 用 0.1 M PB 小心洗涤 3 倍。
   3. 在黑暗中孵育2小时。在 1% 0.1 M PB 缓冲液中稀释至 4%。
   4. 用 0.1 M PB 小心洗涤 3 倍。
      1. 脱水如下:浸泡在50%乙醇10分钟，70%乙醇10分钟，2x90%乙醇15分钟，2x100%乙醇20分钟，2x丙酮30分钟。
   5. 将样品孵育在50/50混合物中的丙酮/树脂2小时。在此步骤中，制备 EPON 树脂（嵌入-812:11.25 g;DDSA: 9 g;NMA: 4.5 g）。
   6. 丢弃丙酮/树脂混合物，用新鲜准备的树脂代替，孵育过夜。
   7. 用新的树脂代替树脂，孵育2-6小时。
   8. 将树脂中的球体加入 60°C 的模具中，温度为 48-72 小时。

结果

如协议部分所述，编制了球类，并就迁移、入侵、扩散和显微镜进行了观测。为了测量球形结构不同区域的缺氧，用车盒性水合酶IX染色来确定缺氧活性（图1A-C）。在球形中心观察到更多的CAIX阳性细胞（图1A-C）。位于球状核中的缺氧细胞往往比周围的细胞更甘油。线粒体可以成像，以便进一步分析，?...

讨论

肿瘤球体测定非常适合研究肿瘤特征，包括增殖、入侵和迁移，以及细胞死亡和药物反应。癌细胞侵入形成侵入性微肿瘤的3D基质，如图4B，C所示。在入侵过程中，基质金属蛋白酶（MMP）消化肿瘤细胞¹³周围的基质，MMP抑制剂（例如GM6001或Rebimastat）可能损害细胞入侵，但不能迁移^14。迁移和入侵涉及重叠但独立的分子事件

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well round-bottom plate	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm2	Falcon	10497302
Matrigel	Corning	354230	Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103049	Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used to cell counting
Type I Collagen	Corning	354236	Stored at 4 °C