Un modelo de esferoides 3D para Glioblastoma

Resumen

Aquí, describimos un ensayo de invasión fácil de usar para el glioblastoma. Este ensayo es adecuado para células similares al glioblastoma similares a un tallo. También se describe una macro de Fiji para cuantificar fácilmente la invasión, la migración y la proliferación.

Resumen

Los cultivos celulares bidimensionales (2D) no imitan satisfactoriamente el crecimiento tumoral in vivo. Por lo tanto, se desarrollaron modelos de esferoides de cultivo tridimensionales (3D). Estos modelos pueden ser particularmente importantes en el campo de la neurooncología. De hecho, los tumores cerebrales tienen la tendencia a invadir el ambiente cerebral sano. Aquí describimos un ensayo ideal basado en esferoides de glioblastoma 3D que desarrollamos para estudiar la invasión tumoral. Proporcionamos todos los detalles técnicos y herramientas analíticas para realizar con éxito este ensayo.

Introducción

En la mayoría de los estudios que utilizan líneas celulares primarias o disponibles comercialmente, los ensayos se realizan en células cultivadas en superficies plásticas como cultivos monocapa. La gestión del cultivo celular en 2D representa desventajas, ya que no imita un entorno de células 3D in vivo. En los cultivos 2D, toda la superficie celular está directamente en contacto con el medio, alterando el crecimiento celular y modificando la disponibilidad de medicamentos. Además, la superficie de plástico no fisiológico desencadena la diferenciación celular¹. Se han desarrollado modelos de cultivo tridimensionalparados para superar estas dificultades. Tienen la ventaja de imitar la arquitectura multicelular y la heterogeneidad de los tumores^2,por lo que podrían considerarse un modelo más relevante para los tumores sólidos^3. La compleja morfología de los esferoides contribuye a evaluar mejor la penetración y resistencia a los fármacos^4. La heterogeneidad tumoral en el esferoide afecta a la difusión de oxígeno y nutrientes, y la respuesta a los agentes farmacológicos(Figura 1A). La difusión del oxígeno se altera cuando el tamaño de los esferoides alcanza los 300 m, induciendo un ambiente hipoxico en el centro del esferoide(Figura 1A,C). Los metabolitos también son menos penetrantes a través de las capas celulares y las reacciones metabólicas compensatorias tienen lugar⁵. Cuando aumenta el diámetro de la esferoide, se pueden observar núcleos necróticos, imitando aún más las características encontradas en muchos cánceres sólidos, incluyendo el glioblastoma agresivo del cáncer cerebral (GBM)⁶.

Varios ensayos de invasión 2D o 3D para el glioblastoma se han divulgado en la literatura^7,8. Los ensayos bidimensionales son principalmente para estudiar la invasión en un plano horizontal en una capa de matriz delgada o en un ensayo de cámara Boyden^9. Los ensayos tridimensionales se han descrito con cultivos de esferoides 3D utilizando líneas celulares clásicas de glioblastoma^10. Variantes más complejas están representadas por la invasión de organoides cerebrales por esferoides tumorales en las culturas de confrontación^11. Sin embargo, sigue siendo importante desarrollar un ensayo fácil de usar y reproducible disponible para cualquier laboratorio. Hemos desarrollado un protocolo para generar células similares a glioblastoma a partir de muestras de pacientes. La cuantificación de estos ensayos es fácilmente manejable y sólo requiere software en línea de acceso abierto. Brevemente, las piezas tumorales se cortan en trozos pequeños y se digieren enzimáticamente. Las células individuales derivadas de la digestión se cultivan en medio neurobasal. Después de 4-7 días, las estructuras esferoides se forman espontáneamente. Tras la implantación intracraneal en modelos de ratones, forman tumores que exhiben un núcleo necrótico rodeado de células pseudo-palisading^12. Esto se asemeja mucho a las características encontradas en los pacientes con GBM.

En este artículo, describimos nuestro protocolo para producir esferoides a partir de un número determinado de celdas para garantizar la reproducibilidad. Para ello se pueden utilizar dos matrices complementarias: Matrigel y colágeno tipo I. Matrigel se enriquece en factores de crecimiento e imita la membrana basal de mamíferos necesaria para la unión celular y la migración. Por otro lado, el colágeno tipo I, un elemento estructural del estroma, es la matriz extracelular fibrilar más común y se utiliza en ensayos de invasión celular. Aquí, ilustramos nuestro modelo de esferoides GBM mediante la realización de ensayos de migración y proliferación. El análisis se realizó no sólo en puntos de tiempo fijos, sino también mediante el monitoreo de la expansión del esferoide y el movimiento celular mediante imágenes en vivo. Además, la microscopía electrónica se realizó para visualizar detalles morfológicos.

Protocolo

Se obtuvo el consentimiento por escrito informado de todos los pacientes (del Hospital Haukeland, Bergen, Noruega de acuerdo con las regulaciones del comité de ética local). Nuestro protocolo sigue las pautas del comité de ética de investigación humana de nuestra institución.

1. Generación de esferoides tumorales de tamaño uniforme

NOTA: Las células similares al tallo se cultivan en medio neurobasal complementado con suplemento B27, heparina, FGF-2, penicilina y estreptomicina, como se describe en los artículos^{anteriores 12}. Estas células forman espontáneamente esferoides en el cultivo.

1. Lavar las células tumorales con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) e incubar las células con una enzima disociación de 0,5-1 ml (ver Tabla de materiales)durante 5 minutos a 37 oC.
2. Lavar con 4-4,5 ml de PBS y añadir 10 ml del medio de crecimiento completo (medio neurobasal completo, cNBM).
3. Cuente las celdas usando una técnica de conteo automático con trippan azul y una diapositiva de cámara de conteo celular.
4. Para generar 100 esferoides con 10⁴ células por esferoide (según el tamaño preferido), mezcle 10⁶ células en 8 ml de NBM con 2 ml de 2% de metilcelulosa al 2%.
5. Transfiera la suspensión a un recipiente estéril del sistema y dispensar 100 l/bien con una pipeta multicanal en una placa inferior redonda de 96 pocillos.
6. Incubar la placa a 37oC, 5% CO₂ y 95% de humedad. Se formarán esferoides de igual tamaño y se pueden utilizar después de 3-4 días.

2. Experimentos tridimensionales

1. Proliferación
   1. Preparación
      1. Suspender los inhibidores (p. ej., rotenona como en la Figura 4A)y productos químicos en 100 s de medio y añadir a los 100 s de medio en cada pocal (es decir, un esferoide por pocido).
      2. Incubar la placa a 37oC, 5% CO₂y 95% de humedad.
   2. Adquisición y análisis de imágenes
      1. Tome fotografías con un microscopio de vídeo en brightfield para crear una serie de condiciones en T₀ y los siguientes tiempos esperados.
      2. Utilice Fiji para analizar imágenes de forma manual o semiautomática. Para hacerlo manualmente, dibuje un círculo alrededor del núcleo del esferoide con la herramienta de selección a mano alzada y mida el área de cada esferoide. Para analizar las imágenes de forma semiautomática, utilice la macro que se muestra en Documento suplementario 1 solo con //Core Area.
2. Invasión
   1. Preparación
      1. Preparar la matriz de colágeno en un tubo sobre hielo con colágeno tipo I a 1 mg/ml de concentración final, 1x PBS, colágeno 0.023xV, hidróxido de sodio de 1 M, e estéril H₂O. Incubar la solución en hielo durante 30 min._collagen
      2. Recoger esferoides de la placa de pozo de fondo redondo en tubos de 500 l y lavar 2x con 200 s 1x PBS.
      3. Pipetear los esferoides cuidadosamente en 100 l de la matriz de colágeno e insertar en el centro de un pozo en las placas normales de 96 pocillos.
      4. Incubar el gel de colágeno durante 30 min a 37 oC y luego añadir cNBM encima del gel. Los inhibidores o activadores (por ejemplo, cloruro de hidrógeno como se muestra en la Figura 4B, 4C)se pueden añadir al medio en este paso.
   2. Adquisición y análisis de imágenes
      1. Tome fotografías secuencialmente con un microscopio de vídeo en modo campo brillante 24 h después de la inclusión de colágeno.
      2. Utilice Fiji para analizar imágenes de forma manual o semiautomática. Para hacerlo manualmente, dibuje alrededor del núcleo y el área total del esferoide con la herramienta de selección a mano alzada y mida el área invasiva de cada esferoide restando el área total con el área del núcleo. Para analizar las imágenes de forma semiautomática, utilice la macro como se indica en el Documento Suplementario 1 para determinar el área invasiva.
3. Migración
   1. Preparación
      1. Recubrir una placa de 6 pocillos con Matrigel (0,2 mg/ml) en NBM durante 30 min a 37 oC, luego retirar el Matrigel y añadir 2 ml de cNBM.
      2. Transfiera los esferoides a 50 ml de cNBM desde la placa de pozo de fondo redondo a la placa de 6 pocillos.
      3. Incubar la placa a 37 oC y esperar 30 minutos a que se adhieran los esferoides.
      4. Después de 24 h de incubación, mancha con 10 ng/ml de Hoechst e incubar 30 min a 37oC.
   2. Adquisición y análisis de imágenes
      1. Obtenga imágenes utilizando un microscopio de vídeo en Brightfield. Un láser de 405 nm se utiliza para la visualización de la tinción Hoechst.
      2. Utilice el software Fiji para analizar imágenes y ejecutar la macro como se indica en el Documento Complementario 1.
         NOTA: Al tocar la parte inferior del pozo o eliminar completamente el sobrenadante, se dañan los esferoides. Para el manejo del gel de colágeno tipo I, mantener el gel sobre hielo para evitar la polimerización de colágeno, no añadir un componente ácido porque el cambio en el pH afectará a la compacidad del gel, y pipetear las células rápidamente en el colágeno para evitar la muerte celular y la degradación del gel.

3. Fiji Macro

NOTA: Fiji es un programa de análisis de imágenes desarrollado en el dominio público que permite el desarrollo de macros para acelerar el análisis de imágenes. El análisis manual también es posible, pero este es un proceso lento y puede introducir sesgos. Las imágenes se pueden importar arrastrando y soltar en el software y cuantificadas con el plugin ROI Manager Tools. El procedimiento utilizado en este estudio se describe a continuación:

1. Abra la ventana macro: Plugins Macros de la página de macros de la Intérprete interactivo.
2. Copie y pegue el siguiente bucle púrpura adaptado. Conservar las oraciones púrpuras y añadir las oraciones verdes de interés(Documento Suplementario 1).
3. Para analizar toda la serie, ajuste los parámetros en rojo para una cuantificación específica y ejecute la macro utilizando Macros . Ejecute Macro o pulse Ctrl+R.
4. Compruebe y, si es necesario, adapte manualmente la región de interés (ROI).

4. Microscopía electrónica de esferoides

NOTA: La mayoría de los siguientes pasos deben realizarse en una campana química.

1. Paso de fijación
   1. Recoger el esferoide con una punta de pipeta cortada, ponerlo en un tubo de 1,5 ml, y lavar 1x con tampón de fosfato de 0,1 M (PB).
   2. Fijar el esferoide durante la noche a 4 oC en 2% glutaraldehído/2% paraformaldehído (PFA) en 0.1 M PB.
   3. Reemplace la solución de fijación por una solución de 1% de PFA en 0,1 M PB seguida de preparación de muestras.
2. Preparación de muestras
   1. Transfiera los esferoides a un colador y colóquelos en un vaso de precipitados para evitar daños por esferoides.
   2. Lavar con cuidado 3x con 0.1 M PB.
   3. Incubar con osmio durante 2 h en la oscuridad. Diluir el osmio al 4% en 1% 0,1 M PB tampón.
   4. Lavar con cuidado 3x con 0.1 M PB.
      1. Deshidratar de la siguiente manera: remojar en 50% etanol durante 10 min, 70% etanol para 10 min, 2x 90% etanol para 15 min, 2x 100% etanol para 20 min, y 2x acetona durante 30 min.
   5. Incubar las muestras en una mezcla 50/50 de acetona/resina durante 2 h. Durante este paso, prepare la resina EPON (Embed-812: 11.25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).
   6. Deseche la mezcla de acetona/resina, sustitúyala con resina recién preparada e incuba durante la noche.
   7. Sustituya la resina por una nueva e incubar entre 2-6 h.
   8. Añadir los esferoides en resina en un molde a 60oC durante 48-72 h.

Resultados

Los esferoides se prepararon como se describe en la sección de protocolos y se hicieron observaciones con respecto a la migración, invasión, proliferación y microscopía. Para medir la hipoxia en áreas distintas de la estructura esférica, se utilizó la tinción de anhidrasa IX carboxínica para determinar la actividad hipoxica(Figura 1A-C). Se observaron más células CAIX positivas en el centro esferoide(Figura 1<...

Discusión

Los ensayos con esferoides tumorales están bien adaptados para estudiar las características tumorales, incluida la proliferación, la invasión y la migración, así como la muerte celular y la respuesta a las drogas. Las células cancerosas invaden la matriz 3D formando un microtumor invasivo, como se ve en la Figura 4B,C. Durante el proceso invasivo, las matrices de digestión de la matriz de metaloproteinasas (MMP) que rodean las células tumorales¹³

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well round-bottom plate	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm2	Falcon	10497302
Matrigel	Corning	354230	Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103049	Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used to cell counting
Type I Collagen	Corning	354236	Stored at 4 °C