Un modèle sphéroïde 3D pour le Glioblastome

Résumé

Ici, nous décrivons un essai d’invasion facile à utiliser pour le glioblastome. Cet essai convient aux cellules souches du glioblastome. Une macro fidjienne pour faciliter la quantification de l’invasion, de la migration et de la prolifération est également décrite.

Résumé

Les cultures cellulaires bidimensionnelles (2D) n’imitent pas la croissance in vivo de tumeur de manière satisfaisante. Par conséquent, des modèles sphéroïdes de culture tridimensionnels (3D) ont été développés. Ces modèles peuvent être particulièrement importants dans le domaine de la neuro-oncologie. En effet, les tumeurs cérébrales ont tendance à envahir l’environnement sain du cerveau. Nous décrivons ici dans un essai idéal de glioblastoma spheroid-basé que nous avons développé pour étudier l’invasion de tumeur. Nous fournissons tous les détails techniques et les outils analytiques pour effectuer avec succès cet essai.

Introduction

Dans la plupart des études utilisant des lignées cellulaires primaires ou disponibles dans le commerce, des essais sont effectués sur des cellules cultivées sur des surfaces en plastique comme cultures monocouches. La gestion de la culture cellulaire en 2D représente des inconvénients, car elle n’imite pas un environnement cellulaire in vivo 3D. Dans les cultures 2D, toute la surface cellulaire est directement en contact avec le milieu, modifiant la croissance cellulaire et modifiant la disponibilité des médicaments. En outre, la surface plastique non physiologique déclenche la différenciation cellulaire¹. Des modèles de culture tridimensionnels ont été développés pour surmonter ces difficultés. Ils ont l’avantage d’imiter l’architecture multicellulaire et l’hétérogénéité des tumeurs², et pourrait donc être considéré comme un modèle plus pertinent pour les tumeurs solides³. La morphologie complexe des sphéroïdes contribue à mieux évaluer la pénérance et la résistance des médicaments⁴. L’hétérogénéité tumorale dans le sphéroïde a un impact sur la diffusion de l’oxygène et des nutriments, et la réponse aux agents pharmacologiques (figure 1A). La diffusion de l’oxygène est modifiée lorsque la taille du sphéroïde atteint 300 m, induisant un environnement hypoxique au centre du sphéroïde(figure 1A,C). Les métabolites sont également moins pénétrants à travers les couches cellulaires et les réactions métaboliques compensatoires ont lieu⁵. Lorsque le diamètre du sphéroïde augmente, des noyaux nécrotiques peuvent être observés, imitant davantage les caractéristiques trouvées dans de nombreux cancers solides, y compris le glioblastome agressif de cancer du cerveau (GBM)⁶.

Plusieurs essais d’invasion 2D ou 3D pour le glioblastome ont été rapportés dans la littérature^7,8. Les essais bidimensionnels sont principalement pour étudier l’invasion dans un plan horizontal sur une fine couche de matrice ou dans un essai de chambre Boyden⁹. Des essais tridimensionnels ont été décrits avec des cultures sphéroïdes 3D utilisant des lignées cellulaires classiques de glioblastome¹⁰. Des variantes plus complexes sont représentées par l’invasion des organoïdes cérébraux par des sphéroïdes tumoraux dans les cultures de confrontation¹¹. Cependant, il est toujours important de développer un essai facile à utiliser et reproductible à la disposition de n’importe quel laboratoire. Nous avons mis au point un protocole pour générer des cellules souches de glioblastome à partir d’échantillons de patients. La quantification de ces essais est facilement gérable et ne nécessite qu’un logiciel en ligne en libre accès. En bref, les morceaux de tumeur sont coupés en petits morceaux et enzymatiquement digérés. Les cellules simples dérivées de la digestion sont cultivées dans le milieu neurobasal. Après 4-7 jours, les structures sphéroïdes se forment spontanément. Sur l’implantation intracrânienne dans les modèles de souris, ils forment des tumeurs présentant un noyau nécrotique entouré de cellules pseudo-palisading¹². Cela ressemble étroitement aux caractéristiques trouvées dans les patients gbM.

Dans cet article, nous décrivons notre protocole pour produire des sphéroïdes à partir d’un nombre déterminé de cellules pour assurer la reproductibilité. Deux matrices complémentaires peuvent être utilisées à cette fin : le matrigel et le type de collagène I. Matrigel est enrichi en facteurs de croissance et imite la membrane basale mammifère nécessaire à l’attachement et à la migration des cellules. D’autre part, le type de collagène I, un élément structurel du stroma, est la matrice extracellulaire fibrillaire la plus commune et est utilisé dans les essais d’invasion cellulaire. Ici, nous élisons notre modèle de sphéroïde GBM en effectuant des essais de migration et de prolifération. L’analyse a été effectuée non seulement aux points fixes, mais aussi en surveillant l’expansion des sphéroïdes et le mouvement cellulaire par imagerie en direct. En outre, la microscopie électronique a été faite pour visualiser les détails morphologiques.

Protocole

Le consentement écrit éclairé a été obtenu de tous les patients (de l’hôpital Haukeland, Bergen, Norvège selon les règlements des comités d’éthique locaux). Notre protocole suit les lignes directrices du comité d’éthique de la recherche humaine de notre institution.

1. Génération de sphéroïdes de tumeur de taille uniforme

REMARQUE : Les cellules de tige-comme sont cultivées dans le milieu neurobasal complété avec le supplément de B27, l’héparine, FGF-2, la pénicilline, et la streptomycine, comme décrit dans les articles précédents^12. Ces cellules forment spontanément des sphéroïdes dans la culture.

1. Laver les cellules tumorales avec 5 mL phosphate tamponné saline (PBS) et incuber les cellules avec 0,5-1 mL enzyme de dissociation (voir Tableau des matériaux) pendant 5 minutes à 37 oC.
2. Laver avec 4-4,5 ml PBS et ajouter 10 ml du milieu de croissance complète (milieu neurobasal complet, cNBM).
3. Comptez les cellules à l’aide d’une technique de comptage automatique avec du bleu trypan et d’une diapositive de chambre de comptage cellulaire.
4. Pour générer 100 sphéroïdes avec 10⁴ cellules par sphéroïde (selon la taille préférée), mélanger 10⁶ cellules dans 8 ml de NBM avec 2 ml de méthylcellulose de 2 %.
5. Transférer la suspension dans un contenant de système stérile et distribuer 100 L/puits avec une pipette multicanal dans une plaque inférieure ronde de 96 puits.
6. Incuber la plaque à 37 oC, 5% de CO₂ et 95% d’humidité. Des sphéroïdes de taille égale se formeront et peuvent être utilisés après 3-4 jours.

2. Expériences tridimensionnelles

1. Prolifération
   1. Préparation
      1. Suspendre les inhibiteurs (p. ex., la roténone comme dans la figure 4A)et les produits chimiques dans 100 l de milieu et ajouter à la 100 L de milieu dans chaque puits (c.-à-d. un spheroid par puits).
      2. Incuber la plaque à 37 oC, 5% de CO₂, et 95% d’humidité.
   2. Acquisition et analyse d’images
      1. Prenez des photos avec un microscope vidéo dans brightfield pour créer une série de conditions à T₀ et les heures suivantes attendues.
      2. Utilisez Fidji pour analyser les images manuellement ou de manière semi-automatique. Pour ce faire manuellement, dessiner un cercle autour du noyau sphéroïde avec l’outil de sélection à main levée et mesurer la zone de chaque sphéroïde. Pour analyser les images d’une manière semi-automatique, utilisez la macro montrée dans le document supplémentaire 1 avec //Zone centrale seulement.
2. Invasion
   1. Préparation
      1. Préparer la matrice de collagène dans un tube sur glace avec du collagène de type I à 1 mg/mL de concentration finale, 1x PBS,_collagène0,023xV , 1 M d’hydroxyde de sodium, et stérile H₂O. Incubate la solution sur la glace pendant 30 min.
      2. Recueillir des sphéroïdes à partir de la plaque ronde de puits de fond dans des tubes de 500 L et laver 2x avec 200 L 1x PBS.
      3. Pipette les sphéroïdes soigneusement dans 100 L de la matrice de collagène et insérer au centre d’un puits dans la normale 96 plaques de puits.
      4. Incuber le gel de collagène pendant 30 min à 37 oC, puis ajouter le cNBM sur le gel. Les inhibiteurs ou les activateurs (p. ex., le chlorure d’hydrogène comme indiqué dans la figure 4B, 4C)peuvent être ajoutés au milieu à cette étape.
   2. Acquisition et analyse d’images
      1. Prenez des photos séquentiellement avec un microscope vidéo en mode brightfield 24 h après l’inclusion de collagène.
      2. Utilisez Fidji pour analyser les images manuellement ou de manière semi-automatique. Pour ce faire manuellement, dessiner autour du noyau et la zone totale du sphéroïde avec l’outil de sélection à main levée et mesurer la zone invasive de chaque sphéroïde en soustrayant la zone totale avec la surface centrale. Pour analyser les images d’une manière semi-automatique, utilisez la macro comme indiqué dans le document supplémentaire 1 pour déterminer la zone invasive.
3. Migration
   1. Préparation
      1. Enrober une plaque de 6 puits avec du Matrigel (0,2 mg/mL) en NBM pendant 30 min à 37 oC, puis retirer le Matrigel et ajouter 2 ml de cNBM.
      2. Transférer les sphéroïdes dans 50 L de cNBM de la plaque de puits de fond rond à la plaque de 6 puits.
      3. Incuber la plaque à 37 oC et attendre 30 min pour que les sphéroïdes adhèrent.
      4. Après 24 h d’incubation, tache avec 10 ng/mL de Hoechst et incubate 30 min à 37 oC.
   2. Acquisition et analyse d’images
      1. Obtenez des images à l’aide d’un microscope vidéo dans le champ lumineux. Un laser de 405 nm est utilisé pour la visualisation de la coloration Hoechst.
      2. Utilisez le logiciel Fidji pour analyser les images et exécuter la macro comme indiqué dans le document supplémentaire 1.
         REMARQUE : Toucher le fond du puits ou enlever complètement les dommages supernatants les sphéroïdes. Pour la manipulation du gel de type collagène I, conserver le gel sur la glace pour éviter la polymérisation du collagène, n’ajoutez pas un composant acide parce que le changement de pH affectera la compacité du gel, et les cellules de pipette rapidement dans le collagène pour empêcher la mort cellulaire et la dégradation du gel.

3. Macro Fidji

REMARQUE : Fidji est un programme d’analyse d’images développé dans le domaine public qui permet au développement de macros d’accélérer l’analyse d’image. L’analyse manuelle est également possible, mais il s’agit d’un processus lent et peut introduire des biais. Les images peuvent être importées par drag-and-drop dans le logiciel et quantifiées avec le plugin ROI Manager Tools. La procédure utilisée dans cette étude est décrite ci-dessous :

1. Ouvrez la fenêtre macro : Plugins Macros Interprète interactif.
2. Copiez et collez la boucle violette adaptée suivante. Conservez les phrases violettes et ajoutez les phrases vertes d’intérêt(Document supplémentaire 1).
3. Pour analyser l’ensemble de la série, ajustez les paramètres en rouge pour une quantification spécifique et exécutez la macro à l’aide de Macros . Exécuter Macro ou presser Ctrl-R.
4. Vérifier et, si nécessaire, adapter manuellement la région d’intérêt (ROI).

4. Microscopie électronique des sphéroïdes

REMARQUE : La plupart des étapes suivantes doivent être faites dans une hotte chimique.

1. Étape de fixation
   1. Recueillir le sphéroïde avec une pointe de pipette coupée, le mettre dans un tube de 1,5 mL, et laver 1x avec 0,1 M tampon de phosphate (PB).
   2. Fixer le sphéroïde pendant la nuit à 4 oC en glutaraldéhyde de 2% /2% paraformaldéhyde (PFA) en 0,1 M PB.
   3. Remplacez la solution de fixation par une solution de 1% de PFA en 0,1 M PB suivie d’une préparation d’échantillon.
2. Préparation de l’échantillon
   1. Transférer les sphéroïdes dans une passoire et les mettre dans un bécher de verre afin d’éviter les dommages sphéroïdes.
   2. Laver soigneusement 3x avec 0,1 M PB.
   3. Incuber avec de l’osmium pendant 2 h dans l’obscurité. Diluer l’osmium à 4 % dans un tampon de 0,1 M PB de 1 %.
   4. Laver soigneusement 3x avec 0,1 M PB.
      1. Déshydrater comme suit: tremper dans 50% d’éthanol pendant 10 min, 70% d’éthanol pour 10 min, 2x 90% d’éthanol pendant 15 min, 2x 100% d’éthanol pendant 20 min, et 2x acétone pour 30 min.
   5. Incuber les échantillons dans un mélange de 50/50 d’acétone/résine pendant 2 h. Au cours de cette étape, préparer la résine EPON (Embed-812 : 11,25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).
   6. Jeter le mélange d’acétone/résine, remplacer par de la résine fraîchement préparée et incuber toute la nuit.
   7. Remplacer la résine par une nouvelle et incuber entre 2-6 h.
   8. Ajouter les sphéroïdes dans la résine dans un moule à 60 oC pendant 48-72 h.

Résultats

Des sphéroïdes ont été préparés comme décrit dans la section des protocoles et des observations ont été faites concernant la migration, l’invasion, la prolifération et la microscopie. Pour mesurer l’hypoxie dans des zones distinctes de la structure sphérique, la coloration carboxique d’anhydrase IX a été utilisée pour déterminer l’activité hypoxique(figure 1A-C). Plus de cellules CAIX-positives ont été observées dan...

Discussion

Les essais sphéroïdes de tumeur sont bien adaptés pour étudier les caractéristiques de tumeur comprenant la prolifération, l’invasion, et la migration, aussi bien que la mort cellulaire et la réponse de drogue. Les cellules cancéreuses envahissent la matrice 3D formant un microtumor invasif, comme on le voit dans la figure 4B,C. Pendant le processus invasif, les métalloproteinases de matrice (MMP) digèrent les matrices entourant les cellules tumorales

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well round-bottom plate	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm2	Falcon	10497302
Matrigel	Corning	354230	Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103049	Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used to cell counting
Type I Collagen	Corning	354236	Stored at 4 °C