Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

Resumo

Aqui, descrevemos um ensaio de invasão fácil de usar para glioblastoma. Este ensaio é adequado para células-tronco de glioblastoma. Uma macro Fiji para fácil quantificação de invasão, migração e proliferação também é descrita.

Resumo

Culturas celulares bidimensionais (2D) não imitam o crescimento do tumor in vivo de forma satisfatória. Assim, foram desenvolvidos modelos esferóides de cultura tridimensional (3D). Esses modelos podem ser particularmente importantes no campo da neuro-oncologia. De fato, tumores cerebrais têm a tendência de invadir o ambiente cerebral saudável. Descrevemos aqui em um ensaio 3D baseado em glioblastoma baseado em esferóide sheroide que desenvolvemos para estudar a invasão de tumores. Fornecemos todos os detalhes técnicos e ferramentas analíticas para realizar este ensaio com sucesso.

Introdução

Na maioria dos estudos usando linhas celulares primárias ou comercialmente disponíveis, os ensaios são realizados em células cultivadas em superfícies plásticas como culturas de monocamada. Gerenciar a cultura celular em 2D representa desvantagens, pois não imita um ambiente celular in vivo 3D. Em culturas 2D, toda a superfície celular está diretamente em contato com o meio, alterando o crescimento celular e modificando a disponibilidade de medicamentos. Além disso, a superfície plástica não fisiológica desencadeia a diferenciação celular¹. Modelos de cultura tridimensional foram desenvolvidos para superar essas dificuldades. Eles têm a vantagem de imitar a arquitetura multicelular e a heterogeneidade dos tumores², e, portanto, poderiam ser considerados um modelo mais relevante para tumores sólidos³. A morfologia complexa dos esferóides contribui para avaliar melhor a penetração e resistência da droga⁴. A heterogeneidade tumoral no esferóide impacta a difusão de oxigênio e nutrientes, e a resposta aos agentes farmacológicos (Figura 1A). A difusão de oxigênio é alterada quando o tamanho esferoide atinge 300 μm, induzindo um ambiente hipóxico no centro do esferóide(Figura 1A,C). Os metabólitos também são menos penetrantes através das camadas celulares e as reações metabólicas compensatórias ocorrem⁵. Quando o diâmetro do esferóide aumenta, núcleos necrosados podem ser observados, imitando ainda mais características encontradas em muitos cânceres sólidos, incluindo o agressivo glioblastoma de câncer cerebral (GBM)⁶.

Vários ensaios de invasão 2D ou 3D para glioblastoma foram relatados na literatura^7,8. Ensaios bidimensionais são principalmente para estudar a invasão em um plano horizontal em uma fina camada de matriz ou em um ensaio de câmara de Boyden⁹. Ensaios tridimensionais foram descritos com culturas esferóides 3D usando linhas celulares glioblastoma clássicas¹⁰. Variantes mais complexas são representadas pela invasão de organóides cerebrais por esferóides tumorais em culturas de confronto¹¹. No entanto, ainda é importante desenvolver um ensaio fácil de usar e reprodutível disponível para qualquer laboratório. Desenvolvemos um protocolo para gerar células-tronco de glioblastoma a partir de amostras de pacientes. A quantificação desses ensaios é facilmente gerenciável e requer apenas software on-line de acesso aberto. Resumidamente, os pedaços do tumor são cortados em pequenos pedaços e digeridos enzimticamente. As células únicas derivadas da digestão são cultivadas em meio neurobasal. Após 4-7 dias, estruturas esferóides formam-se espontaneamente. Após a implantação intracraniana em modelos de camundongos, formam tumores exibindo um núcleo necrosado cercado por células pseudo-palisading¹². Isso se assemelha muito às características encontradas em pacientes GBM.

Neste artigo, descrevemos nosso protocolo de produção de esferóides a partir de um determinado número de células para garantir a reprodutibilidade. Duas matrizes complementares podem ser utilizadas para este fim: Matrigel e colágeno tipo I. Matrigel é enriquecido em fatores de crescimento e imita a membrana basal mamífera necessária para o apego celular e migração. Por outro lado, o colágeno tipo I, um elemento estrutural do estroma, é a matriz extracelular fibriária mais comum e é usado em ensaios de invasão celular. Aqui, ilustramos nosso modelo esferóide GBM realizando ensaios de migração e proliferação. A análise foi feita não apenas em pontos de tempo fixo, mas também por monitoramento da expansão esferóide e movimento celular por imagem ao vivo. Além disso, a microscopia eletrônica foi feita para visualizar detalhes morfológicos.

Protocolo

O consentimento por escrito informado foi obtido de todos os pacientes (do Hospital Haukeland, Bergen, Noruega, de acordo com as regulamentações do comitê de ética local). Nosso protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana da nossa instituição.

1. Geração de esferóides tumorais de tamanho uniforme

NOTA: As células-tronco são cultivadas em meio neurobasal complementado com suplemento B27, heparina, FGF-2, penicilina e estreptomicina, conforme descrito nos artigos anteriores¹². Essas células formam espontaneamente esferóides na cultura.

1. Lave as células tumorais com soro torário tamponado de 5 mL (PBS) e incubar as células com enzima de dissociação de 0,5-1 mL (ver Tabela de Materiais) por 5 minutos a 37 °C.
2. Lave com PBS de 4-4,5 mL e adicione 10 mL do meio de crescimento completo (meio neurobasal completo, cNBM).
3. Conte as células usando uma técnica de contagem automática com trypan azul e um slide de câmara de contagem de células.
4. Para gerar 100 esferóides com 10⁴ células por esferoide (de acordo com o tamanho preferencial), misture 10⁶ células em 8 mL de NBM com 2 mL de 2% de metilcelulose.
5. Transfira a suspensão para um recipiente de sistema estéril e dispense 100 μL/poço com uma pipeta multicanal em uma placa inferior redonda de 96.
6. Incubar a placa a 37 °C, 5% CO₂ e 95% de umidade. Esferóides de tamanho igual formarão e poderão ser usados após 3-4 dias.

2. Experimentos tridimensionais

1. Proliferação
   1. Preparação
      1. Suspender inibidores (por exemplo, rotenona como na Figura 4A) e produtos químicos em 100 μL de médio e adicionar aos 100 μL de meio em cada poço (ou seja, um esferoide por poço).
      2. Incubar a placa a 37 °C, 5% CO₂e 95% de umidade.
   2. Aquisição e análise de imagens
      1. Tire fotos com um microscópio de vídeo em brightfield para criar uma série de condições em T₀ e os seguintes tempos esperados.
      2. Use Fiji para analisar imagens manualmente ou de forma semiautomatizada. Para fazê-lo manualmente, desenhe um círculo em torno do núcleo esferóide com a ferramenta de seleção à mão livre e meça a área de cada esferóide. Para analisar as imagens de forma semiautomatizada, use a macro mostrada no Documento Complementar 1 apenas com área //Núcleo.
2. Invasão
   1. Preparação
      1. Prepare a matriz de colágeno em um tubo no gelo com colágeno tipo I a 1 mg/mL de concentração final, 1x PBS, 0,023xV_{de colágeno,}1 M de hidróxido de sódio e H₂O. Estéreo Incubar a solução no gelo por 30 min.
      2. Coletar esferóides da placa do poço de fundo redondo em tubos de 500 μL e lavar 2x com 200 μL 1x PBS.
      3. Pipa os esferóides cuidadosamente em 100 μL da matriz de colágeno e inserir no centro de um poço em 96 placas normais de poço.
      4. Incubar o gel de colágeno por 30 min a 37 °C e, em seguida, adicionar cNBM em cima do gel. Inibidores ou ativadores (por exemplo, cloreto de hidrogênio como mostrado na Figura 4B, 4C) podem ser adicionados ao meio nesta etapa.
   2. Aquisição e análise de imagens
      1. Tire fotos sequencialmente com um microscópio de vídeo no modo brightfield 24 h após a inclusão de colágeno.
      2. Use Fiji para analisar imagens manualmente ou de forma semiautomatizada. Para fazê-lo manualmente, desenhe ao redor do núcleo e da área total do esferóide com a ferramenta de seleção à mão livre e meça a área invasiva de cada esferóide subtraia a área total com a área central. Para analisar as imagens de forma semiautomatizada, utilize a macro conforme indicado no Documento Complementar 1 para determinar a área invasiva.
3. Migração
   1. Preparação
      1. Cubra uma placa de 6 poços com Matrigel (0,2 mg/mL) em NBM por 30 min a 37 °C, depois retire o Matrigel e adicione 2 mL de cNBM.
      2. Transfira os esferóides para 50 μL de cNBM da placa do poço de fundo redondo para a placa de 6 poços.
      3. Incubar a placa a 37 °C e esperar 30 min para que os esferóides aderem.
      4. Após 24 h de incubação, manche com 10 ng/mL de Hoechst e incubação de 30 min a 37 °C.
   2. Aquisição e análise de imagens
      1. Obter imagens usando um microscópio de vídeo em brightfield. Um laser de 405 nm é usado para visualização da coloração de Hoechst.
      2. Use o software Fiji para analisar imagens e executar a macro conforme indicado no Documento Complementar 1.
         NOTA: Tocar na parte inferior do poço ou remover completamente o sobrenadante danifica os esferóides. Para o manuseio de gel tipo colágeno I, mantenha o gel no gelo para evitar a polimerização do colágeno, não adicione um componente ácido porque a mudança no pH afetará a compactação do gel, e as células de pipeta rapidamente no colágeno para evitar a morte celular e a degradação do gel.

3. Fiji Macro

NOTA: Fiji é um programa de análise de imagens desenvolvido em domínio público que permite o desenvolvimento de macros para acelerar a análise de imagens. A análise manual também é possível, mas este é um processo lento e pode introduzir vieses. As imagens podem ser importadas por arrastar e soltar no software e quantificadas com o plugin ROI Manager Tools. O procedimento utilizado neste estudo é descrito abaixo:

1. Abra a janela de macro: Plugins | Macros | Intérprete Interativo.
2. Copie e cole o seguinte laço roxo adaptado. Mantenha as frases roxas e adicione as frases verdes de interesse (Documento Complementar 1).
3. Para analisar toda a série, ajuste os parâmetros em vermelho para uma quantificação específica e execute a macro usando Macros | Executar macro ou pressionar Ctrl+R.
4. Verifique e, se necessário, adapte manualmente a região de interesse (ROI).

4. Microscopia eletrônica de esferóides

NOTA: A maioria das etapas a seguir deve ser feita em uma coifa química.

1. Etapa de fixação
   1. Recolhado o esferóide com uma ponta de pipeta cortada, coloque-o em um tubo de 1,5 mL e lave 1x com tampão de fosfato de 0,1 M (PB).
   2. Fixar o esferóide durante a noite a 4 °C em 2% de glutaraldeído/2% de paraformaldeído (PFA) em 0,1 M PB.
   3. Substitua a solução de fixação por uma solução de 1% de PFA em 0,1 M PB seguida de preparação da amostra.
2. Preparação da amostra
   1. Transfira os esferóides para um coador e coloque-os em um copo de vidro, a fim de evitar danos esferóides.
   2. Lave cuidadosamente 3x com 0,1 M PB.
   3. Incubar com ósmio por 2 h no escuro. Diluir o ósmio para 4% em 1% de tampão PB de 0,1 M.
   4. Lave cuidadosamente 3x com 0,1 M PB.
      1. Desidratar da seguinte forma: mergulhe em 50% de etanol por 10 min, 70% de etanol por 10 min, 2x 90% de etanol por 15 min, 2x 100% de etanol por 20 min e 2x de acetona por 30 min.
   5. Incubar as amostras em uma mistura de acetona/resina 50/50 por 2 h. Durante esta etapa, prepare a resina EPON (Embed-812: 11,25 g; DDSA: 9 g; NMA: 4,5 g).
   6. Descarte a mistura acetona/resina, substitua por resina recém-preparada e incuba durante a noite.
   7. Substitua a resina por uma nova e incuba entre 2-6 h.
   8. Adicione os esferóides na resina em um molde a 60 °C por 48-72 h.

Resultados

Os esferóides foram preparados conforme descrito na seção de protocolos e observações foram feitas sobre migração, invasão, proliferação e microscopia. Para medir a hipóxia em áreas distintas da estrutura esférica, utilizou-se a coloração da anidraIX carboxica para determinar a atividade hipóxica(Figura 1A-C). Mais células CAIX positivas foram observadas no centro esferóide (Figura 1A-C<...

Discussão

Os ensaios esferóides tumorais são bem adaptados para estudar características tumorais, incluindo proliferação, invasão e migração, bem como morte celular e resposta a medicamentos. As células cancerígenas invadem a matriz 3D formando um microtumor invasivo, como visto na Figura 4B,C. Durante o processo invasivo, as matrizes de metaloproteinases matriciais (MMP) digerem matrizes ao redor das células tumorais¹³, e os inibidores de MMP (por e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well round-bottom plate	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm2	Falcon	10497302
Matrigel	Corning	354230	Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103049	Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used to cell counting
Type I Collagen	Corning	354236	Stored at 4 °C