מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה

Summary

כאן, אנו מתארים שיטת פלישה קלה לשימוש עבור גלינובלסטומה. שיטת הפעולה הזאת מתאימה לתאים גלנובלסטומה כמו גזע. מאקרו של פיג'י לכימות קל של פלישה, הגירה והתפשטות מתואר גם כן.

Abstract

שתי ממדיות (2D) תרביות תאים לא לחקות את הגידול vivo בסדר משביע רצון. לכן, מודלים תלת ממדיים (3D) תרבות ספרואיד פותחו. מודלים אלה עשויים להיות חשובים במיוחד בתחום של נוירולוגיה-אונקולוגיה. אכן, גידולים במוח יש נטייה לפלוש לסביבת המוח הבריא. אנו מתארים זאת באופן אידיאלי 3d גליובלסטומה המבוססת על מבוססי שפיתחנו לחקור את הפלישה הגידול. אנו מספקים את כל הפרטים הטכניים והכלים האנליטיים כדי לבצע בהצלחה את השיטת העבודה.

Introduction

ברוב המחקרים באמצעות קווי תא ראשי או מסחרית, בחני מבוצעים על תאים שגדלו על משטחי פלסטיק כמו תרבויות דופלקס. ניהול תרבות התא ב-2D מייצג חסרונות, כפי שהוא אינו מחקה בסביבת תא vivo 3D. בתרבויות דו-ממדיות, כל משטח התא הוא ישירות במגע עם המדיום, שינוי צמיחת התאים ושינוי זמינות התרופה. יתר על כן, משטח פלסטיק לא פיזיולוגי מפעיל בידול תא¹. מודלים תלת ממדיים של תרבות פותחו כדי להתגבר על הקשיים הללו. יש להם את היתרון של לחקות את האדריכלות הרב-תאיים ואת טרוגניות של גידולים², ולכן יכול להיחשב למודל רלוונטי יותר עבור גידולים מוצק³. המבנה המורכב של הספרואידים תורם להערכה טובה יותר של חדירה לסמים והתנגדות⁴. הגידול טרוגניות ב ספרואיד משפיע על הדיפוזיה של חמצן וחומרים מזינים, ואת התגובה של סוכני תרופתי (איור 1A). דיפוזיה של חמצן משתנה כאשר גודל ספרואיד מגיע 300 μm, גרימת סביבה ארוי במרכז הספרואיד (איור 1A, C). מטבוליטים הם גם פחות חודר דרך שכבות התא והתגובות מטבולית לפצות להתרחש⁵. כאשר קוטרו של מגדיל ספרואיד, ליבות נקרוטיות ניתן לצפות, עוד מאפיינים לחקות המצויים בסוגי סרטן מוצק רבים, כולל סרטן המוח האגרסיבי גליובלסטומה (GBM)⁶.

מספר הפלישה 2d או 3d שאומר עבור gliנובלסטומה דווחו בספרות^7,8. מימד דו-מימדי הם בעיקר לחקר הפלישה במישור אופקי על שכבת מטריצה דקה או בתוך שיטת הקאמרית Boyden⁹. תלת מימדי בחני שתוארו עם תרבויות תלת-ממד ספרואיד באמצעות קווי התאים הקלאסיים גליובלסטומה¹⁰. גרסאות מורכבות יותר מיוצגים על ידי פלישה של אורגנואידים המוח על ידי spheroids הגידול בתרבויות העימות¹¹. עם זאת, עדיין חשוב לפתח שיטת קל לשימוש ושימוש בלתי זמין לכל מעבדה. פיתחנו פרוטוקול לייצר תאים של גזע גלנובלסטומה מדגימות המטופל. הקוונפיקציה של מספר אלה ניתן לניהול בקלות ודורשת רק תוכנה מקוונת גישה לפתוח. בקצרה, חתיכות הגידול הם חותכים לחתיכות קטנות מתעכל באמצעות אנזימטי. תאים בודדים הנגזרים מהעיכול מעובדים במדיום נוירו-בסיס. לאחר 4-7 ימים, מבנים ספרואיד יוצרים באופן ספונטני. עם השרשה הגולגולתית בדגמי עכברים, הם יוצרים גידולים המציגות ליבה נקרוטיק מוקפת בתאי מדומה-פאליפורם¹². זה דומה מאוד למאפיינים המצויים בחולים GBM.

במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו כדי לייצר spheroids מתוך מספר נחוש של תאים כדי להבטיח התוכסות. ניתן להשתמש בשני מטריצות משלימות למטרה זו: מטריצות וסוג קולגן I. מטריצות מועשר בגורמי גדילה ומחקה את קרום המוח הבזתי הנדרש לתא המצורף והגירה. מצד שני, קולגן סוג אני, אלמנט מבנית של משתית, הוא הנפוץ ביותר fibrillary מטריקס מטריצה והוא משמש הפלישה התא assays. להלן, אנו ממחישים את המודל הספרואיד שלנו על-ידי ביצוע הגירה והפצת מוסר. ניתוח נעשה לא רק בנקודות בזמן קבוע אלא גם על ידי ניטור התרחבות ספרואיד ותנועת התאים על ידי הדמיה חיה. יתר על כן, המיקרוסקופיה אלקטרונית נעשתה כדי להמחיש פרטים מורפולוגיים.

Protocol

הסכמה בכתב מושכלת הושגה מכל המטופלים (מבית החולים האוקלאני, ברגן, נורבגיה על פי תקנות וועדת האתיקה המקומיות). הפרוטוקול שלנו עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של המוסד האנושי.

1. הדור של הגידולים הסרטניים בגודל אחיד

הערה: תאים כמו גזע הם מתורבתים בינונית נוירובסיס משלימה עם תוספת B27, הפארין, FGF-2, פניצילין, ו סטרפטומיצין, כפי שמתואר בסעיפים הקודמים¹². תאים אלה יוצרים באופן ספונטני את הספאידים בתרבות.

1. לשטוף את התאים הסרטניים עם מלוחים 5 מ ל פוספט באגירה (PBS) ו הדגירה של תאים עם 0.5-1 mL האנזים הדיסוציאציה (ראה טבלת חומרים) עבור 5 דקות ב 37 ° c.
2. לשטוף עם 4-4.5 מ"ל PBS ולהוסיף 10 מ ל של הצמיחה המלאה בינונית (מדיום neurobasal סיס מלא, cNBM).
3. ספור את התאים תוך שימוש בטכניקת ספירה אוטומטית עם טרי, כחול ושקופית תא ספירת תאים.
4. כדי ליצור 100 spheroids עם 10⁴ תאים לספרואיד (לפי גודל מועדף), לערבב 10⁶ תאים ב 8 מ ל Nbm עם 2 מ ל של 2% מתילצלולוזה.
5. להעביר את ההשעיה אל מיכל סטרילי מערכת ולוותר 100 μL/ובכן עם פיפטה רב-ערוצית לתוך הלוח 96 בסיבוב התחתון היטב.
6. מודקת את הצלחת ב 37 ° c, 5% CO₂ ו 95% לחות. שוויון בגדלים שווים יהיה ליצור וניתן להשתמש בהם לאחר 3-4 ימים.

2. ניסויים תלת-ממדיים

1. תפשטות
   1. כנה
      1. להשעות מעכבי (למשל, rotenone כמו באיור 4א) וכימיקלים ב 100 μl של בינוני ולהוסיף 100 μl של בינוני בכל טוב (כלומר, אחד ספרואיד לכל טוב).
      2. מודקת את הצלחת ב 37 ° c, 5% CO₂, ו 95% לחות.
   2. רכישת תמונה וניתוח
      1. צלם תמונות עם מיקרוסקופ וידאו ב ברייטפילד כדי ליצור סדרה של תנאים ב-T₀ והמועדים הבאים צפויים.
      2. השתמש בפיג כדי לנתח תמונות באופן ידני או באופן חצי אוטומטי. כדי לעשות זאת באופן ידני, לצייר עיגול סביב הליבה ספרואיד עם הכלי בחירה ביד חופשית ולמדוד את האזור של כל ספרואיד. כדי לנתח את התמונות באופן חצי אוטומטי, השתמש במאקרו המוצג במסמך משלים 1 עם האזור המרכזי בלבד.
2. פלישה
   1. כנה
      1. הכן את מטריצת קולגן בשפופרת על הקרח עם סוג אני קולגן ב 1 מ"ג/mL הריכוז הסופי, 1x PBS, 0.023 החמישה עשר_קולגן, 1 M נתרן הידרוקסיד, ו-H סטרילי₂O. הפתרון על הקרח עבור 30 דקות.
      2. לאסוף spheroids מן התחתון העגול צלחת הבאר ב 500 μL צינורות ולשטוף 2x עם 200 μL 1x PBS.
      3. פיפטה את הספרואידים בקפידה לתוך 100 μL של מטריצת קולגן ולהכניס במרכז באר בצלחות רגילות 96 טוב.
      4. דגירה ג'ל קולגן עבור 30 דקות ב 37 ° צ' ולאחר מכן להוסיף cNBM על גבי ג'ל. מעכבי או מפעילים (למשל, מימן כלוריד כפי שמוצג באיור 4ב, 4c) ניתן להוסיף למדיום בשלב זה.
   2. רכישת תמונה וניתוח
      1. צלם תמונות ברצף עם מיקרוסקופ וידאו במצב ברייטפילד 24 שעות לאחר הכללת קולגן.
      2. השתמש בפיג כדי לנתח תמונות באופן ידני או באופן חצי אוטומטי. כדי לעשות זאת באופן ידני, לצייר סביב הליבה ואת האזור הכולל של הספרואיד עם הכלי בחירה ביד חופשית ולמדוד את האזור פולשני של כל ספרואיד על ידי הפחתה באזור כולל עם אזור הליבה. כדי לנתח את התמונות באופן חצי אוטומטי, השתמש במאקרו כפי שמצוין במסמך המשלים 1 כדי לקבוע את האזור הפולשני.
3. העברה
   1. כנה
      1. מעיל לוחית 6 היטב עם מטריצות (0.2 mg/mL) ב NBM עבור 30 דקות ב 37 ° c, לאחר מכן להסיר את מטריצות ולהוסיף 2 מ ל cNBM.
      2. העברת spheroids לתוך 50 μL של cNBM מצלחת התחתונה העגולה היטב עד 6 צלחת הבאר.
      3. מודקת את הצלחת ב 37 ° צ' ולחכות 30 דקות כדי spheroids לדבוק.
      4. לאחר 24 שעות של דגירה, כתם עם 10 ng/mL של Hoechst ו הדגירה 30 דקות ב 37 ° c.
   2. רכישת תמונה וניתוח
      1. להשיג תמונות באמצעות מיקרוסקופ וידאו ברייטפילד. לייזר 405 ננומטר משמש להדמיה של כתמים מואכסט.
      2. השתמש בתוכנת פיג'י כדי לנתח תמונות ולהפעיל את המאקרו כפי שמצוין במסמך המשלים 1.
         הערה: נגיעה בתחתית הבאר או הסרת לחלוטין את נזקי הסופרנאנט. עבור סוג קולגן אני ג'ל טיפול, לשמור על הג על הקרח כדי למנוע הקולגן פולימור, לא להוסיף רכיב חומצי כי השינוי ב-pH ישפיע על הקומפקטיות של הג, ו פיפטה תאים במהירות לתוך הקולגן כדי למנוע את המוות התאים ואת ההשפלה של ג'ל.

3. מאקרו פיג'י

הערה: פיג'י היא תוכנית ניתוח תמונה שפותחה בתחום הציבורי המאפשר פיתוח של פקודות מאקרו כדי להאיץ את ניתוח התמונה. ניתוח ידני אפשרי גם, אבל זהו תהליך איטי והוא עשוי להציג הטיות. ניתן לייבא תמונות על-ידי גרירה ושחרור בתוכנה וכימות עם תוסף מנהל הכלים של ROI. הנוהל המשמש במחקר זה מתואר להלן:

1. פתח את חלון המאקרו: תוספים | פקודות מאקרו | מתרגם אינטראקטיבי.
2. העתק והדבק את הלולאה הסגולה הבאה שהותאמה. שמור על המשפטים הסגולים והוסף את משפטים הריבית הירוקים (מסמך משלים 1).
3. כדי לנתח את הסידרה כולה, התאימו את הפרמטרים באדום לקוונפיקציה מסוימים והפעל את המאקרו באמצעות פקודות מאקרו | הפעל מאקרו או הקש Ctrl + R.
4. בדוק ובמידת הצורך, התאם ידנית את אזור הריבית (ROI).

4. מיקרוסקופ אלקטרוני של מספרואידים

הערה: יש לבצע את רוב הצעדים הבאים במכסה כימי.

1. שלב קיבוע
   1. לאסוף את הספרואיד עם טיפ חיתוך לחתוך, לשים אותו בצינור 1.5 mL, ולשטוף 1x עם 0.1 M פוספט מאגר (PB).
   2. תקן את הלילה הספרואיד ב -4 ° c ב-2% גלוטרלדהיד/2% פאראפורמלדהיד (בכיוון השני) ב-0.1 M PB.
   3. החליפו את פתרון הקיבעון בתמיסה של 1% בכיוון התנועה ב0.1 M PB ולאחריה הכנה לדוגמה.
2. הכנה לדוגמא
   1. להעביר את הספרואידים לתוך מסננת ולשים אותם בתוך גביע זכוכית כדי למנוע נזק כלאיד.
   2. שטוף בזהירות 3x עם 0.1 M PB.
   3. , מיכל הלילה. דלל את אוסמיום ל 4% ב 1% 0.1 M PB מאגר.
   4. שטוף בזהירות 3x עם 0.1 M PB.
      1. הדמיים כדלקמן: להשרות ב-50% אתנול עבור 10 דקות, 70% אתנול עבור 10 דקות, 2x 90% אתנול עבור 15 דקות, 2x 100% אתנול עבור 20 דקות, ו-2x אצטון עבור 30 דקות.
   5. מודטה את הדגימות בתערובת 50/50 של אצטון/שרף עבור 2 h. במהלך שלב זה, להכין את שרף EPON (להטביע-812:11.25 g; DDSA: 9 גרם; NMA: 4.5 g).
   6. להיפטר אצטון/שרף תערובת, להחליף עם שרף שהוכן טרי, הדגירה הלילה.
   7. החלף את השרף על ידי אחד חדש ו-דגירה בין 2-6 h.
   8. מוסיפים את הספרואידים בשרף לתוך עובש ב 60 ° c עבור 48-72 h.

תוצאות

הספרואידים הוכנו כמתואר בסעיף הפרוטוקולים ותצפיות נעשו לגבי הגירה, פלישה, התפשטות ומיקרוסקופ. כדי למדוד היפוקסיה באזורים שונים של המבנה כדורית, כתמים carboxic התשיעי המשמש לקביעת פעילות ארוי (איור 1א-ג). תאים CAIX-חיוביים נוספים נצפו במרכז ספרואיד (

Discussion

הגידול ספרואיד בחני מותאמים היטב כדי ללמוד מאפייני הגידול כולל התפשטות, פלישה, הגירה, כמו גם מוות תאים ותגובת סמים. תאים סרטניים לפלוש מטריקס 3D ויוצרים גידול פולשני מיקרו, כפי שנראה באיור 4B, C. במהלך התהליך פולשנית, מטריצה מטאלואוטיות (MMP) לעכל מטריצות מסביב תאים סרט...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well round-bottom plate	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm2	Falcon	10497302
Matrigel	Corning	354230	Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103049	Stored at 4 °C
Penicillin - Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used to cell counting
Type I Collagen	Corning	354236	Stored at 4 °C