飞行酒吧研究乙醇诱导的行为抑制和敏感性

摘要

Flypub测定测量果蝇在乙醇影响下表现出的行为。该测定很容易被各级的实验者掌握，并应用于各种蒸发刺激，促进药物滥用和成瘾研究。

摘要

酒精使用障碍（AUD）仍然是我们社会的一个严重问题。为了制定有效的成瘾干预措施，必须了解潜在的神经生物学机制，为此需要不同的实验方法和模型系统。酒精饮料的主要成分是乙醇，它导致中枢神经系统的适应性变化和慢性摄入时的行为。行为敏感性（即反应升级）尤其代表了成瘾背后的一个关键适应性变化。动物模型中大多数由乙醇引起的行为敏感研究都对乙醇的驱动作用进行了研究。乙醇的一个显著作用是行为抑制。然而，对乙醇抑制作用的行为敏感性不足。为了解决这个问题，我们开发了Flypub测定，允许测量在果蝇黑色素气剂中反复接触乙醇后，抑制性求爱活动增加的情况。在这里，我们报告分步 Flypub 检测，包括乙醇暴露室的组装、检测站的设置、苍蝇护理和收集标准、乙醇输送、抑制的求爱活动的量化、数据处理和统计分析。还提供了如何排除关键步骤、克服限制和扩大其效用以评估其他乙醇引起的行为。Flypub测定与果蝇黑色素气仪中强大的遗传工具相结合，将有助于发现乙醇诱导行为敏感性背后的机制。

引言

酒精是世界上最容易获得和广泛消费的药物之一。它具有很高的滥用和成瘾潜力;然而，这一进程背后的机制仍然不完全理解。乙醇诱导抑制、兴奋、认知障碍、多动、失去运动控制和镇水，在蠕虫^1，果蝇^{1,1，2，3，,3}小鼠^4，大鼠⁵和人类^6，表明常见的神经生物学成分调解乙醇的影响，从无脊椎动物到哺乳动物，包括人类。慢性乙醇摄入导致神经适应和行为改变，这是澳元的基础。其中一个适应是行为敏感性定义为增强反应与乙醇^{77，8，98,9}或其他成瘾物质的重复经验10，11，12。^10,11,12

几十年来，关于乙醇诱导行为敏感（EIBS）的研究一直侧重于运动刺激效应，它被用作^{,7、8、9、138}的兴奋反应的代理。^79,13例如，大鼠或小鼠重复（每24，48或72小时）乙醇管理显示增强的locomotor活动，测量步行速度⁸8，14，15，16，17，18，19，20，21。^{,14,15,16,17,18,19,20,21}同样，在第一次接触后4小时接触乙醇蒸气的果蝇，也表现出通过步行速度和²²次测量的增强的locomotor反应。虽然没有关于EIBS对果蝇的瓣动刺激作用的基本机制的信息，但大鼠和小鼠的研究发现了分子和信号成分（例如多巴胺、谷氨酸和GABA系统）以及神经基质和回路（例如，腹腔皮质区、核结积、杏仁核和前额叶皮层），它们对^9,EIB6,起起主要^作用。

抑制是乙醇的主要影响，并导致行为的表现，通常受到限制。抑制作用对运动、情感、社会、性及认知功能施加影响，可能导致人类及动物24、25、26、27、28、29型的不当性行为、言语^{24,25,26,27,28,29}或身体攻击及冲动行为。在动物模型中，对机械学研究进行了乙醇引起的抑制研究，其中包括啮齿动物和猴子的机动冲动和攻击性，以及在蠕虫⁶6、9、24、28、29、30中觅食抑制。^{,9,24,28,29,30}我们已经证明，果蝇在乙醇³¹的影响下表现出抑制性行为。具体来说，野生型雄性苍蝇很少向没有乙醇³¹的其他雄性求情，而当他们这样做时，求向者会积极拒绝讨好雄性。然而，在乙醇的影响下，雄性苍蝇对其他雄性表现出更多的求爱，而讨好者表现出的拒绝较少，导致男性间求爱的整体增强。值得注意的是，苍蝇对反复接触乙醇时抑制作用形成行为敏感性，这是研究EIBS^31，32,32的独特系统。

在本报告中，我们描述了如何设置，执行，故障排除和分析Flypub测定和数据，以研究乙醇引起的抑制和感化在果蝇果蝇果蝇黑色素气。为了提供它的效用和有效性，我们测试了野生型的Canton-S（CS;控制苍蝇应变），以及缺乏酪胺®羟基酶（t_h）的苍蝇，合成八溴胺（OA）。CSOA是无脊椎动物中的主要神经调节剂^{，33、34，,34}在²²号苍蝇中乙醇耐受性的发展中起着关键作用。我们首次在这里报告，OA对EIBS很重要。

研究方案

注:协议部分详细介绍了准备、Flypub 分析和分析步骤，包括 （1） 造型室的组装、（2） 飞行护理和收集、（3） 分析站设置、（4） 乙醇暴露、（5） 求爱评分和数据分析以及 （6） 统计分析。执行 Flypub 分析的关键步骤在工作流中描述（图 1）。

1. 会议厅大会（图2）

1. 使用剃刀刀片在 25 mL 标记处切断圆形果蝇瓶的底部。
2. 使用热焊铁在瓶子的50 mL标记处打一个直径为5毫米的孔。
   注:这是苍蝇被转移到腔室的接入点。
3. 将网片切成直径为 54 mm 的圆圈，以 75 mL 标记放入果蝇瓶中。
4. 使用热胶将网固定在瓶子的 75 mL 标记处。
5. 将聚碳酸酯塑料片切成直径 70 mm 的圆圈。
6. 使用热胶将聚碳酸酯塑料片以 25 mL 标记（步骤 1.1 中的底部开放区域）将聚碳酸酯塑料片连接到瓶子上。
7. 使用重量降低压力，以确保聚碳酸酯圆牢固地连接到底部。
8. 用乙醇清洗酒吧，去除任何气味，并在运行蒸馏水下多次冲洗。用力摇动酒吧，去除多余的水。
9. 在室温下，将酒吧水平地放在纸巾上，使酒吧干燥。

2. 飞行护理和收集

1. 将苍蝇保持在标准的玉米粉/agar/糖/酵母食品介质（https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html）。
2. 在二氧化碳_（CO2）麻醉下，将一至两天大的雄性苍蝇收集成33只代表一个数据点的数据点。确保选择具有完整形态的苍蝇，并将其放入食物小瓶中进行恢复。
   注:每组可容忍两只多飞或少两只苍蝇。行为可能对实验设置敏感，因此可能需要使用控制飞行线调整每个酒吧的总飞行数量。
   注:确保食物小瓶放在一侧，这样麻醉苍蝇就不会粘在食物上。
3. 在乙醇接触前，将苍蝇保持在25°C培养箱中，其相对湿度至少为50%，暗周期为12小时/12小时。
   注:CO₂间隙对于消除任何可能改变乙醇引起的反应的 CO₂引起的生理或行为影响至关重要。
4. 使用代码盲飞基因型或治疗条件的实验者进行乙醇暴露和评分求爱行为。
   注:盲测试有助于消除实验偏差。

3. 建立测定站（图3A）

1. 在通风良好的房间的长凳上设置一个带有连接中心臂的复印支架。
   注: 复制支架不是强制性的。任何提供电平平台的暂存设备都就足够了。
2. 将两只横向手臂夹住支架，每个手臂距离支架中心约 18 厘米。
3. 在支架的每个手臂上放一盏荧光灯，在支架的中间放一盏荧光灯。
4. 将录像机连接到中心臂上，距离底座中心约 38 厘米。这将从顶视图录制酒吧。
5. 用白纸盖住支架底部，帮助可视化深色苍蝇，形成对比度。
6. 在曝光期间，打开荧光灯和连接到复制到复制支架的摄像机的计算机（图 3A）。
   注:光强 2100-2200 lux 为评分提供了良好的记录行为质量。然而，实验室的环境照明条件足以观察乙醇引起的求爱活动。
7. 准备用于图3B所示的乙醇暴露的项目。
8. 收集六个干净、组装好的酒吧进行一组实验，并标记它们的代码 1 到 6。
   注:确保将随机代码放在动态基因型或治疗条件上。

4. 乙醇暴露 （图 3）

1. 使用小漏斗，通过50 mL标记处的孔，轻轻地将一组33名男性转移到Flypub室。
   注:为了尽量减少苍蝇的机械应力，在转移过程中将鼠标垫或任何缓冲材料放在酒吧下方。
2. 用胶带盖住孔。
   注:胶带用于关闭孔，防止苍蝇从酒吧逃出。
3. 将舞台上的酒吧从 1 对齐到 6。
4. 使苍蝇飞到室10分钟（图3D）。
5. 调整摄像机设置，包括对焦、变焦和亮度，并记录最后 5 分钟的适应度，以测量基础求爱水平。
   注:要消除酒吧光线反射产生的眩光，在酒吧底部放置实验室湿巾（通常为 4 层或厚度小于 1 毫米）以调整角度。
6. 准备棉垫乙醇交付，将垫子切成四个相等的象限与干净的剪刀，然后修剪角落，使其适合在适应过程中的培养皿（图3C）。
   注:请勿赤手空拳处理棉垫。使用钳子处理棉垫，以避免任何潜在的气味转移。
7. 在每个培养皿中加入棉垫。
8. 在每个棉垫中加入 1 mL 的 95% 乙醇，确保乙醇溶液均匀分布于垫的整个区域。
9. 用双层实验室湿巾盖住，避免乙醇快速蒸发。
10. 在适应后，将装有乙醇浸湿棉垫和双层实验室的双层实验室擦拭在酒吧底部开口处放置小培养皿。
11. 对齐舞台上的酒吧，开始录制并同时启动计时器。
12. 记录在乙醇接触期间含有苍蝇的酒吧，直到苍蝇因镇化而停止求向或移动。
13. 当超过90%的苍蝇被镇静时，用铲子从每个酒吧取出含有乙醇的培养皿。
14. 轻轻地转移苍蝇回到他们分配的小瓶通过孔在酒吧50mL标记。
    注:在食品小瓶顶部放置一个漏斗，以帮助转移。确保将镇静苍蝇放在食物小瓶的一侧，以防止它们卡在食物中。
15. 用乙醇清洁酒吧，去除任何气味，并在运行蒸馏水下多次冲洗。用力摇动酒吧，去除多余的水。
16. 在室温下，将酒吧水平地放在纸巾上，使酒吧干燥。
17. 将苍蝇保持在25°C培养箱中，相对湿度至少为50%，暗循环为12小时。
18. 连续六天每 24 小时重复步骤 4.1-4.17，并确保在一天中的同一时间进行乙醇暴露，以避免任何昼夜影响。
    注:每2至3天更换一次食物小瓶，以保持苍蝇健康。

5. 求爱评分和数据分析（图4-6）

1. 使用媒体播放器（例如 VLC）打开录制的视频，并缩放视频以清楚地观察苍蝇得分（图 4A）。
2. 将时间代码附加到视频（图4B）。
3. 计算从事求爱活动的男性人数，包括以下、单方面翼延伸、求爱链、求爱圈、腹部弯曲和每10个时间块³¹的安装（图5）。
4. 将每 10 个时间块显示求爱的男性人数输入工作表（图 6A）。
5. 使用连续三个 10 个时间块中求向男性的最大数量作为代表性数据点（图6B）。
6. 计算具有最高值的 10 个连续数据点的平均值（图 6C），这表示每个酒吧的男性间求爱百分比（图 6A）。

6. 统计分析（补充图1）

1. 打开统计分析软件（例如，Minitab 17），并在工作表中添加求爱数据。
   注:可以使用任何统计分析软件。
2. 要确定数据的分布（正态分布或非正态分布），请转到"统计"选项卡，选择"基本统计信息"，然后单击"正态性测试"选项（补充图 1Ai）。
3. 在变量中，选择单个列（每列表示正在研究的基因型或处理的数据集），选择安德森-达林测试，然后单击"确定"（补充图 1Aii）。
   注: 正态概率图将显示计算的 P 值:如果 P 值大于 0.05，则数据是正态分布的。如果 P 值小于 0.05，则数据是非正态分布的（补充图 1Aiii）。
4. 要比较多个组，请通过单击"数据"选项卡、选择堆栈和列（补充图 1Bi）堆叠要比较的列。
5. 在"堆栈列"窗口中，选择要堆叠的数据列，选择在当前工作表的"新建工作表"或"列"中完成的堆叠，下一列指定用于表示下划符（例如，数据组标识;补充图 1Bii-1Biii。
6. 单击"统计"选项卡，选择ANOVA测试，选择"常规线性模型"，然后单击"拟合一般线性模型"（补充图 1Ci）。
7. 在"常规线性模型"窗口中，在"响应"框中选择要比较的列，在"因子"框中选择带有下标的列，然后单击"确定"，从而得出统计分析结果（补充图 1Cii-1Ciii）。
8. 要比较两个组与正常分布的数据，请单击"统计"选项卡，选择基本统计，然后选择 2-样本 t 检验（补充图 1Di）。
9. 在"均值"窗口中的 2-Sample t中，从下拉框中选择每个样本在其自己的列中，在"样本 1"和"样本 2"框中选择要比较的两个组，然后单击"确定"，从而得出统计分析结果（补充图 1Dii-1Diii）。
10. 要将两个组与非正常分布数据进行比较，请转到"Stat"选项卡，选择非参数，然后单击曼-惠特尼（补充图 1Ei）
11. 在Mann-Whitney窗口中，选择"第一个样本"和"第二个样本"框中要比较的两个组，然后单击"确定"，从而得出统计分析结果（补充图 1Eii-1Eiii）。
12. 要比较三组或三组以上非正常分布数据，请转到"Stat"选项卡，选择非参数，然后单击Kruskal-Wallis 测试（补充图 1Fi）。
13. 在Kruskal-Wallis窗口中，在"响应"框中选择要比较的列，选择因子框中带有下标的列，然后单击"确定"，从而得出统计分析结果（补充图 1Fii-1Fiii）。

结果

本节演示了具有代表性的 Flypub 实验的结果。果蝇男性很少讨好其他男性^{35，36。,36}在第一次接触乙醇时，野生型的Canton-S （CS）雄性在不受抑制的雄性求爱方面表现出小而微不足道的增加^31（图7A）。然而，CS男性在随后的乙醇接触中，不受抑制的求爱活动呈上升（ANOVA GLM，CS:R CS ²=0.83，F _（5，66） =65.21，p < 0.0001; pn = 12;图7A，表示对乙醇抑制作用的行为敏感性。我们之前已经表明，这种类型的EIBS需要多巴胺和多巴胺受体多巴胺受体多巴胺在蘑菇神经元^{31，32。31,}

为了确定EIBS中是否涉及额外的神经调节剂，我们通过测试苍蝇（t=h;nM18空位基因^{）37、38,38}缺乏酪胺β羟基酶（OA生物合成中的速率限制酶）来研究OA的作用，从而缺乏OA。tCS遗传背景中的t=h男性（德国莱比锡大学Andreas Thum博士赠送的实物礼物）在每日乙醇接触时表现出敏感地抑制的求爱反应（ANOVA GLM，t=h:Rh ²=0.67，F（5，66）=27.60，p < p 0.0001; _(5,66) tn = 12;图7B）但与CS相比，在较低的水平上CS（ANOVAGLM，相互作用效应:F =2.50，p <0.034）。 p在事后分析中，t=h男性在每次接触时表现出较低的男性间求爱水平，与CS相比，在第四至第六次接触中最为明显（两个样本 t 检验:EXP4 中的p < 0.002，在 EXP5 中，p < 0.004， p < 0.021 在 EXP6 中;n = 12;图7C。这些结果表明，OA在EIBS中可能对乙醇的抑制作用产生影响。更重要的是，这些数据集清楚地证明了Flypub测定在研究乙醇引起的抑制和敏感性的效用和有效性。

图 1:Flypub 测定工作流。工作流图，突出显示执行 Flypub 调查的关键步骤。请点击此处查看此图形的较大版本。

图2:飞酒吧室内材料和装配。（A） 建造 Flypub 室所需的材料包括 （i） 热胶枪胶棒、 （ii） 热胶枪、 （iii） 剃刀刀片、 （iv） 焊接铁、 （v） 标尺 、 （vi） 网形 、 （vii） 聚碳酸酯塑料片 ， 以及 （八） 圆底果蝇瓶.（B） 飞酒吧会议厅组件的示意图表示。请点击此处查看此图形的较大版本。

图3:乙醇暴露。（A） 完全组装的 Flypub 站。（B） 乙醇暴露所需的材料包括 （i） P1000 微移液器、 （ii） 胶带 、 （iii） 棉垫、 （iv） 培养皿 、 （v） 实验室湿巾、 （vi） 小漏斗 、 （vii） 计时器 、 （八） 中型漏斗 、 （ix） 鼠标垫 、 （x） 剪刀 、 （xi） 95% 乙醇 、 （xi） 力和 （ x） 力和 （ xx ） 力和 （x）力（C） 如何切割棉垫的步骤。（D） 舞台上对齐的酒吧的顶视图图像。请点击此处查看此图形的较大版本。

图 4:用于行为评分的视频设置。显示的是分步指南 （A） 如何放大视频和 （B） 如何将时间码文件插入 VLC 媒体播放器进行行为评分。请点击此处查看此图形的较大版本。

图5:男性求爱行为。代表图片说明德罗索菲拉男性求爱行为，包括以下和单方面翼延长（A）求爱歌曲， （B） 求爱链， （C） 求爱圈 （D） 腹部弯曲和 （E） 安装用于行为评分.请点击此处查看此图形的较大版本。

图6:数据输入和分析。（A） 每 10 个时间块中参与求爱的男性人数被转录到工作表中。连续三个 10 个时间块（绿色箭头）的求向男性数量最高，用作具有代表性的数据点。具有最大值的10个连续数据点的平均值（蓝色或橙色括号）表示每个酒吧（橙色括号）的男性间求爱的百分比;最大（平均），黑色箭头*。（B， C）用于计算最大代表性数据点的工作表公式以及每个 pub 10 连续代表数据点的最大平均值。请点击此处查看此图形的较大版本。

图7:乙醇在CS和t=h中诱导行为抑制和敏感h。（A， B）CS和t=h男性表现出敏感求爱抑制与重复乙醇暴露（ANOVA GLM，CS:R R²±0.83， F_（5，66）=65.21，p < 0.0001; t pt=h: R²±0.67， F_（5，66）=27.60， p < 0.0001;n = 12）。（C） 与CS （n=12） 相比，t=h男性表现出的不拘束的求爱较少。后 hoc 分析的p值显示在行上方。从每次接触乙醇时产生的视频中分析了男性间求爱活动。所有数据都报告为均值的均值 = 标准误差。请点击此处查看此图形的较大版本。

补充图1:统计分析。Minitab 17 软件中的步骤是如何执行 （A） 正态性测试， （B） 堆叠数据， （C） 一般线性模型 ANOVA 测试， （D） 双样本 t 测试， （E） 曼-惠特尼测试和 （F） 克鲁斯卡-瓦利斯测试.请点击此处下载此文件。

讨论

在本报告中，我们描述了 Flypub 测定的设置和详细协议;一种新方法，用于测量复发性乙醇暴露如何触发抑制求爱和行为敏感。尽管 Flypub 测定相对简单，但几个步骤需要谨慎和注意，以确保可靠的结果。首先，用于测试的苍蝇必须完全色素（即完全发育的成年苍蝇），健康且完好无损。畸形或损伤，特别是他们的翅膀或腿部会影响男性的法庭能力。其次，飞行年龄很重要，必须在对照组和实验组之间匹配（最佳年龄:乙醇接触1时3-5天）。两周和较老的野生型雄性苍蝇往往表现出抑制不拘一格的求爱水平^31。因此，适当的年龄匹配的苍蝇在研究是必不可少的，以避免可变的结果。第三，每个酒吧的飞行数量至关重要（最佳:每家酒吧33只）。每个酒吧的飞度较低或更高，会大大扭曲求爱分数（未显示数据）。第四，Flypub 室需要具有相同的卷，如图2B所示。这可确保苍蝇同步接收乙醇蒸气，并且诱导的行为是一致的。第五，清晰的视频录制和精确的求爱评分至关重要。此协议很大程度上依赖于行为观察，因此严格遵守标准化求爱评分协议对于最大限度地减少不一致的结果至关重要。最后，强烈建议盲目地执行乙醇暴露和求爱评分步骤，因为实验者不知道苍蝇基因型或实验治疗，从而防止实验偏差。

Flypub 测定具有多种优势。首先，可以同时测试和比较多组苍蝇。其次，它价格低廉，设置简单，易于学习，因此对包括小学到高中、本科生和研究生、博士后和教职员工以及空间与预算有限的教学实验室在内的各级实验者都十分满意。第三，它可以用来测量其他行为，如雌性苍蝇的抑制求爱和乙醇或其他镇静剂的镇静作用，以评估初始敏感性和耐受性发展和维护^{31，32。31,}Flypub 是一种多功能的方法，用于研究 AUD 的不同功能。

Flypub测定的主要限制是严格和费力的求爱评分方案。乙醇影响的求爱行为非常活跃，求爱时间从不到一秒到几分钟不等，而参与求爱的苍蝇也经常发生变化。此处介绍的评分制度是为了结合这种动态性质，并为给定基因型^31、32,32提供单个乙醇暴露的一致分数。如协议所述，求爱活动是手动评分的，这非常耗时。已开发多个自动评分程序，以方便无偏见的高通量行为筛查，所有程序都依赖于个体苍蝇的运动和地点39，40，41，42，43，44，45。^{39,40,41,42,43,44,45}我们还试图开发一种计算机软件，以自动计算求爱活动，但无法获得一致和可靠的结果。这可能是由于行为评分包括多个求爱步骤（即，以下，单边翼延长，腹部弯曲和安装）35，36，46多个^35,36,46苍蝇一次。即使有这种限制，具有适当训练的实验者也应该能够准确量化乙醇引起的求爱行为。尽管如此，采用机器学习或其他高级算法作为后续操作将有很大的帮助和重要性。

与啮齿动物模型类似，对苍蝇模型中乙醇的研究主要集中在乙醇的瓣电机刺激和镇静作用上。然而，Flypub的测定，措施抑制求爱，一种认知抑制，这是新颖^{的31，32。,32}因此，Flypub 可以帮助阐明分子参与者、细胞通路和神经回路，以及对行为抑制和敏感至关重要的风险因素（例如年龄、睡眠、饮食或社会环境）。我们先前已经证明，EIBS需要多巴胺信号，这与啮齿动物模型和人类受试者^{66、9、319,31}的发现一致。作为概念的证明，我们检查了缺乏OA的tβh突变体（去甲肾上腺素的无脊椎动物对应物），发现OA对乙醇抑制作用的行为敏感也很重要，尽管其贡献比多巴胺³¹的贡献相对较小。这一发现与Scholz⁴⁷的观察相反，即t+h突变苍蝇对乙醇的瓣电机激活效应⁴⁷的敏感性没有明显损伤。h这表明独特的分子、细胞和神经通路，以促进行为敏感性，抑制与运动激活。后续研究应该进一步配合这一诱人的概念。

总之，Flypub 是一种低成本、多层面和有效的方法来调查对乙醇的行为反应，特别是抑制和行为敏感性，这有助于增进我们对澳元的理解，并提供对这种慢性疾病有效干预的洞察。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
95 % Ethanol	VWR Chemicals	BDH1158-4LP
Canton-S	-	-	wild-type strain used as a control
Copy stand with arms	Kaiser	205411	model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station
Cotton rounds	Swisspers	COT-027	to deliver ethanol
Excel	Microsoft	-	to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used
Fluorescent light bulb	Lights of America	7108N	maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station
Microsoft LifeCam software	Microsoft	-	version 3.60; to videotape flypubs
Microsoft LifeCam Studio	Microsoft	Q2F-00013	1080P HD sensor; to videotape flypubs
Minitab 17	Minitab	-	version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used
Nylon mesh sheet	Sefar Nitex	-	model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub
Petri dishes	Falcon	08-757-100A	35 x 10 mm; to deliever ethanol
Plastic funnel - mid size	Fisher scientific	10-348A	65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial
Plastic funnel - small	Fisher scientific	07-202-121	4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub
Polycarbonate sheet	Lexan	-	0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub
Round-bottom bottle	Fisher scientific	AS115	polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub
Soldering iron	Weller	WES51	to make a hole in a flypub
Time code	-	-	.smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used
Tyramine β hydroxylase (tβh)	-	-	mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tβh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany)
VLC media player	VideoLAN	-	version 3.0.8; any media player can be used to score courtship