Flypub para estudiar la desinhibición conductual inducida por etanol y la sensibilización

Resumen

El ensayo Flypub mide los comportamientos que la mosca de la fruta Drosophila melanogaster muestra bajo la influencia del etanol. El ensayo puede ser fácilmente dominado por los experimentadores en todos los niveles y aplicado a varios estímulos vaporizados, facilitando el abuso de sustancias y estudios de adicción.

Resumen

El trastorno por consumo de alcohol (AUD) sigue siendo un problema grave en nuestra sociedad. Para desarrollar intervenciones eficaces para la adicción, es importante comprender los mecanismos neurobiológicos subyacentes, para los cuales se necesitan diversos enfoques experimentales y sistemas modelo. El ingrediente principal de las bebidas alcohólicas es el etanol, que causa cambios adaptativos en el sistema nervioso central y el comportamiento tras la ingesta crónica. La sensibilización conductual (es decir, respuestas escaladas) en particular representa un cambio adaptativo clave que subyace a la adicción. La mayoría de los estudios de sensibilización conductual inducidos por etanol en modelos animales se han realizado sobre el efecto activador locomotor del etanol. Un efecto prominente del etanol es la desinhibición conductual. Sin embargo, la sensibilización conductual sobre el efecto de desinhibición del etanol está subrepresentada. Para abordar este problema, desarrollamos el ensayo Flypub que permite medir el aumento progresivo de las actividades de cortejo desinhibido tras la exposición recurrente al etanol en Drosophila melanogaster. Aquí, informamos del ensayo paso a paso Flypub que incluye el montaje de cámaras de exposición al etanol, la configuración de la estación de ensayo, los criterios para el cuidado y la recolección de moscas, la entrega de etanol, la cuantificación de las actividades de cortejo desinhibidas, el procesamiento de datos y el análisis estadístico. También se proporciona cómo solucionar los pasos críticos, superar las limitaciones y ampliar su utilidad para evaluar comportamientos adicionales inducidos por etanol. El ensayo Flypub en combinación con potentes herramientas genéticas en Drosophila melanogaster facilitará la tarea de descubrir el mecanismo subyacente a la sensibilización conductual inducida por etanol.

Introducción

El alcohol es una de las drogas más fácilmente disponibles y ampliamente consumidas en el mundo. Tiene un alto potencial de mal uso y adicción; sin embargo, el mecanismo subyacente a este proceso sigue siendo incompletamente entendido. El etanol induce la desinhibición, la euforia, el deterioro cognitivo, la hiperactividad, la pérdida del control motor y la sedación en los gusanos¹, las moscas de la fruta^1,2,,³, los ratones^4,las ratas⁵ y los seres humanos^6,lo que indica componentes neurobiológicos comunes que median los efectos del etanol de los invertebrados a los mamíferos incluidos los humanos. La ingesta crónica de etanol causa adaptaciones neuronales y modificaciones del comportamiento que subyacen a la AUD. Una de las adaptaciones es la sensibilización conductual definida como la respuesta aumentada con experiencias repetidas de etanol^7,,8,,9 u otras sustancias adictivas^10,,11,12.

A lo largo de las décadas, los estudios sobre la sensibilización conductual inducida por etanol (EIBS) se han centrado en el efecto locomotador-estimulante, que se utiliza como apoderado de una respuesta eufórica^7,8,9,13. Por ejemplo, la administración de etanol repetida (cada 24, 48 o 72 h) muestra la actividad locomotora aumentada medida por la velocidad de marcha^{8,14,15,16,17,18,19,20,21}. Del mismo modo, las moscas de la fruta sometidas a la segunda exposición al vapor de etanol 4 h después de la primera exposición exhiben la respuesta locomotora mejorada medida por la velocidad de marcha también²². Si bien no se dispone de información sobre el mecanismo subyacente al BEI al efecto estimulante de la locomotora en las moscas de la fruta, los estudios en ratas y ratones han descubierto los componentes moleculares y de señalización (por ejemplo, los sistemas de dopamina, glutamato y GABA), así como sustratos neuronales y circuito (por ejemplo, el área tegmental ventral, núcleo accumbens, amígdala y corteza prefrontal) que desempeñan un papel importante para el BEI6^,,,93.⁹

La desinhibición es un efecto importante del etanol y conduce a la manifestación de comportamientos que normalmente están restringidos. El efecto desinhibidor se ejerce sobre las funciones motoras, emocionales, sociales, sexuales y cognitivas, lo que puede conducir a un comportamiento sexual inapropiado, agresión verbal o física y actos impulsivos en humanos y modelos animales^{24,,25,,26,,27,,28,,29.} La desinhibición inducida por etanol se ha investigado en modelos animales para estudios mecánicos e incluyen impulsividad motora y agresión en roedores y monos, así como forrajeo de desinhibición en gusanos^{6,,9,,24,,28,,29,30}. Hemos demostrado que las moscas de la fruta muestran un comportamiento sexual desinhibido bajo la influencia del etanol^31. Específicamente, los machos de tipo salvaje vuelan rara vez cortejan a otros machos sin etanol³¹ y cuando lo hacen, los cortesanos rechazan activamente los cortejos a los machos. Bajo la influencia del etanol, sin embargo, las moscas macho muestran más cortejo hacia otros machos y los cortejos exhiben menos rechazo, lo que resulta en un aumento general en el cortejo de la mucha. En particular, las moscas desarrollan sensibilización conductual sobre el efecto de desinhibición sobre la exposición recurrente al etanol, que sirve como un sistema único para estudiar EIBS^31,,32.

En este informe, describimos cómo configurar, realizar, solucionar problemas y analizar el ensayo y los datos de Flypub para estudiar la desinhibición y sensibilización inducida por etanol en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Para proporcionar su utilidad y eficacia, probamos el canton-S de tipo salvaje(CS;tensión de mosca de control) junto con las moscas deficientes en tiromina - hidroxilasa (t-h) que sintetiza la octopamina (OA). OA es un neuromodulador importante en invertebrados^33,34 y desempeña un papel clave en el desarrollo de la tolerancia al etanol en las moscas^22. Informamos aquí por primera vez que OA es importante para el BEI.

Protocolo

NOTA: La sección de protocolo detalla los pasos preparatorios, de ensayo y análisis flypub que incluyen (1) montaje de la cámara, (2) cuidado y recolección de moscas, (3) configuración de la estación de ensayo, (4) exposición al etanol, (5) puntuación y análisis de datos de cortejo, y (6) análisis estadístico. Los pasos clave para llevar a cabo el ensayo y análisis Flypub se describen en un flujo de trabajo (Figura 1).

1. Montaje de la cámara (Figura 2)

1. Corte la parte inferior de la botella de Drosophila redonda en la marca de 25 ml con una cuchilla de afeitar.
2. Haga un agujero, de 5 mm de diámetro, en la marca de 50 ml de la botella utilizando un soldador en caliente.
   NOTA: Este es el punto de acceso donde las moscas se transferirán a la cámara.
3. Corte una hoja de malla en un círculo, de 54 mm de diámetro, para caber en la botella de Drosophila en la marca de 75 ml.
4. Fije la malla a la marca de 75 ml de la botella con pegamento caliente.
5. Corte la lámina de plástico de policarbonato en un círculo de 70 mm de diámetro.
6. Fije la lámina de plástico de policarbonato a la botella en la marca de 25 ml (área abierta inferior hecha en el paso 1.1) utilizando pegamento caliente.
7. Presione hacia abajo utilizando pesas para asegurar que el cartucho de policarbonato esté firmemente unido a la parte inferior.
8. Lave los pubs con etanol para eliminar los olores y enjuáguelos profusamente varias veces con agua destilada. Agitar los pubs vigorosamente para eliminar el exceso de agua.
9. Seque los pubs poniéndolos horizontalmente sobre toallas de papel a temperatura ambiente.

2. Cuidado de moscas y recolección

1. Mantener las moscas en un medio estándar de harina de maíz/agar/azúcar/comida de levadura (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/harvardfood.html).
2. Recoger moscas macho de uno a dos días de edad en un grupo de 33, que representan un punto de datos, bajo la anestesia de dióxido de carbono (CO₂). Asegúrese de seleccionar las moscas con morfología intacta y ponerlas en un vial de alimentos para recuperarse.
   NOTA: Dos moscas más o tres menos por grupo son tolerables. Los comportamientos pueden ser sensibles a los ajustes experimentales, por lo que es posible que sea necesario ajustar un número de vuelo total por pub con una línea de vuelo de control.
   NOTA: Asegúrese de que el vial de alimentos esté colocado en el lado para que las moscas anestesiadas no se atasquen a la comida.
3. Mantener las moscas en la incubadora de 25oC con al menos 50% de humedad relativa y un ciclo de luz / 12 h de luz / 12 h de oscuridad durante 2 días antes de la exposición al etanol.
   NOTA: El aclaramiento de_CO2 es fundamental para eliminar cualquier efecto fisiológico o conductual inducido por CO₂que pueda alterar las respuestas inducidas por etanol.
4. Utilice códigos para cegar genotipos de mosca o condiciones de tratamiento a los experimentadores que realizan la exposición al etanol y los comportamientos de cortejo de puntuación.
   NOTA: Las pruebas ciegas ayudan a eliminar el sesgo experimental.

3. Estación de ensayo configurada(Figura 3A)

1. Coloca un soporte de copia con un brazo central adjunto en una mesa de sobremesa en una habitación bien ventilada.
   NOTA: El soporte de copia no es obligatorio. Cualquier dispositivo de ensayo que proporcione una plataforma de nivel es suficiente.
2. Sujete los dos brazos laterales al soporte, con cada brazo aproximadamente 18 cm del centro del soporte.
3. Coloque una luz fluorescente en cada brazo del soporte y uno en el medio.
4. Fije la grabadora de vídeo al brazo central, aproximadamente 38 cm por encima del centro de la base. Esto grabará los pubs desde una vista superior.
5. Cubra la base del soporte con papel blanco, lo que ayuda a visualizar las moscas de color oscuro para crear contraste.
6. Durante el día de exposición, encienda las luces fluorescentes y el ordenador conectado a la cámara de vídeo conectada al soporte de copia(Figura 3A).
   NOTA: La intensidad de la luz 2100-2200 lux proporciona una buena calidad de los comportamientos grabados para la puntuación. Sin embargo, las condiciones de iluminación ambiental en el laboratorio son suficientes para observar las actividades de cortejo inducidas por etanol.
7. Prepare los elementos que se utilizarán para la exposición al etanol descritos en la Figura 3B.
8. Reúne seis pubs limpios y ensamblados para un conjunto de experimentos y etiquétalos con el código 1 a 6.
   NOTA: Asegúrese de colocar los códigos aleatorios en genotipos de mosca o condiciones de tratamiento.

4. Exposición al etanol(Figura 3)

1. Transfiera suavemente un grupo de 33 machos a una cámara Flypub a través del agujero en la marca de 50 ml utilizando un pequeño embudo.
   NOTA: Para minimizar el estrés mecánico a las moscas, coloque una almohadilla del ratón o cualquier material de amortiguación debajo del pub durante la transferencia.
2. Cubra el agujero con una cinta.
   NOTA: La cinta se utiliza para cerrar el agujero, evitando que las moscas escapen del pub.
3. Alinee los pubs en el escenario del 1 al 6.
4. Aclimatar las moscas a la cámara durante 10 minutos(Figura 3D).
5. Ajuste los ajustes de la cámara, incluyendo el enfoque, el zoom y el brillo, y registre los últimos 5 minutos de aclimatación para medir un nivel de cortejo basal.
   NOTA: Para eliminar el deslumbramiento generado por la reflexión de luz de un pub, coloque las toallitas de laboratorio (normalmente 4 capas o menos de 1 mm de espesor) en la parte inferior del pub para ajustar el ángulo.
6. Preparar almohadillas de algodón para la entrega de etanol cortando una almohadilla en cuatro cuadrantes iguales con tijeras limpias y luego recortar las esquinas para que encaje en un plato Petri durante la aclimatación(Figura 3C).
   NOTA: No utilice las manos desnudas para manipular las almohadillas de algodón. Use fórceps para manejar las almohadillas de algodón para evitar cualquier posible transferencia de olores.
7. Agregue una almohadilla de algodón en cada plato de Petri.
8. Añadir 1 ml de 95% de etanol a cada almohadilla de algodón, asegúrese de que la solución de etanol se distribuya uniformemente en toda el área de la almohadilla.
9. Cubra con toallitas de laboratorio de doble capa para evitar una rápida evaporación de etanol.
10. Coloque el pequeño plato Petri que contiene la almohadilla de algodón empapada en etanol y las toallitas de laboratorio de doble capa a través de la abertura inferior del pub después de la aclimatación.
11. Alinee los pubs en el escenario, comience a grabar y simultáneamente inicie un temporizador.
12. Registre los pubs que contienen moscas durante la exposición al etanol hasta que las moscas dejen de cortejar o moverse debido a la sedación.
13. Retire el plato Petri que contiene etanol de cada pub con una espátula cuando más del 90% de las moscas estén sedadas.
14. Transfiera suavemente las moscas de vuelta a sus viales asignados a través del agujero en la marca de 50 ml en el pub.
    NOTA: Coloque un embudo encima de los viales de alimentos para ayudar en la transferencia. Asegúrese de colocar moscas sedadas en el lado de los viales de alimentos para evitar que se atasquen en los alimentos.
15. Limpie los pubs con etanol para eliminar los olores y enjuáguelos profusamente varias veces con agua destilada. Agitar los pubs vigorosamente para eliminar el exceso de agua.
16. Seque los pubs poniéndolos horizontalmente sobre toallas de papel a temperatura ambiente.
17. Mantener las moscas en la incubadora de 25oC con al menos 50% de humedad relativa y un ciclo de luz de 12 h / 12 h de oscuridad.
18. Repita los pasos 4.1-4.17 cada 24 h durante seis días consecutivos y asegúrese de llevar a cabo la exposición al etanol a la misma hora del día para evitar cualquier efecto circadiano.
    NOTA: Cambie los viales de alimentos cada 2 – 3 días para mantener moscas sanas.

5. Puntuación de cortejo y análisis de datos(Figura 4-6)

1. Abra los vídeos grabados con un reproductor multimedia (por ejemplo, VLC) y haga zoom en el vídeo para observar claramente las moscas a puntuar(Figura 4A).
2. Adjunte el código de tiempo al vídeo(figura 4B).
3. Contar el número de varones que participan en actividades de cortejo, incluyendo seguimiento, extensión unilateral del ala, cadena de cortejo, círculo de cortejo, flexión abdominal y montaje por cada bloque de tiempo de 10 s³¹ (Figura 5).
4. Ingrese el número de machos que muestran el cortejo por cada bloque de tiempo de 10 s en una hoja de trabajo (Figura 6A).
5. Utilice el número máximo de machos cortejos en los tres bloques de tiempo consecutivos de 10 s como punto de datos representativo(Figura 6B).
6. Calcular el promedio de 10 puntos de datos consecutivos con el valor más alto(Figura 6C) y esto representa el porcentaje de cortejo intermale por pub(Figura 6A).

6. Análisis estadístico (Figura complementaria 1)

1. Abra el software de análisis estadístico (por ejemplo, Minitab 17) y agregue datos de cortejo en la hoja de trabajo.
   NOTA: Se puede utilizar cualquier software de análisis estadístico.
2. Para determinar la distribución de los datos (distribución normal o no normal), vaya a la pestaña Estadísticas, seleccione Estadísticas básicasy haga clic en la opción Prueba de normalidad (Figura suplementaria 1Ai).
3. En Variable, seleccione columnas individuales (cada columna que represente un conjunto de datos de un genotipo o tratamiento en estudio), elija la prueba Anderson-Darling y haga clic en Aceptar (Figura suplementaria 1Aii).
   NOTA: La gráfica de probabilidad de normalidad mostrará el valor P calculado: si el valor P es mayor que 0,05, los datos se distribuyen normalmente. Si el valor P es menor que 0,05, los datos no se distribuyen normalmente(Figura suplementaria 1Aiii).
4. Para comparar varios grupos, apile las columnas que desea comparar haciendo clic en la pestaña Datos, seleccione Pilay, a continuación, Columnas (Figura suplementaria 1Bi).
5. En la ventana Columnas de pila, seleccione las columnas de datos que se van a apilar, seleccione el apilamiento realizado en Nueva hoja de cálculo o Columna de la hoja de cálculo actual con la siguiente columna designada para denotar subíndice (por ejemplo, identidad de grupo de datos; Figura suplementaria 1Bii-1Biii).
6. Haga clic en la ficha Estadísticas, seleccione la prueba ANOVA, seleccione el Modelo Lineal General y, a continuación, haga clic en Ajustar modelo lineal general (Figurasuplementaria Ci).
7. En la ventana Modelo lineal general, seleccione las columnas que desea comparar en el cuadro Respuestas, seleccione la columna con subíndice en el cuadro Factores y haga clic en Aceptar, que conduce a los resultados del análisis estadístico (Figura suplementaria 1Cii-1Ciii).
8. Para comparar dos grupos con datos distribuidos normalmente, haga clic en la pestaña Estadísticas, seleccione Estadísticas básicasy seleccione la prueba t de 2muestras (Figura suplementaria 1Di).
9. En la t de 2 muestras para la ventana Media, seleccione Cada muestra está en su propia columna,en un cuadro desplegable, seleccione los dos grupos que desea comparar en los cuadros Muestra 1 y Muestra 2 y, a continuación, haga clic en Aceptar, lo que conduce a los resultados del análisis estadístico (Figura suplementaria 1Dii-1Diii).
10. Para comparar dos grupos con datos no distribuidos normalmente, vaya a la pestaña Estadísticas, seleccione No paramétrico y haga clic en Mann-Whitney ( Figurasuplementaria 1Ei)
11. En la ventana Mann-Whitney, seleccione los dos grupos que desea comparar en los cuadros Primera muestra y Segunda muestra y, a continuación, haga clic en Aceptar, lo que conduce a los resultados del análisis estadístico(Figura suplementaria 1Eii-1Eiii).
12. Para comparar tres o más grupos de datos no distribuidos normalmente, vaya a la pestaña Estadísticas, seleccione No paramétricoy, a continuación, haga clic en la prueba Kruskal-Wallis ( Figurasuplementaria 1Fi).
13. En la ventana Kruskal-Wallis, seleccione las columnas que desea comparar en el cuadro Respuesta, seleccione la columna con subíndice en el cuadro Factor y haga clic en Aceptar, que conduce a los resultados del análisis estadístico(Figura suplementaria 1Fii-1Fiii).

Resultados

En esta sección se muestran los resultados de un experimento Flypub representativo. Los varones drosófilos rara vez cortejan a otros varones^35,36. Durante la primera exposición al etanol, los machos de tipo silvestre Canton-S (CS) mostraron un pequeño pero insignificante aumento en el cortejo intermale desinhibido³¹ (Figura 7A). Sin embargo, los machos de CS mostraron los aumentos intensificados en la actividad de cortejo desinhibida en exposiciones posteriores al etanol (ANOVA GLM, CS: R²x 0,83, F_(5,66) a 65,21, p < 0,0001; n a 12; Figura 7A), que indica la sensibilización conductual sobre el efecto de desinhibición del etanol. Hemos demostrado previamente que este tipo de EIBS requiere dopamina y el receptor de dopamina DopEcR en las neuronas de setas^31,32.

Para identificar si los neuromoduladores adicionales están involucrados en el SiI, investigamos el papel de la OA probando las moscas (táh; nM18 alelo nulo)^37,38 carentes de tiramina - hidroxilasa, la enzima limitante de la tasa en la biosíntesis DeA, por lo tanto deficiente en OA. Los tmachos en el fondo genético de la CS (un regalo amable del Dr. Andreas Thum, Universidad de Leipzig , Alemania) mostraron la respuesta de cortejo desinhibida sensificada sobre exposiciones diarias de etanol (ANOVA GLM, t-h: R²x 0,67, F_(5,66) a 27,60, p < 0,0001;h n a 12; Figura 7B) pero en el nivel reducido en comparación con CS (ANOVA GLM, efecto de interacción: F 2,50, p <0,034). Tras el análisis post hoc,los machos mostraron niveles más bajos de cortejo en cada exposición que sea más evidente durante la exposición al etanol de cuarta a sexta en comparación con la cS (prueba t de dos muestras: p < 0,002 en EXP4, p < 0,04 en EXP5, p < 0,021 en EXP6; n a 12; Figura 7C). Juntos, estos resultados indican que la OA puede desempeñar un papel en el BEI al efecto de desinhibición del etanol. Más importante aún, estos conjuntos de datos demuestran claramente la utilidad y eficacia del ensayo Flypub en el estudio de la desinhibición y sensibilización inducidas por etanol.

Figura 1: Flujo de trabajo de ensayo Flypub. Un diagrama de flujo de trabajo que resalta los pasos clave para llevar a cabo el ensayo Flypub. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Materiales y montaje de la cámara Flypub. (A) Los materiales necesarios para construir una cámara Flypub incluyen (i) palo de pegamento de pistola de pegamento caliente, (ii) pistola de pegamento caliente, (iii) cuchilla de afeitar, (iv) soldador, (v) regla, (vi) malla, (vii) lámina de plástico de policarbonato, y (viii) botella Drosophila de fondo redondo. (B) Representación esquemática del ensamblaje de la cámara Flypub. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Exposición al etanol. (A) Una estación Flypub completamente montada. (B) Los materiales necesarios para la exposición al etanol incluyen (i) Micropipeta P1000,(ii) cinta, (iii) almohadilla de algodón, (iv) Plato petri, (v) toallitas de laboratorio, (vi) pequeño embudo, (vii) temporizador, (viii) embudo de tamaño medio, (ix) almohadilla de ratón, (x) tijeras, (xi) 95% etanol, (xii) fórceps y (xiii) espátula. (C) Pasos sobre cómo cortar almohadillas de algodón. (D) Imagen de vista superior de los pubs alineados en el escenario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Configuración de vídeo para la puntuación del comportamiento. Se muestra la guía paso a paso en (A) cómo acercar el vídeo y (B) cómo insertar el archivo de código de tiempo en el reproductor multimedia VLC para la puntuación de comportamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Comportamientos de cortejo masculinos. Las imágenes representativas ilustran los comportamientos de cortejo masculino drosofílico, incluyendo el seguimiento y la extensión unilateral del ala para (A) canción de cortejo, (B) cadena de cortejo, (C) círculo de cortejo (D) flexión abdominal y (E) montaje que se utilizan para la puntuación conductual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Entrada y análisis de datos. (A) El número de varones que participan en el cortejo en cada bloque de tiempo de 10 s se transcribe a una hoja de trabajo. El mayor número de varones de cortejo de tres bloques de tiempo consecutivos de 10 s (flecha verde) se utiliza como punto de datos representativo. El promedio de 10 puntos de datos consecutivos (corchete azul o naranja) con el valor máximo representa el porcentaje de cortejo entre hombres por pub [corchete naranja; MAX (promedio), flecha negra]. (B,C) Las fórmulas de hoja de cálculo utilizadas para calcular el punto de datos representativo máximo y el promedio máximo de 10 puntos de datos representativos consecutivos por pub. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Desinhibición conductual inducida por etanol y sensibilización en CS y t-hh. (A,B) Losmachos CS y th mostraron desinhibición de cortejo sensito con exposiciones repetidas de etanol (ANOVA GLM, CS: R²x 0,83, F_(5,66)a 65,21, p < 0,0001; táh: R²a 0,67, F_(5,66)a 27,60, p < 0,0001; n n 12). (C) Losmachos mostraron un cortejo menos desinhibido en comparación con la CS (n-12). Los valores p de los análisis post hoc se muestran por encima de la línea. La actividad de cortejo intermale se analizó a partir de los videos generados para cada exposición al etanol. Todos los datos se notifican como medias de error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Análisis estadístico. Los pasos del software Minitab 17 sobre cómo realizar la prueba (A) Normalidad, (B) apilando los datos, (C) Prueba aNOVA modelo lineal general, (D) Prueba t de dos muestras, (E) Prueba Mann-Whitney y (F) Prueba Kruskal-Wallis. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En este informe, hemos descrito la configuración y el protocolo detallado del ensayo Flypub; un método novedoso para medir cómo la exposición recurrente al etanol desencadena un cortejo desinhibido y la sensibilización conductual. Aunque el ensayo Flypub es relativamente sencillo, varios pasos requieren cuidado y atención para garantizar resultados confiables. En primer lugar, las moscas para la prueba deben estar completamente pigmentadas (es decir, moscas adultas completamente desarrolladas), sanas e intactas. Las deformidades o daños, especialmente en sus alas o piernas, pueden afectar la capacidad del macho para cortejar. En segundo lugar, la edad de vuelo es importante y debe coincidir entre grupos de control y experimentales (edad óptima: 3-5 días de edad a la exposición al etanol 1). Dos semanas y moscas macho de tipo salvaje más viejas tienden a mostrar los niveles elevados de cortejo desinhibido³¹. Por lo tanto, la coincidencia adecuada de la edad de las moscas en estudio es esencial para evitar resultados variables. En tercer lugar, el número de mosca por pub es vital (óptimo: 33 por pub). Los números de mosca inferiores o más altos por pub pueden sesgar en gran medida las puntuaciones de cortejo (datos no mostrados). En cuarto lugar, las cámaras Flypub deben tener volúmenes idénticos como se ilustra en la Figura 2B. Esto garantiza que las moscas reciban vapor de etanol sincrónicamente y que los comportamientos provocados sean consistentes. En quinto lugar, la grabación de vídeo clara y la puntuación precisa del cortejo son esenciales. Este protocolo depende en gran medida de las observaciones del comportamiento, por lo que la observancia meticulosa del protocolo de puntuación de cortejo estandarizado es fundamental para minimizar los resultados inconsistentes. Por último, se recomienda encarecidamente que tanto la exposición al etanol como los pasos de puntuación del cortejo se realicen a ciegas, cuando un experimentador no sea consciente de los genotipos de la mosca o de los tratamientos experimentales, evitando así el sesgo experimental.

El ensayo Flypub tiene múltiples ventajas. En primer lugar, múltiples grupos de moscas pueden ser probados y comparados simultáneamente. En segundo lugar, es barato, fácil de configurar y fácil de aprender, por lo que es muy agradable para los experimentadores en todos los niveles, incluyendo primaria a través de la escuela secundaria, estudiantes de pregrado y posgrado, postdoctorados y profesores, así como la enseñanza de laboratorios con espacio limitado y presupuestos. En tercer lugar, se puede utilizar para medir comportamientos adicionales como el cortejo desinhibido de las moscas hembras y el efecto sedante del etanol u otros sedantes para evaluar la sensibilidad inicial y el desarrollo y mantenimiento de tolerancia^31,,32. Juntos, el Flypub es un método versátil para estudiar diversas características de AUD.

La principal limitación del ensayo Flypub es el riguroso y laborioso régimen de puntuación de cortejo. El comportamiento del cortejo bajo la influencia del etanol es muy dinámico de una manera que la duración del cortejo oscila entre menos de un segundo a muchos minutos y las moscas involucradas en el cortejo cambian con bastante frecuencia. El régimen de puntuación presentado aquí fue desarrollado para incorporar esta naturaleza dinámica y proporcionar puntuaciones consistentes en exposiciones individuales de etanol para un genotipo^{dado 31,32}. Como se indica en el protocolo, la actividad de cortejo se puntúa manualmente, lo que consume mucho tiempo. Se han desarrollado varios programas automatizados de puntuación para facilitar el cribado conductual de alto rendimiento imparcial y todos los cuales dependen de los movimientos y ubicaciones individuales de las moscas^{39,,40,,41,,42,,43,,44,,45}. También intentamos desarrollar un software informático para contar automáticamente la actividad del noviazgo, pero no pudimos obtener resultados consistentes y confiables. Esto podría deberse al hecho de que la puntuación conductual incluye múltiples pasos de cortejo (es decir, seguimiento, extensión unilateral del ala, flexión abdominal y montaje)^35,36,,46 de múltiples moscas a la vez. Incluso con esta limitación, un experimentador con una formación adecuada debe ser capaz de cuantificar los comportamientos de cortejo inducidos por etanol con consistencia y precisión. Sin embargo, sería de gran ayuda e importancia adoptar el aprendizaje automático u otros algoritmos avanzados como seguimiento.

Al igual que los modelos de roedores, los estudios sobre el etanol en el modelo de mosca se han centrado en gran medida en los efectos estimulantes y sedantes locomotores del etanol. El ensayo Flypub, sin embargo, mide el cortejo desinhibido, un tipo de desinhibición cognitiva que es novedoso^31,32. Por lo tanto, el Flypub puede ayudar a dilucidar los jugadores moleculares, vías celulares y circuitos neuronales, así como los factores de riesgo (por ejemplo, edad, sueño, dieta o entorno social) críticos para la desinhibición conductual y la sensibilización. Hemos demostrado previamente que la señalización de dopamina es necesaria para el BEI, que está en línea con los hallazgos en modelos de roedores y sujetos humanos^6,9,31. También como prueba de concepto, examinamos elmutante que carecía de OA (la contraparte invertebrada de la noradrenalina) y encontramos que la OA también es importante para la sensibilización conductual sobre el efecto de desinhibición del etanol, aunque su contribución es relativamente pequeña en comparación con la de la dopamina^31. Este hallazgo contrasta con la observación de Scholz⁴⁷ de que lasmoscasmutantes no presentan impedimentos evidentes en la sensibilización al efecto activador locomotor del etanol⁴⁷. Esto sugiere distintas vías moleculares, celulares y neuronales que median la sensibilización conductual a la desinhibición frente a la activación locomotora. Los estudios de seguimiento deberían seguir colaborando en esta noción tentadora.

En resumen, el Flypub es un método de bajo costo, multifacético y eficaz para investigar las respuestas conductuales al etanol, particularmente la desinhibición y la sensibilización conductual, que puede ayudar a avanzar en nuestra comprensión de la AUD y proporcionar una visión de las intervenciones efectivas para este trastorno crónico.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
95 % Ethanol	VWR Chemicals	BDH1158-4LP
Canton-S	-	-	wild-type strain used as a control
Copy stand with arms	Kaiser	205411	model RS 2-XA, with one central arm and two lateral arms; to set up a flypub station
Cotton rounds	Swisspers	COT-027	to deliver ethanol
Excel	Microsoft	-	to analyze data; any worksheet or spreadsheet software can be used
Fluorescent light bulb	Lights of America	7108N	maximum (120 V-70 W Max.); to illuminate the flypub station
Microsoft LifeCam software	Microsoft	-	version 3.60; to videotape flypubs
Microsoft LifeCam Studio	Microsoft	Q2F-00013	1080P HD sensor; to videotape flypubs
Minitab 17	Minitab	-	version 17; to conduct statistical analysis; any statistical analysis software can be used
Nylon mesh sheet	Sefar Nitex	-	model B0043D1TVY, opaque white, 200 microns mesh; to make a flypub
Petri dishes	Falcon	08-757-100A	35 x 10 mm; to deliever ethanol
Plastic funnel - mid size	Fisher scientific	10-348A	65 mm diameter and 67 mm height; to transfer sedated flies from a flypub into a food vial
Plastic funnel - small	Fisher scientific	07-202-121	4 mm diameter and 46 mm height; to transfer flies from a vial into a flypub
Polycarbonate sheet	Lexan	-	0.762 mm thickness, clear, 610 x 1220 mm Nominal; to make a flypub
Round-bottom bottle	Fisher scientific	AS115	polypropylene, 103 mm height, 60 mm diameter and 177 ml capacity; to make a flypub
Soldering iron	Weller	WES51	to make a hole in a flypub
Time code	-	-	.smi file, a subtitle ticking timecode created in Han lab; to monitor time during courtship scoring; any time subtitles may be used
Tyramine b hydroxylase (tbh)	-	-	mutant fly strain (nM18 null allele)deficient in tbh in the wild-type Canton-S background ; obtained from Dr. Andreas Thum (University of Leipzig, Leipzeig, Germany)
VLC media player	VideoLAN	-	version 3.0.8; any media player can be used to score courtship